Analýza mikroRNA u epiteliálního karcinomu vaječníku


MicroRNA Analysis in Epithelial Ovarian Cancer

Background:
Ovarian carcinoma is a type of cancer with high mortality, which is often diagnosed in late stages indicating the necessity to identify new non-invasive biomarkers for detection this malignancy in early stages of the disease. MicroRNAs (miRNAs) seem to be one of the potential possibilities. MiRNAs are small noncoding RNA molecules, which regulate gene expression and are involved in many cellular processes including carcinogenesis.

Patients and Methods:
Total RNA was isolated from sera of nine ovarian cancer patients treated at Masaryk Memorial Cancer Institute. As a control samples, we used sera from six cancer-free women. Purified RNA was subjected to reverse transcription followed by cDNA preamplification. MiRNA expression was determined using TaqMan MicroRNA Assays. For statistical analysis was used nonparametric Mann-Whitney U test.

Results:
MiRNAs miR-30a-5p and miR-26b were identified as significantly overexpressed miRNAs in sera from ovarian cancer patients. Other miRNAs showing elevated level were identified as miR-628-5p, 520c-3p, miR-486 and let-7b. On the other hand, miR-596 showed reduced levels in sera from ovarian cancer patients.

Conclusion:
A significantly different level of at least two miRNAs (miR-30a-5p a miR-26b) has been observed in cancer patients in comparison with healthy individuals. These miRNAs would serve as a powerful non-invasive diagnostic tool to detect ovarian epithelial cancer in so called liquid biopsies.

Key words:
microRNA – biomarkers – ovarian epithelial cancer – qPCR

This work was supported by MEYS – NPS I – LO1413.

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

Submitted:
13. 3. 2017

Accepted:
26. 3. 2017


Autoři: L. Sommerová;  H. Ďuríková;  J. Podhorec;  R. Hrstka
Působiště autorů: RECAMO, Masarykův onkologický ústav, Brno
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2017; 30(Supplementum1): 180-183
Kategorie: Článek ve sborníku

Souhrn

Východiska:
Karcinom vaječníku je nádorové onemocnění s vysokou mortalitou, které bývá diagnostikováno v pozdních stadch, což potvrzuje nutnost identifikace nových neinvazivních biomarkerů umožňujících detekci onemocnění v raném stadiu. Jednou z potenclních možností se ukazují být mikroRNA (miRNA). MiRNA jsou malé nekódující molekuly RNA regulující genovou expresi a podílející se na mnohých buněčných procesech vč. karcinogeneze.

Soubor pacientů a metody:
Celková RNA byla izolována ze sér devíti žen s diagnostikovaným karcinomem vaječníku, které byly léčeny na Masarykově onkologickém ústavu. Jako kontrolní vzorky sloužila séra šesti žen bez prokazatelného onkologického onemocnění. Získaná RNA byla pomocí reverzní transkriptázy přepsána do cDNA, která byla podrobena preamplifikaci. Exprese miRNA byla stanovena pomocí TaqMan MikroRNA testů. Ke statistické analýze byl použit neparametrický Mann-Whitneyův U test.

Výsledky:
Hladiny miRNA miR-30a-5p a miR-26b byly identifikovány jako statisticky významně zvýšené v séru pacientek s karcinomem vaječníku. Další miRNA vykazující zřetelně zvýšenou hladinu byly miR-628-5p, 520c-3p, miR-486 a let-7b. Naopak miR-596 vykazovala výrazně sníženou hladinu v séru pacientek s karcinomem vaječníku.

Závěr:
Byla prokázána signifikantně odlišná exprese nejméně dvou miRNA (miR-30a-5p a miR-26b) v sérech pacientek s karcinomem vaječníku v porovnání se séry odebranými od zdravých žen. Tyto miRNA by mohly být v budoucnu využity jako účinný diagnostický nástroj k detekci přítomnosti karcinomu vaječníku právě v rámci odběru tzv. tekutých biops.

Klíčová slova:
mikroRNA – biomarkery – epitellní karcinom vaječníku – qPCR

Úvod

Rakovina vaječníku je gynekologickou malignitou, která se řadí mezi jednu z nejčastějších příčin úmrtí mezi ženami na celém světě. V ČR vykazuje epitellní ovarlní karcinom v rámci gynekologických zhoubných nádorů nejvyšší mortalitu. Navzdory nemalému pokroku v chirurgických technikách a terapeutických strategch mají pacientky s diagnostikovanými nádory vaječníku stále nepříznivou prognózou s výrazně nižším 5letým přežitím v porovnání s jinými nádorovými onemocněními [1]. Vysoká mortalita je spojená především s nedostatečnými diagnostickými markery umožňujícími včasnou diagnostiku v raných asymptomatických stadch onemocnění. Nemoc je tudíž diagnostikována v pozdějších fázích, kdy již mají pacientky objektivní potíže, což je spojeno se zhoršenou prognózou onemocnění a mnohem obtížnější léčbou.

