Sekvenování dlouhých nekódujících RNA v exozomech u pacientů s kolorektálním karcinomem

Souhrn

Východiska: Prognóza pacientů s karcinomem kolorekta (colorectal cancer – CRC) závisí především na rozsahu onemocnění v době dia­gnózy, proto je brzký záchyt jedním z hlavních předpokladů úspěšné léčby. Současný výzkum ukazuje, že exozomální dlouhé nekódující RNA (lncRNA) jsou spojeny s rozvojem nádorových onemocnění. Jelikož jsou lncRNA často tkáňově specifické, jejich kvantifikace v exozomech se nabízí jako neinvazivní metoda pro včasnou detekci CRC. V naší práci jsme se zaměřili na optimalizaci protokolu pro analýzu exozomálních lncRNA z krevního séra pacientů s CRC jako potenciálních dia­gnostických bio­markerů. Materiál a metody: Exozomy byly izolovány pomocí gelové chromatografie ze 150 μl séra pacientů s CRC a zdravých dárců. Jejich kvalita a kvantita byla potvrzena elektronovou mikroskopií a analýzou dynamického rozptylu světla (dynamic light scattering – DLS) a proteinové markery byly detekovány metodou Western blot. Po izolaci RNA byly ze vzorků připraveny cDNA knihovny, které byly sekvenovány pomocí NextSeq 550. Výsledky: Úspěšně jsme izolovali exozomy a ověřili jsme jejich vlastnosti několika různými metodami. Knihovny byly připraveny ze všech vzorků i přes velmi nízký objem výchozího materiálu. Sekvenační data potvrzují přítomnost protein kódující (50 %) i nekódující RNA, kterou tvoří především lncRNA (28,2 %), pseudogeny (15,2 %) a další typy RNA (6,5 %). Výsledky dále ukázaly významně změněné hladiny ně­kte­rých lncRNA, na základě jejichž exprese bylo možné odlišit vzorky od pacientů s CRC od vzorků zdravých kontrol. Pomocí analýzy obohacení genové sady (gene set enrichment analysis – GSEA) jsme pozorovali významně obohacené třídy genů, které souvisejí s opravami DNA nebo regulací buněčného cyklu. Závěr: Naše pilotní data naznačují, že lncRNA představují významnou část RNA přítomné v exozomech a jejich rozdílné hladiny mají schopnost odlišit CRC pacienty od zdravých kontrol. Analýza obohacených genů zároveň prokázala významné zastoupení lncRNA podílejících se na regulaci buněčného cyklu a oprav DNA, což naznačuje jejich možné zapojení do procesů kancerogeneze. Výsledky je však třeba ověřit na větším souboru pacientů.

Klíčová slova:

kolorektální nádory – exozomy – nádorové bio­markery – RNA dlouhá nekódující – stanovení celkové genové exprese

Úvod

Kolorektální karcinom (CRC) tvoří dle odhadů 10 % všech zjištěných karcinomů u mužů a žen a celosvětově představuje druhou nejčastější příčinu úmrtí na nádorové onemocnění [1]. Navzdory lepším přístupům v detekci a léčbě se značný počet pacientů s CRC potýká s nepříznivou prognózou, která do značné míry závisí na rozsahu onemocnění v době dia­gnózy. Jelikož CRC se často vyvíjí prostřednictvím postupné progrese od adenomu ke karcinomu, včasná dia­gnostika a resekce prekancerózní tkáně by vedla ke zlepšení pacientovy prognózy. V této souvislosti mají vysokou prioritu neinvazivní bio­markery, které mohou poskytnout spolehlivou a včasnou detekci CRC.

V posledních letech se exozomy objevily jako potenciální rezervoáry klinicky užitečných bio­markerů, které se vyskytují ve všech tělních tekutinách. Tyto membránové váčky vznikají v rámci endozomálního systému, mají velikost 30–150 nm a jsou vylučovány různými typy buněk, vč. nádorových. Exozomy přenášejí informace v podobě nukleových kyselin, proteinů a lipidů a podílejí se na místní i vzdálené mezibuněčné komunikaci [2]. V rozvoji nádorů hrají významnou roli tím, že přepravují onkogeny cílovým buňkám, regulují interakce mezi nádorem a jeho mikroprostředím, podporují vznik metastáz a rozvoj angiogeneze [3]. Vzhledem k rostoucímu počtu studií, které prokázaly, že obsah exozomů odráží bio­logický stav buněk a že jsou produkovány nádorovými buňkami, lze těchto vlastností využít k detekci RNA bio­markerů, kterými mohou být např. exozomální dlouhé nekódující RNA (lncRNA).

Tato skupina nekódujících RNA se vyznačuje transkripty o délce nejméně 200 nukleotidů, které nejsou překládány do proteinu [4]. Doposud bylo identifikováno více než třicet onkogenních lncRNA zapojených do klíčových signálních drah souvisejících s molekulární patogenezí CRC a očekává se, že jejich počet bude narůstat [5]. Jednou z popsaných exozomálních lncRNA je např. CRNDE-h, jejíž zvýšené hladiny u pacientů s CRC významně korelovaly s nepříznivou prognózou, metastázováním do lymfatických uzlin i přítomností vzdálených metastáz [6]. Jelikož jsou lncRNA často tkáňově specifické a mohou sloužit jako signální molekuly v mezibuněčné komunikaci, jejich kvantifikace v exozomech se nabízí jako neinvazivní metoda pro včasnou detekci CRC [4,7]. V naší práci jsme se zaměřili na analýzu exozomálních lncRNA jako potenciálních bio­markerů pro časnou dia­gnostiku onemocnění.

