Gen MYC a jeho abnormality se zaměřením na agresivní B-buněčné lymfomy

Obr. 1. Struktura genu MYC a proteinu Myc. V horní části obrázku je znázorněn lokus genu MYC na chromozomu 8. Ve střední části je schematicky znázorněna organizace genu: FUSE, NHE III1 – sekvence regulující transkripci MYC formou nekanonických struktur DNA; P0, P1, P2, P3 – promotory. V dolní části je zobrazeno uspořádání domén hlavního proteinového produktu Myc o délce 439 aminokyselin. S těmito doménami interaguje řada proteinů, které regulují aktivitu a stabilitu Myc: TAD – N-terminální transkripční doména; DBD – DNA vazebná doména; MBI, MBII, MBIII, MBIV – Myc boxy, slouží k regulaci transkripce, degradace Myc a apoptózy; PEST – centrální segment bohatý na zbytky prolinu, kyseliny glutamové, serinu a treoninu, nezbytný pro rychlou degradaci Myc; CAPN – místo pro štěpení calpainem, slouží k inaktivaci Myc; NLS – jaderná lokalizační sekvence; bHLHZL – domény C-terminální vazebné oblasti: basic, helixloop-helix, leucine zipper. Převzato z Lavinia A, et al. Int J Mol Sci. 2018;20:120; užití v souladu s CCL 4.0: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/; na obrázku nebyly provedeny žádné změny.

Obr. 2. Prostorová struktura Myc a Max v komplexu s DNA. Převzato ze Seyed EA, et al. J Hematol Oncol. 2021;14:121; užití v souladu s CCL 4.0: https://creativecommons.org/licenses/ by/4.0/; na obrázku nebyly provedeny žádné změny.

Vzhledem k funkci proteinu Myc jako transkripčního faktoru, je jeho lokalizace soustředěna především do jádra buněk. mechanizmů je pravděpodobně klíčovým okamžikem ve vývoji jak B-buněčných lymfomů, tak řady dalších nádorových onemocnění.

STRUKTURA

A FYZIOLOGICKÁ FUNKCE GENU MYC

Gen MYC je lokalizován na dlouhém rameni chromozomu 8 v pruhu q24.21 a je tvořen třemi exony. Exon 1 je nekódující, exony 2 a 3 kódují protein Myc (obr. 1). K zahájení transkripce slouží 4 různé promotory, převážná většina MYC mRNA je ve fyziologických buňkách přepisována z promotoru P2. Hlavním produktem je protein Myc o velikosti 64kDa s motivem základního helix-loop-helix leucinového zipu, který vytváří heterodimer s proteinem Max a společně formují DNA vazebnou doménu se selekční aktivitou pro DNA sekvenci CACGTG (tzv. E-box; obr. 2), která aktivuje transkripci cílových genů [3]. Myc se váže na různá místa v genomu se širokou škálou afinity. K sekvencím obsahujícím E-box se váže s nižší afinitní vazbou k nekanonickým sekvencím i mimo vazebnou doménu [4]. Myc funguje jako univerzální zesilovač v buňkách již exprimovaných genů, kde zvyšuje výkon všech aktivních promotorů.

Míru jeho exprese lze sledovat pomocí standardního imunohistochemického (IHC) barvení. Ve fyziologické lymfoidní tkáni (lymfatické uzliny, tonzily, thymus, slezina) se obvykle pohybuje v rozmezí od 1 % do 25 % pozitivních B-lymfocytů. Distribuce Myc pozitivních buněk v takovéto tkáni nesouvisí s žádným specifickým kompartmentem nebo strukturou orgánu, jsou rozptýleny mezi buňkami germinálního centra, stejně jako v interfolikulárních oblastech [8].

