Acyklické nukleosidfosfonáty jako potenciální antineoplastika


Acyclic Nucleoside Phosphonates as Potential Antineoplastic Agents

Recently, Gilead Sciences (Foster City, CA, USA) presented a potential cytostatic drug GS-9219. It is a novel lipophilic prodrug of cyprPMEDAP, in vivo releasing the active compound PMEG in a two-step process. GS-9219 has shown a substantial therapeutic potential in treatment of spontaneous non-Hodgkin’s lymphoma in dogs and its utilization in the human medicine is prospective. Hence, cyprPMEDAP represents a key intermediate in the intracellular activation of GS-9219. Both acyclic nucleoside phosphonates PMEG and cyprPMEDAP, serving as the basis for development of GS-9219, were discovered and their mechanism of action was investigated in detail at the Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic. The biological studies using the rat lymphoma were carried out at the First Faculty of Medicine, Charles University.

Key words:
PMEG, GS-9219, non-Hodgkin lymphoma.


Autoři: I. Votruba 1;  B. Otová 2;  A. Holý 1
Působiště autorů: Ústav organické chemie a biochemie, v. v. i., AV ČR, Praha 1;  Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN, Praha 2
Vyšlo v časopise: Čas. Lék. čes. 2008; 147: 471-477
Kategorie: Přehledový článek

Souhrn

Nedávno bylo firmou Gilead Sciences (Foster City, CA, USA) zveřejněno potenciální cytostatikum GS‑9219. Jde o nové lipofilní profarmakum látky cyprPMEDAP, z kterého se in vivo, ve dvou stupních, uvolní účinná látka PMEG. Látka GS-9219 má významný terapeutický potenciál při léčbě spontánního nehodgkinského lymfomu u psů a je perspektivní i pro použití v humánní medicíně. cyprPMEDAP tedy představuje klíčový intermediát v intracelulární aktivaci GS-9219. Oba acyklické nukleosidfosfonáty PMEG i cyprPMEDAP, na jejichž základě byla látka GS-9219 vyvinuta, byly objeveny v Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR a tamtéž byl i podrobně prostudován jejich mechanismus účinku. Biologické studie na potkaním lymfomu byly provedeny na 1. LF UK.

Klíčová slova:
PMEG, GS-9219, nehodgkinský lymfom.

Acyklické fosfonátové analogy nukleotidů (acyklické nukleosidfosfonáty, ANP) jsou skupinou virostatik nové generace. Racionální důvody, které vedly konstrukci molekul tohoto typu, vycházely z předpokladu zachování metabolické stability alifatického řetězce, který nahrazuje cukernou část molekuly a jehož relativně volná konformace si podržuje schopnost simulovat přirozený substrát – nukleotid. Navíc zavedením katabolicky neodštěpitelné fosfonátové skupiny do alifatického řetězce byla získána výsledná izosterní a izopolární analogie s nukleotidem (1).

Cytosinový derivát této řady – ((S)-HPMPC, cidofovir, Vistide®) – získal roku 1996 ve Spojených státech amerických a poté i v Evropě a dalších částech světa povolení ke klinickému použití proti CMV (cytomegalovirus) infekcím u AIDS (syndrom získané imunodeficiencie) pacientů. Látka se jeví jako velmi účinná též k léčbě papilomatózy hrtanu (2), molluscum contagiosum (3), i HPV (human papilloma virus) indukované intraepiteliální neoplazie děložního hrdla (4). Strukturně podobné N–[2–(fosfonometoxy)etyl] deriváty (PME sloučeniny) purinů, zejména adeninu, jsou účinné proti retrovirům včetně HIV (human imunodeficiency virus), který způsobuje onemocnění AIDS (5–10). Tato skupina acyklických nukleotidů též potlačuje multiplikaci DNA virů včetně těch, které v konečné fázi nemoci působí smrt AIDS pacientů (11–15). PMEA a od ní odvozené orální profarmakum bis(POM)–PMEA jsou účinné zejména proti hepatitidě B (Hepsera®, 2002) (16–18). Posléze objevené N–[2–(fosfonometoxy)propyl] deriváty (PMP sloučeniny), patří mezi nejúčinnější od nukleosidů odvozené antiretrovirální látky vůbec (19–22). Pro léčbu AIDS bylo povoleno profarmakum látky (R)–PMPA (tenofovir disoproxilfumarát, Viread®, 2001). Tenofovir [(R)-PMPA] je rovněž účinný i proti HBV (virus hepatitidy B) (23).

Prokázali jsme, že tyto látky vykazují též cytostatické a cytotoxické efekty. PMEA, (S)-HPMPA a zvláště PMEDAP mají vliv na růst myších leukemických buněk L1210 in vitro a na syntézu DNA (24). In vivo byla na dvou myších modelech tumorů prokázána významná protinádorová aktivita u guaninového derivátu PMEG (25). Dále jsme nalezli cytostatický efekt PMEA u lymfatické leukémie KHP-Lw-I (spontánní leukémie vzniklá u potkana inbredního kmene Lewis) (26), na spontánní T-buněčný lymfom inbredních potkanů kmene Sprague-Dawley (SD-lymfom) (27) a embryotoxicitu PMEA a (S)-HPMPC na kuřecím a potkaním modelu (28). Zároveň byly zjištěny chromozomové aberace vyvolané PMEA a (S)-HPMPC na HEL buňkách (lidské embryonální plicní buňky) (28). Úvodní studie dále prokázaly významnou protinádorovou aktivitu zejména u látky PMEA (24, 26–28), tj. u adeninového derivátu této řady a později zejména u obdobné látky obsahující 2,6 diaminopurin (PMEDAP). PMEA má také signifikantní účinky imunomodulační (29–33) a antiartritické (34). Srovnání protinádorové aktivity PMEA in vivo, které bylo provedeno na různých experimentálních tumorech u myší a potkanů, ukazuje, že analog je účinný u spontánních nádorů (potkaní SD lymfom, LW13K2 – sarkom potkana kmene LEW, A870N sarkom a ALL – akutní lymfoblastická leukémie, myší LLC plicní karcinom) (35). Na tumorech indukovaných chemicky je látka zcela neúčinná (potkaní FBN sarkom indukovaný ferridextranem a HEP-LEW hepatokarcinom) (35). Protinádorové účinky PMEA byly potvrzeny i v konkurenční laboratoři na modelu potkaního choriokarcinomu (36). U některých nádorových buněčných linií (37) a u choriokarcinomu dochází vlivem PMEA i k indukci diferenciace buněk (38).

