Vztah sérové koncentrace D-serinu a psychopatologie u schizofrenie

Souhrn

Hypofunkce glutamátergního NMDA (N-methyl-D-aspartát) receptoru se podílí na patofyziologii schizofrenního onemocnění. Aminokyselina D-serin účinkuje jako endogenní koagonista na glycinovém modulačním místě NMDA receptoru. U nemocných schizofrenií byly ve srovnání se zdravými kontrolními subjekty prokázány snížené koncentrace D-serinu v krevním séru. D-serin v klinických studiích zlepšoval u nemocných schizofrenií v augmentaci léčby antipsychotiky 1. a 2. generace pozitivní a negativní příznaky. V populaci 50 nemocných schizofrenií zařazených do klinické studie jsme neprokázali vztah mezi sérovou koncentrací D-serinu a celkovými skóry a skóry subškál PANSS (The Positive and Negative Syndrome Scale) a SANS (The Scale for the Assessment of Negative Symptoms). U nemocných žen jsme ve srovnání s muži zaznamenali nevýznamně nižší sérové koncentrace D-serinu. Pohlavní rozdíly v glutamátergní dysfunkci spojené se schizofrenií si v souvislosti s tímto nálezem zaslouží další pozornost.

Klíčová slova:
D-serin, NMDA receptor, schizofrenie, excitační aminokyseliny, glutamátergní neurotransmise.

ÚVOD

Na patofyziologii schizofrenie se podílí  dysfunkce glutamátergní neurotransmise v prefrontální kůře a limbickém systému [25]. Na souvislost glutamátergní dysfunkce se sníženou aktivitou NMDA (N-methyl-D-aspartát) receptorů u schizofrenie poukazují účinky kompetitivních antagonistů NMDA receptoru fencyklidinu a ketaminu, které u zdravých lidí způsobují rozvoj příznaků podobných schizofrenii, včetně negativních příznaků a kognitivního deficitu [13, 17]. Pro hypofunkci NMDA receptorů u schizofrenie svědčí i výsledky adjuvantní léčby jejich agonisty D-cykloserinem [4, 5, 10], glycinem [11, 14, 15] a D-serinem [12, 28].

D-serin svým koagonistickým účinkem na glycinovém modulačním místě NMDA receptoru za fyziologických podmínek moduluje glutamátergní neurotransmisi [26]. NMDA receptor je asociovaný s napěťově řízeným iontovým kanálem, jehož propustnost pro ionty závisí na vazbě ligandů na receptor. K aktivaci NMDA receptoru, otevření iontového kanálu pro sodíkové a vápníkové ionty a následné depolarizaci postsynaptického neuronu vede vazba D-serinu nebo glycinu na glycinové místo současně s vazbou glutamátu na primární vazebné místo NMDA receptoru. Ve srovnání s glycinem je vazebná potence D-serinu pro aktivaci všech podjednotek NMDA receptoru třikrát vyšší [21] a byla prokázána také až stokrát vyšší funkční účinnost D-serinu v potenciaci NMDA receptorem zprostředkované spontánní synaptické aktivity [33]. D-serin je pravděpodobně efektivnější při aktivaci kanálu spojeného s NMDA receptorem v souvislosti s rozdílným metabolismem a mechanismy transportu. Transportní systémy D-serinu jsou nízkoafinitní [25] a v porovnání s glycinem a dalšími typickými neurotransmitéry tak může D-serin zůstávat v extracelulárním prostoru v oblasti synapse delší dobu. Synaptickou koncentraci D-serinu se zatím nepodařilo stanovit [33], ale je zřejmé, že koncentrace D-serinu na synapsi je ovlivněna hlavně jeho syntézou a difuzí [25].