Fyziologickou funkcí proteinu Myc je koordinace a regulace různých vnitrobuněčných i mimobuněčných programů potřebných pro správný růst a expanzi somatických buněk, je nezbytný i pro vývoj hematopoetických kmenových buněk [9]. Protein Myc plní za normálních okolností také proapoptickou funkci a představuje tak účinnou buněčnou autonomní bariéru proti vzniku nádorů navzdory mitogenní signalizaci [10]. Myc spouští řadu vnitřních nádorových supresorových programů, které slouží k omezení vlastního onkogenního potenciálu (fenomén tzv. vnitřní nádorové suprese). Prahová hladina Myc potřebná k aktivaci apoptózy je nastavena výše než hladina potřebná k zahájení buněčné proliferace, což umožňuje zdravým buňkám proliferovat v reakci na fyziologickou signalizaci a zároveň udržuje účinnou bariéru proti zvýšené (tj. onkogenní) expresi [11]. Narušení rovnováhy mezi udržováním fyziologické hladiny Myc a geny regulujícími odpověď buňky na poškození a apoptózu je pravděpodobně klíčovým faktorem při vývoji MYC-asociovaných nádorových onemocnění. Nádorové buňky se v důsledku deregulace signálních drah (např. v důsledku zvýšené exprese antiapoptoticky působícího proteinu Bcl2) mohou vymknout z vnitrobuněčné kontroly a ani přes zvýšené hladiny proteinu Myc u nich k apoptóze nedochází. Deregulace genu MYC spojená se zvýšenou expresí proteinu Myc byla prokázána u celé řady nádorových onemocnění [12].

DEREGULACE MYC U NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ

Aktivující mutace v kódující sekvenci genu MYC jsou popsány jen vzácně. K deregulaci dochází prostřednictvím nadměrné konstitutivní exprese intaktního proteinu Myc, která je navozena jedním ze tří hlavních mechanizmů: inzerční mutagenezí, genovou amplifikací a chromozomovou translokací/přestavbou.

Inzerční mutageneze

Deregulace genu MYC prostřednictvím inzerční mutace virového zesilovače (enhancer) je mechanizmem vedoucím k nádorovým změnám u aviární leukózy. Aviární leukóza je nádorové onemocnění postihující zejména ptáky a je způsobena aviárním leukózním virem (z rodiny retrovirů), který integruje svůj genetický materiál do hostitelské DNA. Virová DNA obsahuje specifický enhancer, který je schopen se inzertovat do blízkosti genu MYC a navodit jeho nadměrnou expresi, jež vyvolá abnormální proliferaci buněk a indukuje jejich leukemickou transformaci. Práce zabývající se touto tematikou se staly v 80. letech 20. století vůbec prvními publikacemi popisujícími souvislost deregulace MYC se vznikem nádorového onemocnění [13–15]. Aktivace MYC prostřednictvím virového zesilovače je silně onkogenní a představuje hlavní příčinu vzniku nádorového onemocnění. Přímá inzerce virového zesilovače do blízkosti genu MYC u člověka není obvyklá, ačkoli mechanizmus aktivace MYC virovými sekvencemi nebo onkogenními mechanizmy v důsledku virové integrace do lidského genomu je popsaný. Např. integrace sekvencí DNA lidského papilomaviru (HPV) do oblasti lokusu 8q24 byla prokázána až u 10 % nádorů pohlavních orgánů asociovaných s HPV. Ve většině takových případů dochází k aktivaci MYC, která se projeví podporou růstu nádoru [16].

Genová amplifikace

Deregulace navozená amplifikací (počet kopií genu ≥ 5) je typická především pro agresivní formy solidních nádorů, méně často se nachází u B-buněčných lymfoproliferativních onemocnění. Vyskytuje se nejčastěji u serózního karcinomu vaječníků, karcinomu jícnu, spinocelulárního karcinomu plic, karcinomu dělohy, adenokarcinomu žaludku a plic a dalších [17]. Ačkoli je genová amplifikace MYC považována za zjevnou známku deregulace MYC v buňce, mechanizmus, kterým tato alterace řídí onkogenezi, není zcela jasný. Nejjednodušším vysvětlením je, že amplifikace MYC vede ke zvýšení hladiny mRNA a proteinu Myc a tato zvýšená hladina je dostatečná ke spuštění proliferačního a onkogenního programu buňky. Amplifikace genu MYC však nemusí vždy korelovat se zvýšenou hladinou mRNA nebo proteinu Myc. Např. u B-buněčných lymfomů zvýšení počtu kopií genu MYC jednoznačně ovlivňuje hladinu proteinu Myc pouze v případech, kdy je počet kopií genu hodnocen jako mimořádně vysoký (nepočitatelné množství) [18,19].