Pro další studium protinádorových účinků byl zvolen již zmíněný model T-buněčného lymfomu inbredního kmene laboratorních potkanů Sprague-Dawley (39), a to se zaměřením na látky PMEDAP, PMEG a posléze na N6-substituované deriváty PMEDAP, které mají rovněž významnou cytostatickou aktivitu (40–42).

Biochemické studie, které probíhaly paralelně, jsme zaměřili především na transport těchto acyklických nukleosidfosfonátů do buněk, jejich metabolické transformace a dále na nalezení cílových enzymů, které představují molekulární podstatu jejich mechanismu účinku.

Biologické studie

Výše uvedené sloučeniny PMEDAP, PMEG a N6-substituované deriváty PMEDAP byly vybrány pro cílené sledování cytostatických účinků na základě signifikantní inhibice proliferace myší linie L929, myší leukémie L1210, HeLa buněk (lidské buňky – karcinom děložního čípku), lidské T-lymfoblastoidní linie (CCRF-CEM) a lidské promyelocytické leukémie HL-60.

Pro in vitro studie byla vybrána T-lymfoblastoidní buněčná linie CCRF-CEM, linie buněk karcinomu děložního čípku HeLa S3 a stabilizovaná diploidní linie plicních embryonálních fibroblastů MRC-5. Cytogenetické vyšetření buněk MRC-5, CCRF-CEM a HeLa bylo provedeno po 24 a 48hodinovém působení PMEDAP, PMEG a N6-substituovaných derivátů PMEDAP. Koncentrace testovaných látek se pohybovaly v rozmezí 0,0001–0,1 μmol.l-1. Po barvení Giemsovým barvivem byly v optickém mikroskopu hodnoceny genotoxické a cytostatické účinky testovaných látek, tzn. strukturní změny a numerické odchylky chromozomů, a relativní mitotická aktivita buněk (43). U všech uvedených buněčných linií byl zaznamenán statisticky významný cytostatický účinek. Numerické chromozomální odchylky nebyly nalezeny; genotoxický efekt se projevil pouze jako chromatidové zlomy. Nejvýraznější cytostatický a genotoxický účinek byl zaznamenán po působení cyprPMEDAP a PMEG. Cytostatický a genotoxický účinek PMEDAP, Me2NEt--PMEDAP, Allyl-PMEDAP a Me2-PMEDAP byl ve srovnání s účinkem PMEG a cyprPMEDAP průkazně nižší.

Indukce apoptózy po působení PMEDAP, PMEG a N6 substituovaných derivátů PMEDAP byla sledována na buněčné linii MRC-5, CCRF-CEM a HeLa. Pro kvantitativní stanovení apoptotických buněk průtokovou cytometrií byl použit kit Annexin-V-FLUOS (Annexin V/PI). Barvení suspenze buněk Annexinem V a PI (propidium iodid) umožňuje hodnocení jak počátečního stadia apoptózy, tak detekci pozdního stadia zániku buněk (apoptóza/nekróza). PMEG indukoval časnou apoptózu u buněk CCRF-CEM a HeLa. Pouze zanedbatelné procento buněk MRC-5 vykazovalo časné stadium apoptózy. Stadium pozdní apoptózy/nekrózy po působení PMEG zaznamenáno nebylo.

Pořadí citlivosti buněčných linií k indukci časné apoptózy po působení PMEDAP bylo CCRF-CEM > HeLa > MRC-5.

N6-substituované deriváty PMEDAP indukovaly časnou apoptózu s výjimkou cyprPMEDAP, kde byla detekována pozdní apoptóza/nekróza. Odlišný nález po působení cyprPMEDAP ve srovnání s ostatními sledovanými N6-substituovanými ANP (44) souvisí, jak bude ukázáno dále, s intracelulární přeměnou této látky na PMEG.

Obecně z testů vyplynulo, že nádorové buněčné linie jsou vnímavější k indukci apoptózy po působení ANP oproti linii diploidních lidských embryonálních fibroblastů MRC-5. Z testů in vitro je dále zřejmé, že pro experimentální posouzení genotoxických a cytostatických účinků ANP je nezbytné zohlednit typ buněčné kultury, rozsah koncentrací a dobu působení sledované látky. In vitro testy jednoznačně ukázaly, že nejvyšší cytotoxické účinky má PMEG a cyprPMEDAP. V pokusech in vivo byl však jejich protinádorový efekt spojen s nepříznivými nežádoucími účinky (viz dále).

V souběžně probíhajících in vivo testech se naproti tomu látka PMEDAP projevila jako protinádorově perspektivní, díky zanedbatelným vedlejším účinkům. Po dlouhodobém podávání se ale protinádorová účinnost PMEDAP významně snižovala. Proto byla XTT testem (test stanovující buněčnou proliferaci) v závislosti na dávce PMEDAP (0,15; 0,3; 1,5; 3; 15 a 30 mg/ml) sledována proliferační aktivita buněk MRC 5, CCRF-CEM a HeLa S3 po 72hodinovém působení v kultivačním médiu. Cytostatický účinek PMEDAP byl závislý na typu buněčné linie; snižoval se v pořadí CCRF CEM > HeLa > MRC-5. Na základě těchto výsledků jsme pro dlouhodobé působení PMEDAP zvolili buněčnou linii CCFR-CEM pro studium navození rezistence v in vitro podmínkách. V souhlasu s literárními údaji o látce PMEA (45) jsme se zaměřili na kvantitativní hodnocení exprese genů MRP4MRP5 (geny asociované s mnohočetnou lékovou rezistencí) metodou RQ-RT-PCR (kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase). Tyto geny patří do rodiny genů, které se podílejí na odstraňování převážně polárních cytotoxických látek z buněk mechanismem ATP pumpy a indukují tak rezistenci. Buňky CCRF-CEM jsme 5 týdnů pasážovali v médiu s přídavkem 1 μM PMEDAP. Vzorky jsme odebírali v týdenním intervalu, kdy část buněčné suspenze byla využita pro další pasáž v médiu opět doplněném 1 μM PMEDAP. Při každé pasáži buněk jsme hodnotili relativní expresi genů MRP4 a MRP5. Po první pasáži za přítomnosti PMEDAP v kultivačním médiu byla stanovena 10× vyšší transkripční aktivita genu MRP4. V následujících pasážích aktivita genu MRP4 klesala. Naproti tomu transkripční účinnost genu MRP5 měla odlišný průběh, maxima dosáhla až po třech týdnech působení PMEDAP. Jak se potvrdilo i v in vivo experimentech (viz dále), oba tyto geny se podílejí při ochraně buněk proti cytostatickému působení látky PMEDAP (45).