D-serin je v CNS syntetizován výlučně v cytosolové matrix astrocytů šedé mozkové hmoty [23, 24, 32] sekvenční konverzí z L-serinu za účasti enzymu D-serinracemázy [25, 32]. Přítomnost vyšší koncentrace D-serinu koreluje velmi úzce s distribucí NMDA receptorů v prefrontální, parietální a temporální kůře, hipokampu a striatu [6]. D-serin je metabolizován enzymem D-aminooxidázou (D-amino acid oxidase, DAAO). DAAO je peroxisomální flavoprotein, který selektivně katalyzuje oxidativní deaminaci neutrálních D-aminokyselin [23]. Přestože metabolizuje více než 90 % celkového D-serinu bez vlivu na koncentrace jiných aminokyselin, selektivně snižuje odpověď NMDA receptoru jen o 50-70 % [33].

Bendiková prokázala u nemocných schizofrenií 25% snížení koncentrace D-serinu v mozkomíšním moku a snížení poměru D-serin/L-serin [3]. Nízká koncentrace D-serinu v mozkomíšním moku u nemocných schizofrenií by mohla přímo souviset s nálezy snížené koncentrace proteinu serinracemázy ve frontální kůře a hipokampu a zvýšené koncentrace proteinu DAAO v hipokampu [3]. U nemocných schizofrenií byla prokázána také významně nižší koncentrace D-serinu v krevním séru [7, 34]. K úvahám o snížené aktivitě serinracemázy u schizofrenie vedl nález vyšší koncentrace L-serinu a celkového serinu a nižšího procentuálního zastoupení D-serinu v celkovém serinu u nemocných schizofrenií [7]. Nižší procentuální zastoupení D-serinu v celkovém serinu bylo prokázáno také v mozkomíšním moku u neléčených pacientů s první epizodou schizofrenie [9].

V adjuvantní léčbě D-serin u nemocných schizofrenií léčených antipsychotiky 2. generace zlepšoval negativní, pozitivní, kognitivní [12, 28] a depresivní příznaky [12]. Výraznější zlepšení negativních, pozitivních a kognitivních příznaků bylo spojeno se zvýšením sérové koncentrace D-serinu [28]. Klinické účinky D-serinu shrnují výsledky metaanalýzy 18 krátkodobých studií, která neprokázala jeho účinek na pozitivní příznaky a kognitivní deficit. D-serin u nemocných schizofrenií jen mírně a statisticky nevýznamně zlepšoval negativní příznaky [30].

Nálezy odlišné sérové koncentrace a specifických klinických účinků D-serinu nás vedou k předpokladu možnosti klinické a laboratorní diferenciace schizofrenních psychóz. Cílem naší studie je popis vztahu sérových koncentrací D-serinu a intenzity negativních a pozitivních příznaků hodnocených posuzovacími stupnicemi psychopatologie PANSS a SANS. Na základě výsledků výše zmíněných klinických studií jsme formulovali hypotézu negativní asociace intenzity negativních příznaků s koncentrací D-serinu v krevním séru u nemocných schizofrenií.

METODIKA

Subjekty klinické studie

Do klinické studie byli zařazeni nemocní schizofrenií starší 18 let ambulantně léčení na Psychiatrické klinice FN v Hradci Králové. U nemocných byla diagnostikována schizofrenie dle kritérií 10. revize MKN. Nejčastěji byl diagnostikován paranoidní typ schizofrenie (n=35), dále reziduální (n=7), nediferencovaný (n=5), hebefrenní (n=2) a simplexní typ (n=1). Nemocní během účasti ve studii pokračovali v léčbě indikované v rámci ambulantní péče, včetně užívání nasazených psychofarmak. 49 nemocných bylo léčeno antipsychotiky. Jedna nemocná neužívala žádná psychofarmaka, délka trvání její nemoci byla 2 roky a v době své účasti ve studii byla v klinicky stabilním stavu. Čtyři nemocní byli léčeni monoterapií antipsychotikem 1. generace, 36 nemocných užívalo v monoterapii antipsychotikum 2. generace. 5 nemocných bylo léčeno kombinací antipsychotika 1. a 2. generace, 4 nemocní kombinací dvou antipsychotik 2. generace. Charakteristiky souboru nemocných jsou shrnuty v tabulce 1. Do studie nebyli zařazeni nemocní, kteří byli v posledních 5 měsících léčeni elektrokonvulzemi, těhotné nemocné a nemocní s pozitivním nálezem v toxikologickém vyšetření moči nebo přítomností abúzu psychoaktivních látek v posledních 6 měsících. Demografické a anamnestické údaje byly získány od nemocných nebo z jejich lékařské dokumentace. Do studie nebyli zařazeni nemocní, u kterých bylo podle anamnestických údajů, podle výsledků somatického vyšetření nebo výsledků laboratorních vyšetření prokázáno neurologické nebo kardiovaskulární onemocnění nebo poruchy ledvinných funkcí.