Chromozomové translokace/

přestavby lokusu MYC

Deregulace exprese MYC prostřednictvím chromozomových translokací pozorujeme u několika typů hematologických malignit, a to zejména B-buněčného původu. Translokace MYC s jedním z imunoglobulinových (IG) genů je diagnostickým kritériem pro Burkittův lymfom (BL). Přestavba genu MYC se vyskytuje také u 10–15 % případů mnohočetného myelomu a 8–14 % případů difuzního velkobuněčného B-lymfomu (DLBCL) / high-grade B-buněčného lymfomu (HGBL) a definuje pacienty s vysokým rizikem [20,21]. Vzácně je přítomna u chronické lymfocytární leukéemie a může doprovázet vznik Richterovy transformace [22], velmi výjimečně se vyskytuje i u T-buněčných malignit [23].

Přestavby genu MYC vznikají prostřednictvím aberantní aktivity fyziologických mechanizmů zodpovědných za vytváření protilátkové diverzity a afinity v germinálním centru lymfatické uzliny [24,25]. Translokace jsou obvykle reciproké, k výměně materiálu dochází po vzniku dvouřetězcových zlomů na chromozomech vyvolaných enzymem AID (aktivací indukovaná cytidin deamináza) [25]. Místa zlomu v oblasti 8q24 jsou velmi variabilní [24,26,27]. Následuje ligace úseků nejčastěji prostřednictvím nehomologního spojení konců. Do translokací se zapojuje celé spektrum různých partnerských genů [27–29]. Mezi rekurentní translokační partnery genu MYC patří IG geny, a to jak gen pro těžké IG řetězce (IGH), tak geny kódující lehké IG řetězce kappa (IGK) a lammito non-IG partnery nacházejí častěji v místech přiléhajících k 3’konci genu MYC, méně často v místech přiléhajících k 5’MYC.

Obr. 3. Translokační partneři genu MYC a jejich pozice v genomu. Síla čáry, která spojuje translokační partnery, znázorňuje četnost jejich výskytu. Upraveno dle [24].