Pro testování protinádorových účinků vybraných acyklických nukleosidfosfonátů byla použita hematologická malignita vznikající spontánně u inbredních potkanů Sprague-Dawley (SD/Cub). Inbrední kmen SD/Cub udržovaný křížením bratr × sestra je chován od roku 1993 v Ústavu biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN v Praze. Tato zvířata mají spontánní výskyt T-buněčných lymfomů. Primární, spontánně vzniklé lymfomy jsou transplantovatelné formou buněčné suspenze na syngenní zvířata, což umožňuje sestavení sourodých skupin pro testy. SD-lymfomy byly charakterizovány na základě hematologického, histopatologického, cytogenetického vyšetření, imunofenotypu a imunohistochemie. Byly definovány jako nehodgkinský typ lymfomu (46). Po inokulaci definovaného počtu buněk do podkoží lymfomy rostou jako ohraničené útvary; jejich plocha anebo hmotnost je měřitelná. V konečném stadiu růstu lymfomu se u zvířat objevuje leukemická fáze onemocnění. Suspenze buněk lymfomu je získána mechanickým rozvolněním nádorové tkáně do roztoku PBS. Pro testování protinádorového účinku ANP bylo používáno inokulum 106 buněk v 0,2 ml PBS. Experimenty na laboratorních potkanech byly schváleny Komisí 1. LF UK pro práci s laboratorními zvířaty. 

Aplikace testovaných látek představovala různé protokoly podání. Modifikace protokolu se týkaly: 1. množství podávané látky; 2. zahájení terapie vzhledem k počátku inokulace buněk lymfomu a 3. časového rozpětí terapie. Spolu se sledováním potlačení růstu lymfomu a přežívání experimentálních zvířat byly sledovány vedlejší účinky testovaných látek (hmotnost zvířat, krevní obraz, cytogenetické vyšetření kostní dřeně, histologické vyšetření ledvin).

PMEDAP signifikantně snižoval proliferační schopnost buněk lymfomu, což se opakovaně projevilo při hodnocení velikosti lymfomu rostoucího v podkoží (měření plochy v průběhu terapie), hmotnosti lymfomu po ukončení terapie a doby přežití ve srovnání s neléčenými zvířaty s lymfomem. Snížení nárůstu nádorové tkáně bylo vždy intenzivní na počátku terapie, postupně se reakce na léčbu snižovala. Po podání PMEDAP nebyly s výjimkou reverzibilního poklesu hmotnosti zvířat a mírného snížení počtu bílých krvinek během podání látky zaznamenány jiné nežádoucí účinky.

Pro posouzení mechanismu vzniku rezistence na PMEDAP při dlouhodobém podávání jsme látku aplikovali během 5 pasáží na mladé zdravé syngenní příjemce inokulované 107 buněk SD lymfomu. Interval mezi pasážemi byl vždy 21 dnů. Dávka 5 mg.kg-1 aplikovaná 1× denně signifikantně potlačovala růst SD lymfomu během první a druhé pasáže. Od 3. do 4. pasáže nebyl v jednotlivých pasážích zaznamenán rozdíl v růstu SD lymfomu u léčených a neléčených zvířat. Při každé pasáži jsme odebírali část buněčné suspenze pro hodnocení relativní exprese genů MRP4 a MRP5. Transkripční aktivita genu MRP4 byla u všech čtyř odběrů statisticky významně zvýšená: tzn. po celou dobu aplikace PMEDAP. Transkripční aktivita genu MRP5 měla odlišný průběh: během 1. pasáže dosáhla maxima a u vzorků 2. pasáže klesla. Vzorky DNA izolované z buněk 3. a 4. pasáže při aplikaci PMEDAP vykazovaly stejnou relativní expresi genu MRP5 jako vzorky odebrané z SD lymfomů bez terapie (45).

V jiné studii byla v buňkách lymfomu sledována indukce apoptózy po aplikaci PMEDAP. Bylo injikováno 5 mg/kg PMEDAP 1× denně po dobu 5 dnů. Ve 4., 8., 11. a 24. hodině po poslední dávce byly nádorové buňky barveny APO-BrDU soupravou, která značí zlomy DNA a průtokovou cytometrií jsme zhodnotili procento buněk v apoptóze. Maximální zastoupení apoptotických buněk (20%) bylo nalezeno v 8. hodině po poslední dávce látky (47, 48).

N6-substituované deriváty PMEDAP – Me2NetPMEDAP, AllylPMEDAP a Me2PMEDAP nevykazovaly v našem modelovém systému významný protinádorový účinek při stejném režimu dávkování jako u mateřské látky PMEDAP. Naproti tomu podání cyprPMEDAP a PMEG vyvolalo úplnou zástavu růstu lymfomu v místě inokulace nádorových buněk a nedošlo ani k leukemické fázi onemocnění. Avšak na rozdíl od PMEDAP obě látky měly výrazné vedlejší účinky. Terapeutická dávka cyprPMEDAP nebo PMEG byla snížena až na 1 mg/kg a přesto zvířata, kterým byly látky aplikovány, ztrácela hmotnost. Ztráta hmotnosti vedla při vyšších dávkách léčiva ke kachexii a předčasnému úhynu zvířat (49).

Případné embryotoxické (letální) nebo teratogenní účinky byly testovány na F1 generaci inbredních potkanů LEW × BN (Brown Norway), genotyp +/+, a F1 generaci inbredních potkanů LEW × BN s recesivní mutací v genu podmiňujícím syndrom polydaktilie/luxace (genotyp +/l×) (28). Březím samicím s genotypem embryí +/+ anebo +/l× byl jednorázově aplikován PMEDAP, PMEG a cyprPMEDAP v kritický den vývoje končetin embrya (10. den březosti). PMEDAP neměl embryotoxický ani embryoletální účinek. Po aplikaci PMEG anebo cyprPMEDAP se v závislosti na výši dávky zvyšoval počet resorpcí plodu (embryotoxicita); přesto ale určitý počet embryí přežíval. cyprPMEDAP po vysokých dávkách vyvolal u přežívajících plodů defekty různých částí končetin (44).

