APEX-nový přístup v molekulárně genetické diagnostice Wilsonovy choroby


Autoři: L. Gojová;  E. Jansová;  S. Pouchlá;  I. Blaháková;  L. Fajkusová
Působiště autorů: Centrum molekulární biologie a genové terapie FN, Brno
Vyšlo v časopise: Čas. Lék. čes. 2008; 147: 172-173
Kategorie: Sjezdy

Wilsonova choroba (WD) je závažné autozomálně recesivní dědičné onemocnění s incidencí 1:30 000 (70 000) vyznačující se nadměrným ukládáním mědi v organismu. Příčinou poruchy metabolismu mědi jsou mutace v genu ATP7B kódujícího měď-transportující ATPázu, která se fyziologicky účastní inkorporace mědi do ceruloplazminu a jejího vylučování do žluči.

Do současnosti bylo popsáno již cca 300 mutací v ATP7B genu, většina etnicky specifických. V současné době je molekulárně genetická diagnostika Wilsonovy choroby založena na detekci v populaci nejčastějších mutací restrikčním štěpením a sekvenováním všech 21 exonů ATP7B genu.

S cílem urychlit tento klasický přístup byla na našem pracovišti zavedena nová vyhledávací metoda na bázi oligonukleotidových microarrays. Tato metoda využívá APEX (arrayed primer extension) reakci k detekci mutací v hetero/homozygotním stavu. Kódující oblast ATP7B genu je nejprve amplifikována ve 4 multiplex PCR a následně fragmentována. Následně dochází k hybridizaci analyzovaných fragmentů genu na specificky navržené oligonukleotidové sondy imobilizované na čipu. Současně je do reakce přidána polymeráza a fluorescenčně značené ddNTPs a probíhá APEX reakce, při které je každá oligonukleotidová sonda na čipu prodloužena právě o jeden fluorescenčně značený terminátor (v místě mutace/polymorfismu) komplementárně dle sekvence nahybridizovaných fragmentů. Po nasnímání fluorescence a určení typu navázaného ddNTP je možné detekovat heterozygotní či homozygotní stav daných mutací.

V naší laboratoři byl ve spolupráci s firmou Asper Biotech Ltd. vyvinut genotypovací čip tzv. „Wilsonův čip“ umožňující souběžné stanovení 87 mutací a 17 polymorfismů v ATP7B genu.

Spolehlivost čipu správně detekovat dané mutace/polymorfismy byla ověřena ve dvou fázích. Nejdříve byl testován soubor 97 WD pacientů již s předem známým genotypem. Celkově bylo určeno 44 mutací a 15 polymorfismů reprezentujících nejčastější mutace vyskytující se v české a slovenské populaci. Zbylé mutace/polymorfismy (45) byly otestovány pomocí vzorků uměle připravených mutagenezí. Všechny sekvenční varianty byly detekovány se 100% správností. Wilsonův čip by tak mohl v budoucnu představovat vhodný nástroj pro rychlejší a levnější screening mutací v ATP7B genu u pacientů s Wilsonovou chorobou.

Grantová podpora: IGA NR 8451-3/2005, MSMT LC06023).


Štítky
Adiktologie Alergologie a imunologie Angiologie Audiologie a foniatrie Biochemie Dermatologie Dětská gastroenterologie Dětská chirurgie Dětská kardiologie Dětská neurologie Dětská otorinolaryngologie Dětská psychiatrie Dětská revmatologie Diabetologie Farmacie Chirurgie cévní Algeziologie Dentální hygienistka
Článek CytoChip

Článek vyšel v časopise

Časopis lékařů českých


Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Příběh jedlé sody
nový kurz
Autoři: MUDr. Ladislav Korábek, CSc., MBA

Krvácení v důsledku portální hypertenze při jaterní cirhóze – od pohledu záchranné služby až po závěrečný hepato-gastroenterologický pohled
Autoři: PhDr. Petr Jaššo, MBA, MUDr. Hynek Fiala, Ph.D., prof. MUDr. Radan Brůha, CSc., MUDr. Tomáš Fejfar, Ph.D., MUDr. David Astapenko, Ph.D., prof. MUDr. Vladimír Černý, Ph.D.

Rozšíření možností lokální terapie atopické dermatitidy v ordinaci praktického lékaře či alergologa
Autoři: MUDr. Nina Benáková, Ph.D.

Léčba bolesti v ordinaci praktického lékaře
Autoři: MUDr. PhDr. Zdeňka Nováková, Ph.D.

Revmatoidní artritida: včas a k cíli
Autoři: MUDr. Heřman Mann

Všechny kurzy
Kurzy Soutěž Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se