Míra deregulace exprese prostřednictvím translokace genu MYC a výsledná hladina proteinu Myc významně závisejí na typu translokačního partnera a jeho transkripční aktivitě. Vysoká míra exprese Myc byla prokazatelně častěji pozorována u B-buněčných lymfomů s translokací MYC/IG [27,33]. Na příkladu BL lze pozorovat silnou korelaci mezi přestavbou MYC s IG geny a produkcí proteinu Myc, což se typicky projevuje intenzivním Myc IHC barvením většiny nádorových buněk [8]. Blízkost IG lokusu s vysokou transkripční aktivitou v B-lymfocytech navodí silnou expresi proteinu Myc. U B-buněčných lymfomů s přestavbou MYC/non-IG dosahuje úroveň exprese Myc proteinu u konkrétních translokačních partnerů různých hladin. Např. v případech s translokací MYC/BCL6 a MYC/PAX5 jsou hladiny Myc proteinu stejně vysoké jako v případech s translokací MYC/IG [29]. U ostatních translokací MYC/non-IG byla zaznamenaná výrazně nižší míra exprese. Důvobda (IGL). Tyto translokace spojují celou kódující sekvenci genu MYC se sekvencemi zesilovače transkripce IG genů. Architektura přestavby genu MYC s geny pro lehké a těžké IG řetězce se značně liší v závislosti na postavení regulačních oblastí a zesilovačů transkripce IG genů. Zlom na chromozomu 8 typický pro t(8;14)(q24;q32) nejčastěji vzniká v oblasti od 5’konce MYC směrem k centromeře, asi ~1,5kb před místem začátku transkripce až po konec intronu 1. Celá kódující oblast genu MYC se tak dostává pod kontrolu regulačních sekvencí IGH na chromozomu 14. Naopak v případě t(2;8)(p12;q24) a t(8;22) (q24;q11) dochází ke zlomu v místech až 600 kb od 3’oblasti MYC směrem k telomeře a regulační sekvence IGK, respektive IGL, jsou přemístěny do blízkosti genu MYC na chromozomu 8. Většina zlomů v oblasti 8q24 leží relativně blízko genu MYC, nicméně byly identifikovány i zlomy vzdálené až několik Mb od 5’ nebo 3’ MYC [24,27]. Translokace t(8;14) (q24;q32) zahrnující gen těžkého imunoglobulinového řetězce (IGH) a gen MYC byla poprvé pozorována u BL [30]. IGH je nejčastějším translokačním partnerem genu MYC pozorovaným v přibližně 70–80 % případech BL, ve zbývajících případech vstupují do translokace geny pro lehké imunoglobulinové řetězce IGK nebe IGL [31].

U ostatních agresivních B-buněčných lymfomů s přestavbou MYC (DLBCL/HGBL) vstupuje do translokace s genem MYC v polovině případů IG partner, druhou polovinu představují translokace s non-IG geny [24,29,32]. Mezi ně patří celá řada genů a regulačních oblastí napříč celým genomem, např. geny BCL6, PAX5, IRAG2, RFTN1, ZCCHC7, SOCS1, CD96, BCL11, IKAROS a další (obr. 3) [24,27,29]. Zlomy v oblasti 8q24 se v případě translokace MYC s tědem může být to, že regulační oblasti ně- kterých non-IG genů pravděpodobně nemají tak vysoký transkripční potenciál [27,29]. Výsledné množství proteinu Myc proto nepřesáhne nebo jen slabě přesáhne hranici, od které je vzorek považován dle imunohistochemie za pozitivní. Přestavba genu MYC je u DLBCL spojená s významně kratším přežíváním pacientů a agresivnější formou onemocnění [21,32,33]. Deregulace MYC prostřednictvím některého z IG-genů je negativním prognostickým faktorem, zatímco deregulace navozená prostřednictvím non-IG genů obecně není indikátorem nepříznivé prognózy [32,33]. Vliv konkrétních non-IG genů na délku přežití ale zatím vyhodnocen nebyl, zejména kvůli malým počtům jednotlivých případů.

Diagnostický význam přestavby genu MYC u B-buněčných lymfomů byl definován v 5. revizi WHO klasifikace lymfoidních neoplazií z roku 2022 (WHO-HAEM5). V rámci klasifikace agresivních B-buněčných lymfomů byl navržen algoritmus, který definuje jednotlivé kategorie na základě kombinace morfologických znaků a genetických změn (obr. 4) [34].

Přestavba genu MYC byla identifikována jak u lymfomů s původem z buněk germinálního centra, tak u lymfomů vzniklých z postgerminálních buněk. Ve skupině B-buněčných lymfomů s DLBCL morfologií se dle buněčného původu rozlišují tři subtypy: GCB-DLBCL (vycházející z buněk germinálního centra), ABC-DLBCL (vznikající z aktivovaných B--lymfocytů) [35] a třetí malou skupinu tvoří případy, které nesplňují kritéria zařazení ani do jedné ze skupin a jsou označovány jako neklasifikovatelné [36]. V podskupině GCB-DLBCL jsou téměř výhradně zastoupeny případy s přestavbou MYC a BCL2, zatímco přestavba genu MYC a BCL6 je ve větší míře popisována u ABC-DLBCL [37]. Navíc v podskupině ABC-DLBCL byla výrazně častěji pozorována zvýšená exprese MYC, která nebyla asociována s žádnou strukturní variantou genu, a naznačuje tedy přítomnost alternativních mechanizmů, které řídí expresi MYC u tohoto subtypu [18].