Biochemické studie

Význam intracelulární hladiny mono– a difosfátů acyklických nukleosidfosfonátů pro jejich biologickou účinnost je dokumentován selekcí rezistentní buněčné linie, která je, díky omezené schopnosti fosforylace PMEA spojené navíc s jejím zvýšeným transportem z buněk, přibližně 250× odolnější vůči cytotoxickým účinkům této látky než původní buňky (50). Ve velmi podrobné strukturně aktivitní studii s AMP-kinázou typu AK2 (mitochondriální AMP-kináza) o vysoké čistotě (51) jsme ukázali, že tento enzym (monomer o relativní molekulové hmotnosti 26 000), který vykazuje pro přirozené nukleotidy absolutní specifitu k AMP a dAMP, katalyzuje in vitro fosforylaci acyklických nukleosidfosfonátů obsahujících adenin a 2,6-diaminopurin. Relativní účinnost fosforylace látky PMEDAP je ve srovnání s AMP pouze 8,5%, protože fosforylace probíhá s extrémně nízkou Vmax a vysokou hodnotu Km (51).

Naproti tomu fosfonometoxyalkyl deriváty guaninu jsou fosforylovány za účasti GMP-kináz (EC 2.7.4.8). V rozsáhlé studii, které předcházela izolace pěti izoenzymů GMP-kinázy (pI 5,95, 5,50, 5,08, 4,83 a 4,51) z buněk L1210 (52), jsme se podrobně zabývali substrátovými a inhibičními vlastnostmi guaninových acyklických nukleosidfosfonátů s různě modifikovaným alifatickým řetězcem (53). Kinetická data ukazují, že jednotlivé izoenzymy GMP-kinázy fosforylují PMEG s nízkou účinností. Strukturně blízký derivát 2,6-diaminopurinu PMEDAP není GMP-kinázou fosforylován, ani není inhibitorem enzymu (53).

Dále jsme zjistili, že vznikající monofosfáty ANP jsou vysoce potentními inhibitory purinnukleosidfosforylázy (PNP; EC 2.4.2.1) (54). Enzym je jedním z klíčových regulačních enzymů katabolismu purinových nukleosidů. Katalyzuje fosforolýzu inosinu a guanosinu na příslušné báze, které jsou potom reutilizovány prostřednictvím tzv. zachraňujících mechanismů (salvage pathway). Zásah do tohoto děje vede k zástavám buněčné proliferace (55). Zejména v T-lymfocytech dochází v průběhu inhibice PNP k intracelulární akumulaci guanosinu, 2’-deoxyguanosinu, GTP a následně dGTP, který je alosterickým inhibitorem ribonukleotidreduktázy (56, 57). Proliferující T-buňky jsou příčinou řady onemocnění (lymfomy, leukémie, autoimunní choroby), a proto jsou inhibitory purinnukleosidfosforylázy perspektivní chemoterapeutika (58).

Fosforylace do druhého stupně za vzniku difosfátů acyklických nukleosidfosfonátů, které jsou analogy přirozených nukleosid-5’-trifosfátů, probíhá za katalytické účasti nukleosid-5’-difosfátkinázy (59), přičemž substrátová aktivita (kcat/Km) je o tři až pět řádů nižší než pro přirozené nukleosid- 5’-difosfáty.

Soubor výše uvedených cytostatických a protinádorových účinků, pozorovaný zejména u purinových N–9-(2–fosfonometoxyetyl) derivátů PMEG, PMEA a PMEDAP, nás vedl k podrobnému studiu interakcí difosfátů těchto sloučenin s DNA–polymerázami (pol; EC 2.7.7.7), které spolupracují při syntéze jaderné DNA. Cílem bylo vysvětlit jejich molekulární podstatu. Pro izolaci enzymů byla vybrána tkáň T lymfomu (39) inbredního kmene laboratorních potkanů Sprague-Dawley. Tento model zvířecí hematologické malignity byl vybrán pro ověřování cytostatických účinků acyklických nukleotidových derivátů in vivo (viz výše).

Postupně byl vypracován způsob izolace pol α, δ, ε* (60) a ε (61) z této tkáně; stanovení inhibice fosfonátových analogů nukleotidů na DNA–polymerázy α, δ a ε bylo prováděno na templát–primerech poly dA–oligodT12–18, poly dT-oligo dA12–18 a poly dC-oligo dG12–18 za optimalisovaných reakčních podmínek. Získaná kinetická data (Vmax, Km) pro inkorporaci přirozených nukleotidů a hodnoty inhibičních konstant (Ki) ukázaly, že nejsilnějším inhibitorem z testované skupiny látek je PMEGpp, kompetitivní inhibitor inkorporace dGTP (pol αKi/Km = 0,026; pol δKi/Km = 0,004) (62).

U 2,6-diaminopurinového derivátu PMEDAPpp se naproti tomu ukázala selektivita účinku: PMEDAPpp je silným inhibitorem pol δ (pol δKi/Km = 0,08), výrazně slabším pro pol α (pol αKi/Km = 0,26) a nevýznamným inhibitorem pol ε (pol εKi/Km = 1,25), přičemž kompetuje inkorporaci dATP. PMEDAPpp by mohl teoreticky působit též jako kompetitivní inhibitor inkorporace dGTP do poly dC-oligo dG12–18. Tato možnost však byla pro pol α a pol ε vyloučena (62). Je tudíž velice pravděpodobné, že interakce acyklických fosforylovaných nukleosidfosfonátů s replikativními DNA-polymerázami úzce souvisí s cytostatickým účinkem původních (nefosforylovaných) látek.

PMEGpp, PMEDAPpp a další deriváty tohoto typu jsou současně i substráty studovaných DNA-polymeráz. Působí jako terminátory nascentních řetězců DNA. Produkty reakce, ANP-terminované DNA řetězce rovněž jednotlivé DNA-polymerázy inhibují. K vyštěpení terminujících ANP dochází působením 3’-5’-exonukleáz asociovaných s pol δ, pol ε a pol ε* (63, 64).

Podle našich posledních zjištění je dalším cílovým enzymem cytostatického účinku látek PMEG a PMEDAP telomeráza. Enzym přidáváním telomerických sekvencí vyrovnává ztrátu repeticí na 3’-koncích chromozomové DNA, k níž by jinak docházelo v nepřítomnosti telomerázy při každém buněčném dělení. Proto je telomeráza aktivní ve většině rychle proliferujících buněk, zejména pak u buněk nádorových. Hraje důležitou úlohu v buněčné „nesmrtelnosti“. Telomeráza zůstává navázaná na své DNA produkty, čímž stabilizuje telomery (repetitivní sekvence na terminálním konci chromozomu), a pomáhá tak chránit chromozomy před degradací a rekombinací.

