APEX-nový přístup v molekulárně genetické diagnostice Wilsonovy choroby


Autoři: L. Gojová;  E. Jansová;  S. Pouchlá;  I. Blaháková;  L. Fajkusová
Působiště autorů: Centrum molekulární biologie a genové terapie FN, Brno
Vyšlo v časopise: Čas. Lék. čes. 2008; 147: 172-173
Kategorie: Sjezdy

Wilsonova choroba (WD) je závažné autozomálně recesivní dědičné onemocnění s incidencí 1:30 000 (70 000) vyznačující se nadměrným ukládáním mědi v organismu. Příčinou poruchy metabolismu mědi jsou mutace v genu ATP7B kódujícího měď-transportující ATPázu, která se fyziologicky účastní inkorporace mědi do ceruloplazminu a jejího vylučování do žluči.

Do současnosti bylo popsáno již cca 300 mutací v ATP7B genu, většina etnicky specifických. V současné době je molekulárně genetická diagnostika Wilsonovy choroby založena na detekci v populaci nejčastějších mutací restrikčním štěpením a sekvenováním všech 21 exonů ATP7B genu.

S cílem urychlit tento klasický přístup byla na našem pracovišti zavedena nová vyhledávací metoda na bázi oligonukleotidových microarrays. Tato metoda využívá APEX (arrayed primer extension) reakci k detekci mutací v hetero/homozygotním stavu. Kódující oblast ATP7B genu je nejprve amplifikována ve 4 multiplex PCR a následně fragmentována. Následně dochází k hybridizaci analyzovaných fragmentů genu na specificky navržené oligonukleotidové sondy imobilizované na čipu. Současně je do reakce přidána polymeráza a fluorescenčně značené ddNTPs a probíhá APEX reakce, při které je každá oligonukleotidová sonda na čipu prodloužena právě o jeden fluorescenčně značený terminátor (v místě mutace/polymorfismu) komplementárně dle sekvence nahybridizovaných fragmentů. Po nasnímání fluorescence a určení typu navázaného ddNTP je možné detekovat heterozygotní či homozygotní stav daných mutací.

V naší laboratoři byl ve spolupráci s firmou Asper Biotech Ltd. vyvinut genotypovací čip tzv. „Wilsonův čip“ umožňující souběžné stanovení 87 mutací a 17 polymorfismů v ATP7B genu.

Spolehlivost čipu správně detekovat dané mutace/polymorfismy byla ověřena ve dvou fázích. Nejdříve byl testován soubor 97 WD pacientů již s předem známým genotypem. Celkově bylo určeno 44 mutací a 15 polymorfismů reprezentujících nejčastější mutace vyskytující se v české a slovenské populaci. Zbylé mutace/polymorfismy (45) byly otestovány pomocí vzorků uměle připravených mutagenezí. Všechny sekvenční varianty byly detekovány se 100% správností. Wilsonův čip by tak mohl v budoucnu představovat vhodný nástroj pro rychlejší a levnější screening mutací v ATP7B genu u pacientů s Wilsonovou chorobou.

Grantová podpora: IGA NR 8451-3/2005, MSMT LC06023).


Štítky
Adiktologie Alergologie a imunologie Angiologie Audiologie a foniatrie Biochemie Dermatologie Dětská gastroenterologie Dětská chirurgie Dětská kardiologie Dětská neurologie Dětská otorinolaryngologie Dětská psychiatrie Dětská revmatologie Diabetologie Farmacie Chirurgie cévní Algeziologie Dentální hygienistka
Článek CytoChip

Článek vyšel v časopise

Časopis lékařů českých


Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Výhody léčby pacientů s DM 2. typu GLP-1 agonisty
nový kurz
Autoři: prof. MUDr. Martin Haluzík, DrSc.

Syndrom suchého oka – diagnostika, komplikace a léčba
Autoři: MUDr. Petr Výborný, CSc., FEBO

Systémová léčba psoriázy
Autoři: MUDr. Jiří Horažďovský, Ph.D

Klinická farmakokinetika betablokátorů
Autoři:

Současné možnosti terapie osteoartrózy
Autoři: MUDr. Jakub Holešovský

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se

VIRTUÁLNÍ ČEKÁRNA ČR Jste praktický lékař nebo pediatr? Zapojte se! Jste praktik nebo pediatr? Zapojte se!

×