MikroRNA (miRNA) jsou malé, 18–25 nukleotidů dlouhé nekódující RNA, které regulují mRNA na posttranskripční úrovni. Obvykle se váží na 3’UTR úsek cílově mRNA, čímž obvykle dochází buď k degradaci cílové mRNA nebo k inhibici iniciace translace [2–4]. Neustále narůstající množství dat monitorujících expresi miRNA potvrzuje jejich nezastupitelnou úlohu v různých biologických procesech jako je buněčný růst, proliferace, diferenciace, migrace a invazivita nádorových buněk [5]. Proto možnosti klinického využití miRNA představují značně atraktivní oblast výzkumu v celosvětovém měřítku.

V této studii byly analyzovány hladiny miRNA v sérech pacientek, u kterých byl diagnostikován epitellní karcinom vaječníku. Na základě komparativní analýzy s hladinami miRNA v sérech pocházejících od žen bez prokázané onkologické diagnózy byly vybrány miRNA, které by mohly v budoucnu nalézt uplatnění právě při diagnostice epitellního karcinomu vaječníku.

Materl a metody

Pacientky a vzorky

Vzorky sér byly získané od pacientek, které byly léčeny v Masarykově onkologickém ústavu (MOÚ) z důvodu diagnostikovaného epitellního karcinomu vaječníku v letech 2006–2010 (tab. 1). Ze stejného období také pochází i kontrolní vzorky, které byly získány v rámci krevních odběrů při preventivných kontrolách zaměstnankyň, které jsou v MOÚ periodicky prováděny. Projekt byl schválen Etickou komisí MOÚ v Brně. Podepsaný informovaný souhlas byl získán od všech žen, jejichž vzorky sér byly zařazeny do studie.

Tab. 1. Charakteristika klinických vzorků.
Charakteristika klinických vzorků.

Izolace miRNA a její kvantifikace

MiRNA byla izolována z krevního séra pomocí TaqMAN miRNA ABC Purification kitu dle instrukcí výrobce (Applied Biosystems). Po purifikaci miRNA byla stanovena její čistota a koncentrace, poté následoval přepis do cDNA pomocí kitu TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit a následovala preamplifikace pomocí Taq-Man PreAmp Master Mix. Kvantitativná PCR v rlním čase byla provedena na ABI Prism 7900 systému s využitím mikrofluidních karet Human miRNA Arrays. Komparativní analýza exprese miRNA pocházející ze sér pacientek s karcinomem vaječníku v porovnání se zdravými kontrolami byla provedena pomocí neparametrického Mann-Whitneyova U testu.

Výsledky a diskuze

Byla stanovena exprese miRNA v sérech devíti pacientek s diagnostikovaným karcinomem vaječníku. Získané hodnoty hladin miRNA byly normalizované vůči hsa-miR-550 sloužící jako referenční gen.

Statisticky významnou vyšší hladinu ve vzorcích séra s diagnostikovaným karcinomem vaječníku vykazovaly miR-30a-5p a miR-26b (obr. 1). Spolu s těmito dvěma miRNA byla dále pozorována zvýšená exprese miR-628-5p, miR-520c-3p, miR-486, miR-16, let-7b a miR-132 u pacientek s karcinomem vaječníku ve srovnání se zdravými kontrolami, avšak statisticky nevýznamně. Tyto miRNA lze kromě let-7b obecně označit jako onkogenní. Naopak miR-596, která byla výrazně snížena ve vzorcích sér pocházejících od pacientek s karcinomem vaječníku v porovnání se zdravými kontrolami, patří mezi miRNA s tumor supresorovými vlastnostmi. Tato její funkce již byla prokázána u karcinomu ústní dutiny [6], avšak doposud nebyla prokázána souvislost mezi změněnou expresí miR-596 a karcinomem vaječníku.

Porovnání hladin exprese miR-30-5p (A) a miR-26b (B) mezi séry pacientek s karcinomem vaječníku (OC) a séry zdravých žen (kontrola).
Obr. 1. Porovnání hladin exprese miR-30-5p (A) a miR-26b (B) mezi séry pacientek s karcinomem vaječníku (OC) a séry zdravých žen (kontrola).

Celosvětově vůbec první analýza zaměřená na stanovení hladin miRNA ve vzorcích pocházejících z karcinomu ovaria byla provedena v roce 2007 [7]. V této studii byla identifikována rodina miR-200, která je tvořena pěti různými miRNA, které mohou vykazovat jak onkogenní, tak i tumor supresorové vlastnosti. Další významnou skupinou miRNA s deregulovanou hladinou u karcinomů ovar je rodina let-7, jejímž hlavním cílem je gen HMGA2 [8], který se uplatňuje při modulaci chromatinu a přispívá tak k regulaci transkripce. Jeho zvýšená hladina byla opakovaně prokázána u serózních karcinomů vaječníku a to jak v raných, tak i pozdějších stadch [8]. Skutečnost, že v naší práci pozorujeme zvýšenou hladinu let-7b naznačuje, že zřejmě došlo k aktivaci této tumor supresorové dráhy, nicméně exprese genu HMGA2 nebyla stanovena.