Metodou „TRAP assay” jsme prokázali, že příslušné difosfáty obou acyklických nukleosidfosfonátů, PMEGpp a PMEDAPpp, telomerázu inhibují (65).

Mimořádně zajímavou skupinou sloučenin, jejíž cytostatické účinky bezprostředně souvisí s látkou PMEG jsou N6 substituované deriváty látky PMEDAP (66). Intracelulárně jsou tyto sloučeniny deaminovány na PMEG (66), a představují tedy skupinu profarmak tohoto cytostatika. Jako nejvýznamnější z této skupiny acyklických nukleosidfosfonátů se jeví N6-cyclopropyl-2,6-diamino-9-[2-(phosphonometoxy)etyl]purin (cyprPMEDAP). Studium mechanismu intracelulární přeměny N6-substituovaných derivátů látky PMEDAP vedlo k charakterizaci dosud nepopsané cytosolární N6-metyl-AMP/N6-metyl-dAMP-aminohydrolázy (67, 68) enzymu, který s nejvyšší pravděpodobností katalyzuje katabolismus přirozených metylovaných nukleotidů.

Enzym má klíčovou úlohu pro intracelulární aktivaci vyvíjeného cytostatika GS-9219 (69, 70), které je lipofilním profarmakem acyklického nukleosidfosfonátu cyprPMEDAP, a tedy i profarmakem účinné látky PMEG. Látka GS-9219 je mimořádně účinná při experimentální léčbě nehodgkinského lymfomu u psů a je ve fázi I klinických zkoušek.

Závěr

Acyklické nukleosidfosfonáty PMEDAP, PMEG a cyprPMEDAP se v intracelulárním metabolismu chovají jako analogy nukleotidů. Jejich cytostatické účinky jsou podmíněny fosforylací za účasti buněčných nukleosid-5’-fosfátkináz, klíčových enzymů nejen biosyntézy nukleotidů de novo, ale i tzv. zachraňujících mechanismů. Účinnými metabolity jsou výhradně difosfáty příslušných acyklických nukleosidfosfonátů, které inhibují replikaci genomové DNA. Na cytostatickém účinku se zřejmě podílí i jejich interakce s telomerázou a purinnukleosidfosforylázou. I v tomto případě jsou aktivními metabolity příslušné fosforylované formy těchto acyklických analogů nukleotidů. Experimenty in vivo na experimentálním lymfomu (model SD/Cub hematologické malignity inbredních potkanů Sprague-Dawley) ukázaly na značný terapeutický potenciál zejména u látek PMEG a cyprPMEDAP, přičemž bylo prokázáno, že látka cyprPMEDAP je profarmakem látky PMEG. Nežádoucí vedlejší účinky obou acyklických nukleosidfosfonátů evidentně eliminuje lipofilní profarmakum látky cyprPMEDAP, látka GS 9219 vyvinutá v laboratořích farmaceutické společnosti Gilead Science (Foster City, CA, USA), se kterou Ústav organické chemie a biochemie, v.v.i. AV ČR těsně spolupracuje.

Zkratky

AIDS – syndrom získané imunodeficiencie

ANP – acyklický nukleosidfosfonát

APO-BrDU – kit pro detekci apoptózy průtokovou cytometrií

CCRF-CEM – T-lymfoblastoidní buněčná linie

HeLa – linie buněk karcinomu děložního čípku

MRC-5 – stabilizovaná diploidní linie plicních embryonálních fibroblastů

gen MRP4 – kóduje protein 4 asociovaný s mnohočetnou lékovou rezistencí

gen MRP5 – kóduje protein 5 asociovaný s mnohočetnou lékovou rezistencí

PMEG – 9-[2-(fosfonometoxy)etyl]guanin

PMEGpp – 9-[2-(fosfonometoxy)etyl]guanindifosfát

PMEDAP – 2,6-diamino-9-[2-(fosfonometoxy)etyl]purin

PMEDAPpp – 2,6-diamino-9-[2-(fosfonometoxy)etyl]purindifosfát

cyprPMEDAP – N6-cyklopropyl-2,6-diamino-9-[2-(fosfonometoxy)etyl]purin

Allyl-PMEDAP – N6-allyl-2,6-diamino-9-[2-(fosfonometoxy)etyl]purine

Me2PMEDAP – N6-dimetyl-2,6-diamino-9-[2-(fosfonometoxy)etyl]purine

Me2NEt-PMEDAP – N6-(2-dimetylaminoetyl)-2,6-diamino-9-[2--(fosfonometoxy)etyl]purine

PMEA – 9-[2-(fosfonometoxy)etyl]adenin

(S)-HPMPC – 1-[(S)-3-hydroxy-2-(fosfonometoxy)propyl]cytosin

(R)-PMPA – 9-[(R)-2-(fosfonometoxy)propyl]adenin

pol – DNA-polymerázy

PI – propidium iodid

RQ-RT-PCR – kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase

SD/Cub – inbrední kmen potkanů Sprague-Dawley/Karlova Univerzita Biologie

SD-lymfom – lymfom spontánně vzniklý u potkanů Sprague-Dawley

Práce byla částečně financována z prostředků projektu VZ 0021620808 Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy a z projektu Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy 1M0508.


RNDr. Ivan Votruba, DrSc.

Ústav organické chemie a biochemie, v.v.i., AV ČR

Flemingovo náměstí 2, 160 00 Praha 6

fax: +420 220 183 560, e-mail: votruba@uochb.cas.cz


Zdroje

1. Holý, A.: Antiviral acyclic nucleotide analogues. In: Antibiotics and antiviral compounds (Krohn, K., Kirst, H., Maas, H., eds), Verlags-gesellschaft mbH, Weinheim, 1993, s. 455–462.

2. Snoeck, R., Van Cutsem, E., Van Ranst, M. et al.: (S)-1-(3--Hydroxy-2-phosphonylmethoxypropyl)cytosine (HPMPC): successful treatment of a patient with disseminated esophageal and hypo-pharyngeal papillomatosis. 5th International Skin Therapy Symposium, Brussels, Belgium, May 25–28, 1994, Abstract Book, 1994, s. 230.