Stanovení sérové koncentrace D-serinu

Nemocným byl ráno mezi 8.00 a 9.30 hod. po 12hodinovém lačnění proveden odběr žilní krve (cca 20 ml) k laboratornímu stanovení koncentrace D-serinu v krevním séru metodou kapalinové chromatografie (high-performance liquid chromatography, HPLC). Pro přípravu mobilní fáze byl použit metanol, kyselina octová (Penta, ČR), octan sodný bezvodý (Sigma-Aldrich, Německo) a NaOH (Kulich, ČR). Derivatizační činidla byla připravena z N-acetyl-L-cysteinu (NAC), 3-merkaptopropionové kyseliny (MPA), o-ftaldialdehydu (OPA) (Sigma-Aldrich, Německo), kyseliny borité a metanolu (Penta, ČR). Po deproteinaci metodou ultrafiltrace pomocí kolonek Microcon – 10 kDa, 0,5 ml (Millipore, USA) byly vzorky uchovávány při teplotě -20 °C. Chromatografická analýza byla realizována na systému HPLC typ LC-10A vp (Shimadzu, Japonsko). Chromatografická separace byla provedena v režimu gradientové eluce v systému reverzní fáze. Pro stanovení D-serinu bylo jako mobilní fáze použito 0,21 μmol/l octanového pufru o hodnotě pH 5,6 (A) a metanol (B) [36]. Separace byla prováděna na dvou sériově zapojených kolonách 250x4 mm Lichrospher RP-18e o velikosti částic náplně 5 μm (Merck, Německo). Signál byl detekován pomocí fluorescenčního detektoru (emisní vlnová délka 454 nm a excitační vlnová délka 337 nm) [19, 31, 36]. Reprodukovatelnost byla 4,54%, bias 1,58%, limit detekce byl stanoven na 0,27 μmol/l .

Vyšetření psychopatologie

Nemocní byli psychiatricky vyšetřeni do 4 hodin po odběru krevního vzorku na stanovení sérové koncentrace D-serinu. Psychopatologie byla hodnocena pomocí posuzovacích stupnic PANSS (The Positive and Negative Syndrome Scale; 30 položek, skór 1-7) [16] a SANS (The Scale for the Assessment of Negative Symptoms; 30 položek, skór 0-5) [1]. Vyšetření klinického stavu nemocných a hodnocení psychopatologie bylo provedeno jedním specializovaným psychiatrem se zkušeností s aplikací hodnotících škál.

Statistické hodnocení

Pro jednotlivé soubory dat a skórů byl stanoven průměr, směrodatná odchylka, medián a rozpětí hodnot. Vzhledem k nenormálnímu rozložení dat byly ke stanovení asociací jednotlivých proměnných použity neparametrické Spearmanovy korelační koeficienty. Ke stanovení rozdílů hodnot proměnných mezi oběma pohlavími byl použit t-test a v případě nenormálního rozložení dat neparametrický Mann-Whitney U test. Zvolená hladina významnosti byla α = 0,05. Asociace hodnot sérových koncentrací D-serinu s hodnotami skórů posuzovacích stupnic psychopatologie u obou pohlaví jsou prezentovány pomocí bodových grafů (scatter plot) s regresními přímkami (obr. 1, obr. 2).