Materiál a metody

Exozomy byly izolovány ze 150 μl krevního séra pacientů s CRC (n = 31) a zdravých kontrol (n = 15) metodou vylučovací chromatografie (qEVsingle, IZON). Tab. 1 charakterizuje kohortu pacientů s CRC. Vzorky od pacientů před chirurgickým zákrokem byly odebrány podle standardního odběrového protokolu Masarykova onkologického ústavu (MOÚ), stejně jako vzorky od zdravých kontrol odebírané v rámci preventivní onkologické prohlídky. Všechny vzorky byly zpracovány stejným způsobem a byly uloženy v Bance bio­logického materiálu MOÚ. Všichni účastníci studie podepsali informovaný souhlas schválený etickou komisí Masarykovy univerzity. Velikost a koncentrace exozomů byly potvrzeny elektronovou mikroskopií a analýzou dynamického rozptylu světla (dynamic light scattering – DLS). Metodou Western blot byly detekovány charakteristické proteinové markery, které jsou asociovány s extracelulární membránou nebo jsou cytosolického původu. Před extrakcí RNA (Monarch Total RNA Miniprep Kit) byly vzorky exozomů ošetřeny proteinázou K, RNázou a následně inhibitorem RNázy. Po izolaci RNA byly ze vzorků připraveny knihovny cDNA pomocí komerčního kitu (NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit, NEB), které byly následně sekvenovány za použití chemie NextSeq 500/ 550 High Output Kit v2.5 (75 cyklů) v módu single-read na sekvenátoru  NextSeq 550 (obojí Illumina). Bioinformatická analýza získaných dat zahrnovala vyhodnocení rozdílné genové exprese, které bylo provedeno v programu R s použitím balíčku DESeq2, a zároveň analýzu funkčního obohacení. Genová ontologie (GO) významně deregulovaných genů byla zkoumána analýzou nadměrného zastoupení pomocí R balíčku ClusterProfiler a analýza obohacení genové sady (gene set enrichment analysis – GSEA) byla realizována v R balíčku fGSEA s použitím referenčních sad genů Hallmark (MsigDB).

Výsledky

Úspěšně jsme optimalizovali a standardizovali protokol pro izolaci exozomálních RNA z velmi malého množství vstupního materiálu s následnou bio­informatickou analýzou sekvenačních dat. Získaná data potvrzují přítomnost protein kódujících a nekódujících RNA v exozomech krevního séra. Nejpočetnější skupinu identifikovaných genů tvořily protein kódující RNA (50 %), druhou nejvíce zastoupenou třídou byly lncRNA (28,2 %), dále pak pseudogeny (15,2 %) a jiné typy RNA (6,5 %). Analýza odhalila 85 významně deregulovaných lncRNA (adjustovaná p-hodnota < 0,05; násobná změna > 1,5), z nichž 21 vykazovalo sníženou a 64 zvýšenou expresi ve vzorcích od pacientů s CRC v porovnání se zdravými kontrolami. V tab. 2 je uvedeno 10 nejvýznamnějších lncRNA s mírou exprese větší než 30 kopií. Pro získání nejvýznamnějších tříd funkčně příbuzných genů byly provedeny dva typy analýz obohacení. GO analýza identifikovala geny kódující proteiny, které jsou nadměrně zastoupeny v bio­logických procesech, a GSEA ukázala nejvýznamněji obohacené či ochuzené mRNA sady. Pomocí GSEA jsme pozorovali významně obohacené třídy genů, které souvisejí s opravami DNA nebo s molekulárními cíli signální dráhy MYC (adjustovaná p-hodnota < 0,05). Nadměrně zastoupené bio­logické procesy souvisejí se zvýšenou frekvencí transkripce či vývojem endokrinního systému (p-hodnota < 0,001).

Diskuze

LncRNA jsou stále častěji považovány za kritické regulátory mnoha buněčných funkcí. Ve střevní tkáni modulují několik signálních drah, které jsou klíčové pro udržení její homeostázy. Naopak jejich deregulace u nádorových onemocnění může tyto signální kaskády změnit a umožnit maligním buňkám proliferaci a šíření [4]. Expresním profilováním  lncRNA lze identifikovat potenciální cíle, které mohou sloužit pro včasnou detekci onemocnění. Sekvenování exozomální RNA navíc nabízí možnost vývoje bio­markerů získaných neinvazivním způsobem z krevního séra nebo plazmy.

V naší studii nám optimalizace protokolu umožnila úspěšnou izolaci exozomů a přípravu cDNA knihoven ze všech vzorků, a to i přes velmi nízký objem výchozího materiálu. S využitím vysokokapacitního expresního profilování RNA byly odhaleny významně změněné hladiny lncRNA ve vzorcích pacientů s CRC v porovnání se zdravými kontrolami a dále byly identifikovány nádorově specifické lncRNA, které ještě nebyly v souvislosti s CRC popsány. Je zajímavé, že zvýšená exprese detekované lncRNA NALT1 byla v minulosti asociována s rozvojem karcinomu žaludku a vznikem metastáz [8]. Provedené analýzy GSEA a GO navíc podpořily významnost našich zjištění v kontextu CRC.

Závěr

Naše předběžná data naznačují, že exozomální lncRNA mají schopnost odlišit pacienty s CRC od zdravých kontrol, a mohly by tak v budoucnu sloužit jako slibné neinvazivní bio­markery pro včasný záchyt tohoto onemocnění. Výsledky je však třeba ověřit pomocí nezávislé metody na větším souboru pacientů a kontrol. Biologická role vybraných lncRNA v patogenezi CRC bude dále ověřena funkčními in vitro a in vivo experimenty.

prof. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D.
CEITEC – Středoevropský technologický
institut
Kamenice 753/5
625 00 Brno
e-mail: oslaby@med.muni.cz
Obdrženo/Submitted: 15. 7. 2022
Přijato/Accepted: 7. 9. 2022