3. Pavia, A. T., Meadows S., Tyring, S. K., Rallis, T. M.: Treatment of recalcitrant molluscum contagiosum with cidofovir. 5th Conf. Retrovir. Oppor. Infect. Abstract Book, 1998, s. 174.

4. Snoeck, R., Noel, J. C., Muller, C. et al.: Cidofovir, a new approach for the treatment of cervix intraepithelial neoplasia grade III (CIN III). J. Med. Virol., 2000, 60, s. 205–209.

5. Balzarini, J., Naesens, L., Herdewijn, P. et al.: Marked in vivo antiretrovirus activity of 9-(2-phosphonyl-methoxyethyl)adenine, a selective anti-human immunodefi-ciency virus agent. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86, s. 332–336.

6. Balzarini, J., Naesens, L., De Clercq, E.: Anti-retrovirus activity of 9-(2-phospho-nylmethoxyethyl)adenine (PMEA) in vivo increases when it is less frequently administered. Int. J. Cancer, 1990, 46, s. 337–340.

7. Balzarini, J., Sobis, H., Naesens, L. et al.: Inhibitory effects of 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenine and 3’-azido-2’,3’-dideoxy-thymidine on tumor development in mice inoculated intracerebrally with Moloney murine sarcoma virus. Int. J. Cancer, 1990, 45, s. 486–489.

8. Balzarini, J., Hao, Z., Herdewijn, P. et al.: Intracellular metabolism and mechanism of antiretrovirus action of 9-(2--phosphonyl-methoxyethyl)adenine, a potent anti-human immunodeficiency virus compound. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1991, 88, s. 1499-1503.

9. Balzarini, J., Naesens, L., Slachmuylders, J. et al.: 9-(2--phosphonylmethoxyethyl)adenine (PMEA) effectively inhibits retrovirus replication in vitro and simian immunodeficiency virus infection in rhesus monkeys. AIDS, 1991, 5, s. 21–28.

10. Balzarini, J.: Metabolism and mechanism of antiretroviral action of purine and pyrimidine derivatives. Pharmacy World Sci., 1994, 16, s. 113–126.

11. De Clercq, E., Holý, A., Rosenberg, I. et al.: A novel selective broad-spectrum anti-DNA virus agent. Nature, 1986, 323, s. 464–467.

12. De Clercq, E., Sakuma, T., Baba, M. et al.: Antiviral activity of phosphonylmethoxyalkyl derivatives of purine and pyrimidines. Antiviral Res., 1987, 8, s. 261–272.

13. De Clercq, E., Holý, A., Rosenberg, I.: Efficacy of phosphonylmethoxyalkyl derivatives of adenine in experimental herpes simplex virus and vaccinia virus infections in vivo. Antimicrob. Agents Chemother., 1989, 33, s. 185–191.

14. De Castro, L. M., Kern, E. R., De Clercq, E. et al.: Phosphonylmethoxyalkyl purine and pyrimidine derivatives for treatment of opportunistic cytomegalovirus and herpes simplex virus infections in murine AIDS. Antiviral Res., 1991, 16, s. 101–114.

15. De Clercq, E.: Broad-spectrum anti-DNA virus and antiretrovirus activity of phosphonylmethoxyalkylpurine and – pyrimidines. Biochem. Pharmacol., 1991, 42, s. 963–972.

16. Yokota, T., Konno, K., Chonan, E. et al.: Comparative activities of several nucleoside analogs against duck hepatitis B virus in vitro. Antimicrob. Agents Chemother., 1990, 34, s. 1326–1330.

17. Yokota, T., Mochizuki, S., Konno, K. et al.: Phosphonylmethoxyalkyl derivatives of purine as inhibitors of human hepatitis B virus DNA synthesis. Nucleic Acids Symp. Ser., 1990, s. 17–18.

18. Yokota, T., Mochizuki, S., Konno, K. et al.: Phosphonylmethoxyalkyl derivatives of purine as inhibitors of human hepatitis B virus DNA synthesis. Nucleic Acids Symp. Ser., 1990, s. 17–18.

19. Holý, A., Rosenberg, I., Dvořáková, H.: Synthesis of N-(2--phosphonylmethoxy-ethyl) derivatives of heterocyclic bases. Collect. Czech. Chem. Commun., 1990, 54, s. 2190–2210.

20. Holý, A., Masojídková, M.: Synthesis of enantiomeric N-(2--phosphonomethoxy-propyl) derivatives of heterocyclic bases. I. Stepwise approach. Collect. Czech. Chem. Commun., 1995, 60, s. 1196–1212.

21. Balzarini, J., Holý, A., Jindřich, J., et al.: Differential antiherpes virus and antiretrovirus effects of the (S)- and (R)-enantiomers of acyclic nucleoside phosphonates. Potent and selective in vitro and in vivo antiretrovirus activity of the (R)-9-(2-phosphonomethoxypropyl) derivatives of heterocyclic bases. Antimicrob. Agents Chemother., 1993, 37, s. 332–338.

22. Balzarini, J., Aquaro, S., Perno, C. F., et al.: Activity of the (R)-enantiomers of 9-(2-phosphonylmethoxypropyl)adenine and 9-(2-phosphonylmethoxypropyl)-2,6-diaminopurine against human immuno-deficiency virus in different human cell systems. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 219, s. 337–341.

23. Ying, C., De Clercq, E., Neyts, J.: Lamivudine, adefovir and tenofovir exhibit long-lasting anti-hepatitis B virus activity in cell culture. J. Viral Hepat., 2000, 7, s. 79–83.

24. Veselý, J., Merta, A., Votruba, I. et al.: The cytostatic effects and mechanism of action of antiviral acyclic adenine nucleotide analogs in L1210 mouse leukemia cells. Neoplasma, 1990, 37, s. 105–110.

25. Rose, W. C., Crosswell, A. R., Bronson, J. J., Martin, J. C.: In vivo antitumor activity of 9-[(2-phosphonylmethoxy)ethyl]guanine and related phosphonate nucleotide analogues. J. Natl. Cancer. Inst., 1990, 82, s. 510–512.

26. Otová, B., Sladká, M., Votruba, I. et al.: Cytostatic effect of 9-(2-phosphonomethoxyethyl)adenine (PMEA). I. Lymphatic leukemia KHP-Lw-I in Lewis rats. Folia Biol. (Praha), 1993, 39, s. 136–141.

27. Otová, B., Sladká, M., Blažek, K. et al.: Cytostatic effect of 9-(2-phosphonomethoxyethyl)adenine (PMEA). II. Lymphoblastic leukemia in Sprague-Dawley rats. Folia Biol. (Praha), 1993, 39, s. 142–149.