B-buněčné lymfomy s přestavbou genu MYC a BCL2 jsou známé také jako lymfomy s dvojím zásahem (double hit s konkrétním translokačním partnerem, kterým může být jak IG gen, tak non-IG partner. Podmínkou pro zařazení této skupiny je současná přítomnost přestavby genu BCL2, případně přestavby BCL2 i BCL6. Přestavba genu MYC se může vyskytnout i ve skupinách DLBCL NOS nebo HGBL NOS. Jde o případy přestavby genu MYC s IG i non-IG geny, anebo případy s přestavbou genu MYC a zároveň přestavbou genu BCL6. Převzato z [34]; užití v souladu s CCL 4.0: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/; na obrázku nebyly provedeny žádné změny. R – přestavba; G – germinální uspořádání; IG::MYC – translokace genu MYC k lokusu genu pro imunoglobulinový řetězec; DLBCL, NOS – difuzní velkobuněčný B-lymfom, blíže nespecifikovaný; HGBL, NOS – high-grade B-buněčný lymfom, blíže nespecifikovaný; HGBL-11q – high-grade B-buněčný lymfom s aberacemi 11q.

Obr. 4. Algoritmus pro klasifikaci agresivních B-buněčných lymfomů podle WHO-HAEM5. Přestavba genu MYC s jedním s IG genů je diagnostickým kritériem BL, a to na pozadí buněk různé morfologie. Další klasifikační podjednotkou, která je také definována přítomností přestavby genu MYC je DLBCL/HGBL s přestavbou genů MYC a BCL2. Na rozdíl od BL není přestavba genu MYC spojována DH), popřípadě s trojím zásahem (triple hit, TH), pokud je současně přítomna i přestavba genu BCL6. Představují asi 3–8 % případů všech DLBCL/HGBL. Kombinace antiapoptotického působení genu BCL2 společně s proliferačním působením genu MYC se ve výsledku vyznačuje zvláště agresivním průběhem choroby. Navzdory variabilní morfologii tvoří tyto případy relativně homogenní skupinu se shodnými biologickými znaky a genovou expresí, a byly proto vyčleněny do samostatné klasifikační podjednotky DLBCL/HGBL-MYC/BCL2 [34].

Alternativní způsoby deregulace MYC

U některých nádorů byla zaznamenána nadměrná exprese proteinu Myci při absenci přímého zásahu samotného genu MYC. Tu může navodit aberantní aktivace signálních drah, jako je např. Wnt/�-Catenin u kolorektálního karcinomu [38], aktivace NOTCH1 signalizace a ztráta funkce PTEN u akutní T-lymfoblastické leukémie [39,40] nebo aktivace JAK/STAT u chronické myeloidní leukémie [41,42]. Na zvýšení hladiny Myc v buňce se mohou podílet i změny v posttranskripčních mechanizmech, např. mutace v komponentách ubikvitin ligázy spojená se snížením degradace proteinu Myc [43] nebo zvýšená aktivita Ras-dráhy, která vede k fosforylaci proteinu Myc, a tím umožňuje jeho stabilizaci a akumulaci [44]. Navození vysoké exprese Myc také souvisí s dlouhým nekódujícím RNA genem PVT1, který se nachází v těsné blízkosti genu MYC. Gen

PVT1, který je až v 98 % případů amplifikován společně s MYC, zprostředkovává pomocí pozitivní zpětné vazby vysokou expresi MYC mRNA [45]. Vyšší hladiny MYC mRNA byly popsány i v souvislosti s mutací genu TP53, která velmi často doprovází amplifikaci genu MYC [46].