Etické aspekty

Nemocní byli seznámeni na úrovni odpovídající jejich vzdělání a rozumové úrovni s obsahem a záměrem výzkumu a podepsali informovaný souhlas se vstupem do klinické studie. Informovaný souhlas a protokol studie byly schváleny Etickou komisí Fakultní nemocnice Hradec Králové, Lékařské fakulty v Hradci Králové a Vojenské lékařské akademie JEP v Hradci Králové.

VÝSLEDKY

Do klinické studie bylo zařazeno 50 nemocných trpících schizofrenií (průměr ± SD věk, 35,1 ± 11,1 roků; 33 mužů a 17 žen) (tab. 1). Metodou HPLC jsme u nemocných stanovili koncentrace D-serinu v krevním séru (průměr ± SD, 3,30 ± 1,53 μmol/l). Výsledky klinického hodnocení, včetně hodnocení psychopatologie pomocí posuzovacích stupnic PANSS a SANS u nemocných schizofrenií, jsou shrnuty v tabulce 2.

Hodnota sérové koncentrace D-serinu (medián, 2,75 μmol/l) nesouvisela s věkem nemocných (medián, 31,5 roků) (r = - 0,07, p = 0,64, Spearmanův korelační koeficient), dobou trvání jejich nemoci (medián, 6 roků) (r = 0,13, p = 0,36) ani s dávkou užívaných antipsychotik vyjádřenou chlorpromazinovým ekvivalentem (medián, 200 mg) (r = 0,23, p = 0,10).

U nemocných jsme neprokázali vztah mezi hodnotou koncentrace D-serinu v séru a hodnotami celkového skóru PANSS (r = 0,01, p = 0,93), skóru subškály pozitivních příznaků PANSS (P1-P7) (r = 0,08, p = 0,60), skóru subškály negativních příznaků PANSS (N1-N7) (r = 0,02, p = 0,89) a skóru subškály všeobecné psychopatologie PANSS (G1-G16) (r = 0,01, p = 0,94). S koncentrací D-serinu v séru neasociovala intenzita negativní symptomatiky hodnocená celkovým skórem škály SANS (r = - 0,08, p = 0,58), neprokázali jsme ani souvislost s hodnotami skórů subškál citové oploštělosti (r = - 0,003, p = 0,98), alogie (r = - 0,16, p = 0,27), abulie a apatie (r = - 0,04, p = 0,76), neschopnosti prožitku a nespolečenskosti (r = - 0,15, p = 0,29) a skóru subškály zájmu a pozornosti (r = 0,07, p= 0,65).

U skupiny nemocných žen jsme prokázali statisticky nevýznamně (p>0,05, Mann-Whitney U test) nižší koncentrace D-serinu (medián, 2,46 μmol/l) ve srovnání se skupinou mužů (medián, 2,91 μmol/l). Rozdíly hodnot mezi skupinami nemocných mužů a žen jsou shrnuty v tabulce 3. U nemocných mužů jsme zaznamenali jen nevýznamnou lineární souvislost mezi hodnotou sérové koncentrace D-serinu a hodnotou celkového skóru PANSS (r = 0,20, p = 0,26) (obr. 1), u žen nevýznamnou inverzní korelaci hodnoty koncentrace D-serinu v séru s hodnotou celkového skóru PANSS (r = -0,35, p = 0,16) (obr. 1) a celkového skóru SANS (r = -0,30, p = 0,24) (obr. 2). Hodnoty sérových koncentrací D-serinu u skupiny mužů a skupiny žen nekorelovaly s hodnotami skórů subškál stupnic PANSS a SANS.