28. Bílá, V., Otová, B., Jelínek, R. et al.: Antimitotic and teratogenic effects of acyclic nucleotide analogues 1-(S)-(3-hydroxy-2-phosphonomethoxyethyl)cytosine (HPMPC) and 9-(2-phosphonomethoxyethyl)adenine (PMEA). Folia Biol. (Praha), 1993, 39, s. 150–161.

29. Otová, B., Zídek, Z., Holý A. et al.: Immunomodulatory properties of 9-(2-phosphonomethoxyethyl)adenine (PMEA). Folia Biol. (Praha), 1994, 40, s. 185–192.

30. Calio, R., Villani, N., Balestra, E. et al.: Enhancement of natural killer activity and interferon induction by different acyclic nucleoside phosphonates. Antiviral Res., 1994, 23, s. 77–89.

31. Kunder, S. C., Black, P. L., Hall, B. E., Ussery, M. A.: PMEA has immuno-modulatory activity and inhibits reverse transcriptase in the Rauscher murine leukemia virus (RMuLV) model. Antiviral Res., 1995, 26, A276.

32. Zídek, Z., Franková, D., Holý A.: Stimulation of cytokine and nitric oxide production by acyclic nucleoside phosphonates. Nucleosides Nucleotides, 1991, 18, s. 959–961.

33. Zídek, Z., Franková, D., Holý, A.: Macrophage activation by antiviral acyclic nucleoside phosphonates in dependence on priming immune stimuli. Int. J. Immunopharmacol., 2000, 22, s. 1121–1129.

34. Zídek, Z., Franková, D., Holý, A.: Chemokines, nitric oxide and antiarthritic effects of 9-(2-phosphonomethoxyethyl)adenine (Adefovir). Eur. J. Pharmacol., 1999, 376, s. 91–100.

35. Otová, B., Křenová, D., Zídek, Z. et al.: Cytostatic effect of 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenine (PMEA). III. Rat and mouse carcinomas and sarcomas. Folia Biol. (Praha), 1993, 39, s. 311–314.

36. Hatse, S., Naesens, L., Degreve, B. et al.: Potent antitumor activity of the acyclic nucleoside phosphonate 9-(2--phosphonylmethoxyethyl)adenine in choriocarcinoma-bearing rats. Int. J. Cancer, 1998, 76, s. 595–600.

37. Balzarini, J., Verstuyf, A., Hatse, S. et al.: The human immunodeficiency virus (HIV) inhibitor 9-(2-phosphonyl-methoxyethyl)adenine (PMEA) is a strong inducer of differentiation of several tumor cell lines. Int. J. Cancer, 1995, 61, s. 130–137.

38. Hatse, S., Naesens, L., De Clercq, E., Balzarini, J.: Potent differentiation-inducing properties of the antiretroviral agent 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenine (PMEA) in the rat choriocarcinoma tumor cell model. Biochem. Pharmacol., 1998, 56, s. 851–859.

39. Otová, B., Sladká, M., Damoiseaux, J. et al.: Relevant Animal Model of Human Lymphoblastic Leukaemia/Lymphoma – Spontaneous T-Cell Lymphomas in an Inbred Sprague-Dawley Rat Strain (SD/Cub). Folia Biologica (Praha), 2002, 48, s. 213–226.

40. Holý, A., Zídek, Z., Votruba, I.: Inhibition of murine lymphocyte proliferation by N6-substituted acyclic purine nucleoside phosphonates. Collect. Czech. Chem. Commun., 1996, 61, s. S182–S187.

41. Hatse, S., Naesens, L., De Clercq, E., Balzarini, J.: N6‑Cyclopropyl-PMEDAP: A novel derivative of 9-(2--phosphonylmethoxyethyl)-2,6-diaminopurine (PMEDAP) with distinct metabolic, anti-proliferative and differentiation-inducing properties. Biochem. Pharmacol., 1999, 58, s. 311–323.

42. Valeriánová, M., Votruba, I., Holý, A. et al.: Antitumour activity of N6-substituted PMEDAP derivatives against T-cell lymphoma. Anticancer Res., 2001, 21, s. 2057–2064.

43. Otová, B., Holý, A., Votruba, I., et al.: Genotoxicity of Purine Acyclic Nucleotide Analogs. Folia Biol. (Praha), 1997, 43, s. 225–229.

44. Valerianova, M., Otova, B., Bila, V. et al.: PMEDAP and its N6-substituted derivatives: genotoxic effect and apoptosis in in vitro conditions. Anticancer Res. 2003, 23, s. 4933–4939.

45. Hatse, S., De Clercq, E. and Balzarini J.: Enhanced 9-(2--phosphonylmethoxy-ethyl)adenine secretion by a specific, indomethacine-sensitive efflux pump in a mutant 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenine-resistant human erythroleukemia K562 cell line. Mol. Pharmacol. 1998, 54, s. 907–917.

46. Zápotocký, M., Hanzalová, J., Starková, J. et al.: Experimental therapy with PMEDAP – 9-[2-(phosphonomethoxy)ethyl]-2,6-diaminopurine (PMEDAP): origin of resistance. Folia Biologica (Praha), 2007, 53, s. 79–84.

47. Otová, B., Francová, K., Franěk, F. et al.: 9-[2-(Phosphonomethoxy)ethyl]-2,6-diaminopurine (PMEDAP) – a potential drug against hematological malignancies – induces apoptosis. Anticancer Res., 1999, 19, s. 3173-3182.

48. Bobková, K., Otová, B., Marinov, I. et al.: Anticancer Effect of PMEDAP - Monitoring of Apoptosis. Anticancer Res., 2000, 20, s. 1041-1048.

49. Valeriánová, M., Votruba, I., Holý, A. et al.: N6-Substituted derivatives of PMEDAP: antitumor activity against T-cell lymphoma. Anticancer. Res., 2001, 21, s. 2057–2064.

50. Robins, B. L., Connelly, M. C., Marshall, D. et al.: A human T-lymphoid cell variant resistant to the acyclic nucleoside phosphonate, 9-(2-phosphonomethoxyethyl)adenine (PMEA), shows a unique combination of a phosphorylation effect and increased efflux of the agent. Mol. Pharmacol., 1995, 47, s. 391–397.