Současné zvýšení exprese Myc a Bcl2, které nesouvisí s chromozomovými přestavbami, je popsáno u přibližně 20–30 % DLBCL/HGBL [47]. Tyto případy se nazývají double expressor (DE) lymfomy, ale vzhledem k heterogenitě jejich molekulárního pozadí a mechanizmů navozujících zvýšenou expresi Myc a Bcl2 netvoří žádnou konkrétní klasifikační podjednotku [47,48]. Význam rozlišení DE lymfomů spočívá především v odhalení pacientů s vyšším rizikem, přestože nevykazují tak významně agresivní průběh onemocnění jako DH lymfomy [48–50].

Vzácně může být gen MYC deregulován také prostřednictvím somatických hypermutací, které následně mohou ovlivňovat hladinu proteinu Myc. Somatické hypermutace jsou fyziologickým jevem zajišťujícím zvýšení afinity imunoglobulinu k danému antigenu. Frekvence a charakter mutací se u BL a DLBCL liší. Mutace zvyšující aktivitu MYC (tzv. gain-of-function) jsou běžné u BL (mutace T58, F138). U DLBCL jsou však identifikovány v méně než 2 %, a to v případech s přestavbou genu MYC, u nichž jsou asociované s podstatně horším přežitím pacientů. Převážná většina ostatních mutací nalezených u DLBCL se podílí na snížení exprese proteinu Myc a souvisí naopak s lepší prognózou onemocnění [51].

U přibližně 8 % případů DLBCL se v sekvenci genu MYC může vyskytovat jednonukleotidový polymorfizmus MYC- -N11S, který silně koreluje s negativitou IHC barvení Myc pomocí protilátky Y69. Tato varianta pravděpodobně narušuje vazebné místo pro protilátku Y69 a může být jednou z příčin Myc negativity dle IHC barvení i přes prokázanou přítomnost translokace genu MYC [18].

Celkově lze říci, že mutace MYC u DLBCL jsou doprovodné, tedy nejedná se o kauzální mutace, které by se významně podílely na vývoji lymfomu.

DETEKCE EXPRESE PROTEINU MYC

Nejběžnější metodou užívanou v rutinní praxi je IHC vyšetření s použitím monoklonálních protilátek (např. Y69). Diskutovaným problémem při tomto vyšetření je variabilita v prahových hodnotách, od kterých je vzorek považován za pozitivní. Ta se může u jednotlivých pracovišť lišit. Vzorek je obvykle považován za pozitivní při nálezu 40~50 % Myc pozitivních buněk. Posuzuje se význam sledování i jiných hodnot, např. exprese Myc může být již od 10 % pozitivních buněk považována za indikátor rizikových pacientů [19]. Exprese zaznamenaná ve více než 70 % buněk může značit přestavbu genu MYC [49]. Pro klinickou praxi by bylo vhodné sjednotit hodnocení IHC exprese Myc a standardizovat prahové hodnoty mezi pracovišti. Důležitým faktorem, který může mít vliv na úspěšnost IHC barvení vzorku a míru záchytu pozitivních buněk, je fixační čas bioptovaného materiálu a jeho reprezentativnost vzhledem k danému onemocnění. Expresi lze také sledovat na úrovni mRNA pomocí kvantitativní PCR, expresních mikročipů, RNA-Seq nebo přímo digitálním počítáním jednotlivých molekul mRNA s využitím platformy nCounter.