DISKUSE

V klinické studii se nám u souboru 50 nemocných schizofrenií nepodařilo prokázat vztah mezi sérovou koncentrací D-serinu a intenzitou negativních příznaků. Sérová koncentrace D-serinu neasociovala ani s intenzitou pozitivních příznaků. V hodnotách sérových koncentrací D-serinu jsme zaznamenali určité pohlavní rozdíly. U nemocných žen, které měly ve srovnání s muži nevýznamně nižší sérovou koncentraci D-serinu, jsme zjistili negativní asociaci hodnoty sérové koncentrace D-serinu s intenzitou psychopatologie hodnocené celkovým skórem škály PANSS a intenzitou negativních příznaků hodnocených celkovým skórem SANS. Asociace těchto proměnných byly ale jen mírné a statisticky nevýznamné, stejně tak jako vztah sérové koncentrace D-serinu a intenzity psychopatologie hodnocené celkovým skórem škály PANSS u mužů (obr. 1, obr. 2). Rozdíly sérových koncentrací D-serinu ve vztahu k pohlaví nebyly zatím v klinických studiích u nemocných schizofrenií testovány. Tomiya prokázal u mužů nemocných schizofrenií významně zvýšené sérové koncentrace celkového serinu [27]. Koncentrace D-serinu nebyly u nemocných v této studii stanovovány. Rozdíly sérových koncentrací aminokyselin u mužů a žen nemocných schizofrenií mohou být způsobeny pohlavními odlišnostmi hormonálních profilů. Pohlavní rozdíly v dysfunkci glutamátergní neurotransmise spojené se schizofrenií jsou tak zajímavým tématem pro další výzkum.

Hypotézu negativní asociace hodnoty sérové koncentrace D-serinu a intenzity negativní symptomatiky jsme formulovali na základě nálezů snížených koncentrací D-serinu v krevním séru [7, 34] a v mozkomíšním moku [3, 9] u nemocných schizofrenií a klinického účinku adjuvantní léčby D-serinem na negativní příznaky [30]. Tuto hypotézu jsme nepotvrdili a je otázkou, zdali je sérová koncentrace D-serinu vhodným biochemickým markerem funkční úrovně glutamátergního systému v CNS. V CNS je endogenní D-serin syntetizován výlučně v astrocytech šedé mozkové hmoty [23, 24, 32], ale kromě CNS se ve velmi nízkých koncentracích vyskytuje i v krevním séru, slinách a moči. Syntéza D-serinu může u savců probíhat i v periferních tkáních [6]. Pravděpodobným zdrojem D-serinu jsou játra, protože jen hepatocyty jako další buňky vedle astrocytů exprimují významné koncentrace serinracemázy [25]. Některé periferní tkáně (např. magakaryocyty, osteoklasty) exprimují NR1 podjednotku NMDA receptoru, se kterou D-serin interaguje. Transport D-serinu v periferních tkáních probíhá prostřednictvím exchangerů nebo transportérů a z organismu se odstraňuje ledvinami [25]. Vztah mezi sérovou koncentrací D-serinu a dysfunkcí glutamátergní neurotransmise jako patogenetického faktoru schizofrenie předpokládá souvislost mezi poolem D-serinu v CNS a v periferních tkáních. Také klinický účinek adjuvantní léčby D-serinem na negativní a pozitivní příznaky u nemocných schizofrenií léčených antipsychotiky [12, 28, 30] závisí na průchodu periferně podaného D-serinu přes hematoencefalickou bariéru (HEB). Mechanismy transportu D-serinu přes HEB nebyly dosud zcela objasněny. Transport přes HEB je u neutrálních AMK limitován [6]. D-serin prochází HEB lépe než glycin [22, 28, 33] a ve větším množství proniká do CNS i ve srovnání s L-serinem. Hlavní transportní mechanismus D- a L-serinu v HEB je zajišťován na Na⁺ nezávislým transportním systémem [35], ale u D-serinu byl prokázán i preferenční stereoselektivní transport [2]. Souvislost mezi poolem D-serinu v periferii a CNS a možnost transportu přes HEB prokazují výsledky studií na hlodavcích. Po intraperitoneálním podání D-serinu dochází u krys ke změnám koncentrací D-serinu ve všech periferních tkáních a ve všech oblastech CNS [8]. Je tedy velmi pravděpodobné, že existuje vztah mezi koncentrací D-serinu v krevním séru a v CNS. Sérová koncentrace D-serinu by tak mohla být vhodným markerem funkční úrovně glutamátergní neurotransmise v CNS.