51. Krejčová, R., Horská, K., Votruba, I., Holý, A.: Phosphorylation of purine phosphonomethoxyalkyl derivatives by mitochondrial AMP kinase (AK2 type) from L1210 cells. Collect. Czech. Chem. Commun., 2000, 65, s. 1653–1668.

52. Krejčová, R., Horská, K., Votruba, I., Holý, A.: Isoenzymes of GMP kinase from L1210 cells: isolation and characterization. Collect. Czech. Chem. Commun., 1999, 64, s. 559–570.

53. Krejčová, R., Horská, K., Votruba, I., Holý, A.: Interaction of phosphono-methoxyalkyl derivatives of guanine with GMP kinase isoenzymes. Biochem. Pharmacol., 2000, 60, s. 1907–1913.

54. Šedivá, K., Ananiev, A. V., Votruba, I. et al.: Inhibition of purine nucleoside phosphorylase by phosphonylmethoxyalkyl analogues of nucleotides. Int. J. Pur. Pyr. Res., 1991, 2, s. 35–39.

55. Stockler, J. D.: Purine nucleoside phosphorylase: A target for chemotherapy. In Developments in Cancer Chemotherapy, CRC Press, Boca Raton, FL, 1984.

56. Sidi, Y., Mitchell, B. S.: 2’-Deoxyguanosine toxicity for B and mature T lymphoid cell lines is mediated by guanine ribonucleotide accumulation. J. Clin. Invest., 1984, 74, s. 16480–16488.

57. Mattano, S. S., Palella, T. D., Mitchell, B. S.: Mutations induced at the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase locus of human T-lymphoblasts by perturbations of purine deoxyribonucleoside triphosphate pools. Cancer Res., 1990, 50, s. 4566–4571.

58. Lloyd, A. W.: Purine nucleoside phosphorylase inhibitors. Drug Discovery Today, 2000, 5, s. 85–86.

59. Horská, K., Votruba, I., Holý, A.: Interaction of phosphates of the acyclic nucleoside phosphonates with NDP kinase from yeast and bovine liver. Collect. Czech. Chem. Commun., 2006, 71, s. 35–43.

60. Kramata, P., Černý, J., Birkuš, G. et al.: DNA polymerases α, δ and ε from T-cell spontaneous lymphoblastic leukemia of Sprague-Dawley inbred rat: isolation and characterization. Collect. Czech. Chem. Commun., 1995, 60, s. 1555–1572.

61. Birkuš, G., Kramata, P., Votruba, I. et al.: Nonproteolyzed form of DNA polymerase from SD-lymphoma of Sprague-Dawley inbred rat: isolation and characterization. Collect. Czech. Chem. Commun., 1998, 63, s. 723–731.

62. Kramata, P., Votruba, I., Otová, B., Holý, A.: Different inhibitory potencies of acyclic phosphonomethoxyalkyl nucleotide analogs toward DNA polymerases α, δ, and ε. Mol. Pharmacol., 1996, 49, s. 1005–1011.

63. Birkuš, G., Votruba, I., Holý, A., Otová, B.: PMEApp as a substrate toward replicative DNA polymerases α, δ and ε*. Biochem. Pharmacol., 1999, 58, s. 487–492.

64. Kramata, P., Downey, K. M, Paborsky, L. R.: Incorporation and excision of 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)guanine (PMEG) by DNA polymerase delta and epsilon in vitro. J. Biol. Chem., 1998, 273, s. 21966–21971.

65. Hájek, M., Matulová, N., Votruba, I. et al.: Inhibition of human telomerase by diphosphates of acyclic nucleoside phosphonates. Biochem. Pharmacol., 2005, 70, s. 894–900.

66. Holý A., Votruba I., Tloušťová E. and Masojídková M.: Synthesis and cytostatic activity of N-[2-(phosphonomethoxy)alkyl] derivatives of N6-substituted adenines, 2,6‑diaminopurines and related compounds. Collect. Czech. Chem. Commun., 2001, 66, s. 1545–1592.

67. Schinkmanová, M., Votruba, I., Holý, A.: N6-Methyl-AMP aminohydrolase activates N6-substituted purine acyclic nucleoside phosphonates. Biochem. Pharmacol., 2006, 71, s. 1370-1376.

68. Schinkmanová, M., Votruba, I., Shibata, R. et al.: Human N6-Methyl-AMP/dAMP aminohydrolase (abacavir 5’-monophosphate deaminase) is capable of metabolizing N6-substituted purine acyclic nucleoside phosphonates. Collect. Czech. Chem. Commun., 2007, 73, s. 275–291.

69. Reiser H., Ray A., Shibata R. et al.: GS-9219: A novel prodrug of 9-(2-phosphonomethoxyethyl)guanine (PMEG) with potent activity in hematologic malignancies. American Association for Cancer Research Annual Meeting, Los Angeles, 2007, abstr. 3188.

70. Vail D., Thamm D., Tumas D. et al: Efficacy and safety profile of GS-9219, a novel guanine nucleotide analog prodrug, for the treatment of lymphoid malignancies using pet dogs with spontaneous non-Hodgkin’s lymphoma as a model. American Association of Cancer Research Annual Meeting, Los Angeles, 2007, abstr. 5730.

Štítky
Adiktologie Alergologie a imunologie Angiologie Audiologie a foniatrie Biochemie Dermatologie Dětská gastroenterologie Dětská chirurgie Dětská kardiologie Dětská neurologie Dětská otorinolaryngologie Dětská psychiatrie Dětská revmatologie Diabetologie Farmacie Chirurgie cévní Algeziologie Dentální hygienistka

Článek vyšel v časopise

Časopis lékařů českých


Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Léčba bolesti v ordinaci praktického lékaře
nový kurz
Autoři: MUDr. PhDr. Zdeňka Nováková, Ph.D.

Revmatoidní artritida: včas a k cíli
Autoři: MUDr. Heřman Mann

Jistoty a nástrahy antikoagulační léčby aneb kardiolog - neurolog - farmakolog - nefrolog - právník diskutují
Autoři: doc. MUDr. Štěpán Havránek, Ph.D., prof. MUDr. Roman Herzig, Ph.D., doc. MUDr. Karel Urbánek, Ph.D., prim. MUDr. Jan Vachek, MUDr. et Mgr. Jolana Těšínová, Ph.D.

Léčba akutní pooperační bolesti
Autoři: doc. MUDr. Jiří Málek, CSc.

Nové antipsychotikum kariprazin v léčbě schizofrenie
Autoři: prof. MUDr. Cyril Höschl, DrSc., FRCPsych.

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se