CLL a www.ericll.cz

Od roku 2005 se naše pracoviště zabývá vyšetřením mutačního statusu u pacientů s diagnózou chronické lymfocytární leukémie (CLL). Principem tohoto vyšetření je zjištění, ve kterém stadiu diferenciace došlo ke vzniku nádorového klonu, zda vznikl z naivního B-lymfocytu nebo z paměťové B-buňky. Mutační status vyjadřuje míru sekvenční homologie s naivním B-lymfocytem, pokud je mutační odchylka nižší než 98 %, jedná se o dobrou prognózu, pokud je homologie vyšší nebo rovna 98 % jedná se o nepříznivou prognózu. Vyšetření provádíme z RNA, izolované z kostní dřeně i periferní krve, přítomnost klonu ověřujeme pomocí fragmentační analýzy, alelově-specifické PCR a sekvenace. Pro vyhodnocení používáme internetovou databázi IMGT/V-Quest i IgBlast. Do této doby jsme vyšetřili kolem 80 pacientů. Ve 12 případech nebyl klon B-lymfocytů detekován (polyklonalita, zaléčení pacienti, pacienti na začátku onemocnění), u 4 případů byla prokázána biklonalita a u 67 případů byla prokázána monoklonalita. Až na jeden případ jsme tedy dokázali bez problémů vyhodnotit mutační status podle všech daných pravidel. Pana J. vyšetřujeme od prosince 2004, kdy k nám přišel s diagnózou suspektní CLL, v té době jsme ještě vyšetření mutačního statusu nenabízeli. Bylo tedy provedeno cytogenetické vyšetření a vyšetření metodou FISH. Byl nalezen 25% klon se zlomem v lokusu IgH a 25% klon s delecí ATM. Pacient byl zaléčen. Další náběr kostní dřeně byl proveden v listopadu 2006, metodou FISH byla prokázána přítomnost klonu s delecí p53 (10 %) a delecí Rb1 (10 %), z důvodu zaléčení se nepodařilo molekulární vyšetření mutačního statusu. Byla provedena fragmentační analýza a pacient se jevil jako polyklonální, ovšem už v této době byla na pozadí jiných reaktivních klonů patrná převaha klonu z rodiny IGHV3. Požádali jsme o nový náběr pacienta. Další vyšetření mutačního statusu bylo provedeno z periferní krve v březnu roku 2007 s jednoznačným výsledkem: IgVH 3–11*01; 99,3% homologie, klon byl ale neproduktivní. Ačkoli na pozici 114 byl přítomen Cystein (motiv C-A-K), na pozici 118 nebyl Tryptofan ani Fenylalanin, ale Arginin (nebyl tedy splněn motiv W-G-X-G). Přítomnost ostatních konzervativních kódonů byla zachována: FR1 pozice 23 –⁠ Cys, FR2 pozice 41 –⁠ Trp, FR3 pozice 114 –⁠ Cys. Po konzultaci s hematologem, který s jistotou diagnostikoval CLL, jsme požádali o nový náběr s odstupem několika měsíců. Další vyšetření pacienta jsme provedli v červenci 2007 se stejným výsledkem jako v březnu 2007, oba klony byly sekvenčně totožné (IGHV 3-11; mutační status 99,3 %; neproduktivní klon). Výsledek 99,3 % poukazoval na nepříznivou prognózu. Klon opět neměl na pozici 118 Tryptofan či Fenylalanin, ale Arginin. Databáze IMGT/V Quest jej přesto vyhodnotila jako produktivní. Jak tedy zodpovědně podat zprávu o pacientovi? Cílem tohoto příspěvku je upozornění na existenci evropské výzkumné iniciativy pro CLL-ERIC (European Research Initiative on CLL) a jejich internetových stránek www.ericll.org. Zde můžeme najít jednak odkaz na doporučení postupu při vyhodnocení mutačního statusu CLL-Leukemia (2007) 21, 1-3, které na českých stránkách věnovaných CLL –⁠ www.CLL.cz zcela chybí. Je zde také možnost konzultace nejasných případů na mezinárodní úrovni. Jsou zde vzorové sekvence, na nichž si můžete otestovat, zda je vaše vyhodnocení správné. O radu jsme nakonec požádali tuto evropskou skupinu. Asi za týden přišel výsledek. Byl potvrzen klon IgVH3-1*01/IgDH5-5*01/IgJH5*02, liší se od zárodečné sekvence ve dvou bázích a jeho mutační status je skutečně 99,3% (254/256). Klon byl uznán jako produktivní. Záměna adeninu (AGG –⁠ Arg) za tymin (TGG –⁠ Trp) na pozici 118 nezpůsobila vznik stop kódonu ani neporušila čtecí rámec a přeskupení V-D-J mohlo být dokončeno produktivně. Funkční důsledek záměny Trp jinou aminokyselinou na pozici 118 ještě není molekulárně objasněn, vyskytuje se u CLL buněk i u „non-CLL“ buněk. Několik takovýchto případů bylo již přijato do veřejné databáze od různých skupin.