DETEKCE PŘESTAVEB GENU MYC

Detekce chromozomových translokací zahrnujících gen MYC je zásadní v klinické diagnostice agresivních B-buněčných lymfomů. Vyšetřování přestavby genu MYC pomocí molekulárně-biologických metod založených na PCR se běžně nepoužívá. Vzhledem k velké variabilitě zlomových míst a translokačních partnerů je technicky náročné navržení vhodných primerů pro pokrytí všech možných variant a vyšetření má tímto jen omezenou senzitivitu. Cenné informace může přinést stanovení karyotypu lymfomových buněk, které dokáže určit partnerský chromozom translokace MYC, ale disponuje jen nízkou rozlišovací schopností (5–10 Mb). Dalšími nevýhodami je nutnost kultivace nativního materiálu, kterého je v případě punkčních biopsií velmi malé množství, a také potřeba získat dělící se nádorové buňky. V praxi se však nejčastěji setkáváme s požadavkem na vyšetření přestaveb genu až po potvrzení histopatologického nálezu lymfomu. Optimálním a také nejvyužívanějším způsobem je metoda fluorescenční in-situ hybridizace (FISH), která umožňuje detekci translokace jak na nativním materiálu, tak na vzorcích parafinových řezů tkáně fixované ve formalínu (FFPE). FISH představuje robustní a dobře reprodukovatelnou metodu s vysokou citlivostí, pomocí které lze určit jak přestavby, tak početní abnormality genu.

Pro detekci přestavby genu MYC jsou běžně komerčně dostupné dva typy fluorescenčních sond, tzv. break-apart (zlomové) a fúzní (translokační) sondy. Break-apart sondy jsou směsí dvou odlišně fluorescenčně značených sekvencí DNA, které hybridizují k místům nejčastějších zlomů ze strany 5’ MYC a ze strany 3’MYC. Druhou možnost představují fúzní sondy značené systémem dual color dual fusion, které se využívají k detekci vzájemné translokace dvou konkrétních genů. Oblast každého ze sledovaných genů je značena jiným fluorochromem a zahrnuje sekvence před i za nejčastějšími místy zlomu. Fluorescenční sondy pro detekci přestavby genu MYC nabízí široké spektrum výrobců, nicméně pouze některé z nich jsou optimální pro použití na FFPE vzorcích, u kterých je vyžadováno použití sond se silnějšími fluorescenčními signály. Sondy mohou mít rozlišné pokrytí sekvencí v blízkostech zlomů, a tudíž jinou úspěšnost při záchytu pozitivních vzorků. Problematické mohou být zejména případy přestavby genu MYC s non-IG translokačními partnery a se zlomy v blízkosti 3’oblasti nebo se zlomy ve větší vzdálenosti od 5’MYC [24]. Break-apart sondy spolehlivě detekují přestavby genu MYC přibližně v 95 % případů [29,37,52]. Selhávají ale v případě tzv. kryptických translokací, u kterých nedochází k rozsáhlým chromozomovým přestavbám a k oddálení původně spojených lokusů, ale pouze k inzerci velmi malých úseků obsahujících regulační sekvence/zesilovače transkripce do blízkosti onkogenu. Kryptické translokace je většinou možné odhalit použitím fúzní sondy (např. MYC/IGH), proto se jako optimální přístup pro zachycení největšího množství případů jeví použití obou typů sond [37,52].

FFPE preparáty vykazují větší variabilitu v kvalitě hybridizace a ve fluorescenci pozadí než běžné cytogenetické preparáty. Během přípravy ultratenkého řezu dochází k seříznutí buněk na hranici řezu vzorku, a tím k možné ztrátě signálů v těchto oblastech, jinde se vrstvy buněk naopak mohou překrývat [53]. Z tohoto důvodu je vyhodnocení některých sond na FFPE vzorcích problematičtější. Úspěšnost FISH na FFPE vzorcích je také ovlivněna nekrózami tkáně a podmínkami fixace materiálu. Bioptovaný materiál by měl být ideálně okamžitě fixován formalínem, aby se zabránilo degradaci tkáně, a doba fixace by měla být řádně kontrolována podle velikosti vzorku. Jak hypo-, tak hyperfixace ovlivňují intenzitu signálů FISH sond, často jsou signály slabé nebo úplně chybí. Vzorky obsahující kostní materiál procházejí procesem odvápnění, který výrazně ovlivňuje navázání FISH sond a způsobuje, že v odvápněném materiálu obvykle nelze detekovat žádné signály [54].