Zdrojem naší hypotézy byly důkazy pozitivního klinického účinku adjuvantní léčby D-serinem v některých klinických studiích [12, 28, 30]. Výsledky studií testujících účinky D-serinu ale nejsou jednotné [20, 29, 30] a jejich rozdíly mohou být způsobeny odlišnostmi v délce trvání jednotlivých studií, malými soubory nebo zařazováním nemocných s rezistentní schizofrenií. Přestože augmentace D-serinem vedla ke zvýšení jeho sérových koncentrací i u nemocných schizofrenií léčených klozapinem [29] a risperidonem [20], nedošlo u nich ke zlepšení schizofrenní symptomatiky. Neúčinnost D-serinu u nemocných léčených klozapinem může souviset s parciálně agonistickým nebo agonistickým účinkem klozapinu na NMDA receptorech.

Výsledky naší studie mohou být vzhledem k velmi nízké fyziologické koncentraci D-serinu v krevním séru ovlivněny senzitivitou metody jeho stanovení. Metoda stanovení D-serinu použitá v naší studii (HPLC) byla stejná a také velikost našeho souboru nemocných byla podobná ve srovnání s použitou metodou a velikostí souborů testovaných v klinických studiích, které byly zdrojem naší hypotézy [7, 34]. Negativní výsledky naší studie mohou tak být ovlivněny odlišnými charakteristikami populace nemocných, účinky antipsychotické medikace nebo dietními návyky. Do naší studie byli zařazeni nemocní v ambulantní péči, kteří byli léčeni převážně antipsychotiky 2. generace a z klinického hlediska byli ve stabilním stavu nevyžadujícím hospitalizaci. Hashimoto do své studie zařadil nemocné, jejichž stav vyžadoval hospitalizaci [7]. Rozdíly v sérových koncentracích D-serinu mezi skupinou antipsychotiky léčených a neléčených nemocných schizofrenií nezjistil a v souhlase s našimi výsledky také nenalezl souvislost sérové koncentrace D-serinu s dávkou antipsychotika vyjádřenou chlopromazinovým ekvivalentem [7]. Vliv farmakoterapie na naše výsledky ale přesto nelze vyloučit. Koncentrace aminokyselin v krevním séru by mohla být ovlivněna jejich příjmem v potravě. Stejně tak jako v klinických studiích, ve kterých odběru nalačno žádná dietní opatření nepředcházela [7, 34], jsme v naší studii vzorek krve odebírali ráno po nočním 12hodinovém lačnění. Průměrné sérové koncentrace D-serinu se u nemocných v naší studii pohybovaly v mezích laboratorních referenčních hodnot a byly ve srovnání s hodnotami zjištěnými stejnou metodou (HPLC) bez předchozí speciální diety a v podobně velkém souboru nemocných [7] nižší.

Objasnění rozdílů v nálezech sérových koncentrací D-serinu má u nemocných schizofrenií velký praktický význam vzhledem k perspektivě léčby agonisty NMDA receptorů. Pro poznání role dysfunkce glutamátergního systému v patogenezi schizofrenie je důležité stanovení biochemických markerů funkční úrovně tohoto systému v CNS. Hledání vztahu sérových koncentrací excitačních aminokyselin ke specifickým psychopatologickým dimenzím umožní laboratorní a klinickou diferenciaci schizofrenních psychóz. Předpokládáme, že stanovení biochemických a klinických profilů povede k identifikaci specifických subtypů schizofrenie. Formulování takové typologie umožní cílenou léčbu na ovlivnění glutamátergní dysfunkce v CNS.

Klinická studie je realizována za finanční podpory výzkumného záměru MSM 0021620816.

MUDr. Jaromír Hons

Psychiatrická klinika LF UK a FN

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

e-mail: honsj@lfhk.cuni.cz