Změny v hladinách exprese miR-30a-5p byly detekovány v souvislosti s rezistencí k cisplatině u ovarlních buněčných lin [9]. Následující studie pak ukázala, že hladina miR-30a-5p je signifikantně zvýšená u buněčných lin, které vykazují rezistenci k chemoterapii. Spolu s tím zvýšená exprese této miRNA přispívala nejen k rychlejšímu růstu tumoru, ale i ke schopnosti migrovat a k invazivitě [10].

Abnormální exprese miR-26b byla popsána u řady nádorových onemocnění. Dále bylo zjištěno, že c-Myc, klasický onkogen, suprimuje expresi miR-26b u různých tumorů [11]. Na druhou stranu, zvýšená exprese miR-26b byla popsána u high-grade gliomů, kde bylo rovněž prokázáno, že 3’UTR mRNA nádorového supresoru PTEN je cílovým místem pro miR-26b. V případě karcinomu vaječníku existují v odborné literatuře stran miR-26 rovněž rozporuplné údaje [12,13].

Naše pilotní studie identifikovala miR-30a-5p a miR-26b jako potenclní markery karcinomu vaječníku, avšak je třeba si uvědomit, že vyšetřovaným materlem bylo pouze sérum pacientek, kde hladiny miRNA nemusí plně korelovat s expresí miRNA v nádorové tkáni vaječníku. Naopak, v případě analýzy exprese miRNA v krevním séru lze předpokládat systémový obrázek v kontextu celého organizmu, kde se mohou aberantně exprimovat nejrůznější miRNA vč. miRNA reflektujících nádorové onemocnění a jejichž identifikace a validace by mohla v budoucnu sloužit především k diagnostickým účelům.

Práce byla podpořena grantem MŠMT – NPU I – LO1413.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Lucia Sommerová

RECAMO

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: lucia.sommerova@mou.cz

Obdrženo: 13. 3. 2017

Přijato: 26. 3. 2017


Zdroje

1. Trivers KF, Stewart SL, Peipins L et al. Expanding the public health research agenda for ovarian cancer. J Womens Health (Larchmt) 2009; 18 (9): 1299–1305. doi: 10.1089/jwh.2009.1622.

2. Ahmad J, Hasnain SE, Siddiqui MA et al. MicroRNA in carcinogenesis & cancer diagnostics: a new paradigm. Indian J Med Res 2013; 137 (4): 680–694.

3. Matoulkova E, Michalova E, Vojtesek B et al. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol 2012; 9 (5): 563–576. doi: 10.4161/rna.20231.

4. Michalova E, Vojtesek B, Hrstka R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int J Mol Sci 2013; 14 (8): 15681–15694. doi: 10.3390/ijms140815681.

5. Kloosterman WP, Plasterk RH. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Dev Cell 2006; 11 (4): 441–450.

6. Endo H, Muramatsu T, Furuta M et al. Potential of tumor-suppressive miR-596 targeting LGALS3BP as a therapeutic agent in oral cancer. Carcinogenesis 2013; 34 (3): 560–569. doi: 10.1093/carcin/bgs376.

7. Iorio MV, Visone R, Di Leva G et al. MicroRNA signatures in human ovarian cancer. Cancer Res 2007; 67 (18): 8699–8707.

8. Wu J, Wei JJ. HMGA2 and high-grade serous ovarian carcinoma. J Mol Med (Berl) 2013; 91 (10): 1155–1165. doi: 10.1007/s00109-013-1055-8.

9. Han X, Zhen S, Ye Z et al. A feedback loop between miR-30a/c-5p and DNMT1 mediates cisplatin resistance in ovarian cancer cells. Cell Physiol Biochem 2017; 41 (3): 973–986. doi: 10.1159/000460 618.

10. Liu J, Wu X, Liu H et al. Expression of microRNA-30a-5p in drug-resistant and drug-sensitive ovarian cancer cell lines. Oncol Lett 2016; 12 (3): 2065–2070.

11. Sander S, Bullinger L, Wirth T. Repressing the repressor: a new mode of MYC action in lymphomagenesis. Cell Cycle 2009; 8 (4): 556–559.

12. Lin J, Zhang L, Huang H et al. MiR-26b/KPNA2 axis inhibits epithelial ovarian carcinoma proliferation and metastasis through downregulating OCT4. Oncotarget 2015; 6 (27): 23793–23806.

13. Zhang L, Volinia S, Bonome T et al. Genomic and epigenetic alterations deregulate microRNA expression in human epithelial ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105 (19): 7004–7009. doi: 10.1073/pnas.0801615 105.

Štítky
Dětská onkologie Chirurgie všeobecná Onkologie

Článek vyšel v časopise

Klinická onkologie

Číslo Supplementum1

2017 Číslo Supplementum1

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Minimonografie - vědomostní test
nový kurz

Léčba karcinomu močového měchýře
Autoři:

Imunitní trombocytopenie (ITP)
Autoři: prof. MUDr. Tomáš Kozák, Ph.D., MBA

Léčba bolesti v ordinaci praktického lékaře
Autoři: MUDr. PhDr. Zdeňka Nováková, Ph.D.

Prediabetes
Autoři:

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se