Cílené tlumení exprese genu PCNA pomocí siRNA v leukemických buněčných liniích


Specific Silencing of PCNA Gene Expression in Leukemic Cell Lines Using siRNA

Background.
Increased expression of PCNA gene was detected in chronic myeloid leukemia (CML) patients in our laboratory. The gene may participate in the disease development. The aim of the study was to develop appropriate conditions for PCNA-siRNA transfection into K562 and MOLM-7 cell lines (which both have the up-regulated PCNA gene) and to silence the increased expression. 

Methods and Results.
Key parameters of successful siRNA delivery into the cells are type and quantity of transfection reagent, cells and siRNA concentration or cultivation time before an expression analysis. Transfection reagents ExGene 500 (Fermentas), Metafectene (Biontex), Oligofectamine (Qiagen) and siPORT Amine (Ambion) were tested. Transfection efficiency was monitored by fluorescence microscopy of fluorescein labeled siRNA. Gene silencing was determined at mRNA level by real-time PCR and at protein level by western blots. As the most suitable reagent was chosen Oligofectamine, which achieved 70% decrease of PCNA mRNA level. Further, 50 nM siRNA concentration, 1x10⁶ cells/ml and amount of Oligofectamine 4 μl per 1 ml of transfected cells were selected. The best cultivation time after siRNA delivery was 48 h. 

Conclusions.
Based on the results of this study, transfection method for siRNA delivery into the K562 and MOLM-7 cell lines was proposed. The procedure can be transferred also on further selected genes potentially involved in CML and afterwards it will be possible to monitor the impact of siRNA-inhibition on expression profile. In the future siRNAs against some over-expressed genes would be used for gene therapy of CML. 

Key words:
siRNA, chronic myeloid leukemia, PCNA, gene expression.


Autoři: M. Merkerová ;  H. Bruchová ;  R. Brdička
Působiště autorů: Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha
Vyšlo v časopise: Čas. Lék. čes. 2005; 144: 472-475
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Východisko.
U pacientů s chronickou myeloidní leukémií jsme detekovali zvýšenou hladinu exprese genu PCNA, který by se potenciálně mohl podílet na rozvoji onemocnění. Cílem této práce bylo nalézt vhodné podmínky pro transfekci molekul PCNA-siRNA do buněčných linií K562 a MOLM-7 s up-regulovaným PCNA a zvýšenou expresi tlumit. 

Metody a výsledky.
Klíčovými parametry úspěšného vnášení siRNA do buněk jsou typ a množství transfekčního činidla, koncentrace buněk a vnášené siRNA nebo doba inkubace transfekovaných buněk před analýzou exprese. Byla testována tato činidla: ExGene 500 (Fermentas), Metafectene (Biontex), Oligofectamine (Qiagen) a siPORT Amine (Ambion). Účinnost transfekce siRNA značených fluoresceinem byla sledována pomocí fluorescenční mikroskopie. Míra potlačení genové exprese na úrovni mRNA byla stanovována pomocí RT-PCR v reálném čase a na proteinové úrovni metodou western blotů. Jako nejvhodnější byl pro další pokusy vybrán Oligofectamine, pomocí kterého bylo dosaženo 70% poklesu hladiny mRNA genu PCNA. Dále byla zvolena 50 nM koncentrace siRNA, 1x10⁶ buněk/ml a množství Oligofectaminu 4 μl/1ml transfekovaných buněk. Nejvhodnější doba kultivace buněk po transfekci byla 48 hodin. 

Závěry.
Na základě výsledků této práce byl navržen protokol pro vnášení siRNA do buněčných linií K562 a MOLM-7. Tuto techniku lze přenést i na další geny potenciálně přispívající k CML a sledovat dopad siRNA-inhibice genů na expresní profil takto ovlivněných buněk. siRNA proti některým z over-exprimovaných genů by navíc mohly být v budoucnu využity pro genovou terapii CML. 

Klíčová slova:
siRNA, chronická myeloidní leukémie, PCNA, genová exprese.


Štítky
Adiktologie Alergologie a imunologie Angiologie Audiologie a foniatrie Biochemie Dermatologie Dětská gastroenterologie Dětská chirurgie Dětská kardiologie Dětská neurologie Dětská otorinolaryngologie Dětská psychiatrie Dětská revmatologie Diabetologie Farmacie Chirurgie cévní Algeziologie Dentální hygienistka

Článek vyšel v časopise

Časopis lékařů českých


Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Jistoty a nástrahy antikoagulační léčby aneb kardiolog - neurolog - farmakolog - nefrolog - právník diskutují
nový kurz
Autoři: doc. MUDr. Štěpán Havránek, Ph.D., prof. MUDr. Roman Herzig, Ph.D., doc. MUDr. Karel Urbánek, Ph.D., prim. MUDr. Jan Vachek, MUDr. et Mgr. Jolana Těšínová, Ph.D.

Léčba akutní pooperační bolesti
Autoři: doc. MUDr. Jiří Málek, CSc.

Nové antipsychotikum kariprazin v léčbě schizofrenie
Autoři: Prof. MUDr. Cyril Höschl, DrSc., FRCPsych.

Familiární transthyretinová periferní polyneuropatie
Autoři: MUDr. Radim Mazanec, Ph.D.

Diabetes mellitus a kardiovaskulární riziko, možnosti jeho ovlivnění
Autoři:

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se