Hodnocení protinádorového efektu antigen-specifických T lymfocytů s využitím neradioaktivního testu cytotoxicity

Evaluation of antigen-specific lymphocytes anti-tumour effect with use of non-radioactive cytotoxicity test

Objectives:
Cytotoxicity test using radioactive chromium ⁵¹Cr has been standardly used to evaluate specific cytolytic activity of T lymphocytes. This test has some significant disadvantages because of the high non-specific background caused by spontaneous release of ⁵¹Cr from target cells, low sensitivity, and health risks associated with the use of a radioactive isotope. To avoid these limitations we have introduced a cytotoxicity test using 5-(6-) karboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) and propidium iodide (PI).

Aim:
The aim of this study was to evaluate cytotoxic effect of antigen-specific T lymphocyte using a non-radioactive test with CFSE and PI staining.

Methods:
The model of cytotoxic T lymphocytes specific to multiple myeloma cell line ARH 77 was used. Activated myeloma-specific T cells that produce interferon-γ were isolated using immunomagnetic beads and further expanded in vitro. T lymphocyte labeled with CFSE were co-cultured with ARH77 target cells. To identify target cells in late apoptosis or necrosis, PI was used and measured by flow cytometry.

Results:
The optimal staining concentration of CFSE has been found (1μM). Cytotoxicity has been evaluated with effector cells:target cells ratio 2 : 1, 10 : 1 and 50 : 1 after 4, 24 and 48 hours of in vitro cultivation. Tumor specificity has been verified by 2 sets of controls: third-party PBMC as negative control target cells and expanded CFSE-labeled interferon gamma negative fraction of T cells as negative control effector cells.

Conclusion:
The newly established cytotoxicity test is a valuable instrument to evaluate effector part of the immune system and efficacy of anticancer vaccines.

Key words:
cytotoxicity test, CFSE, cytotoxic T lymphocytes

Autoři: L. Zahradová ^1,2; D. Očadlíková ¹; L. Kovářová ^1,3; R. Hájek ^1,2; A. Buliková ³; M. Penka ³; J. Michálek ^1,4
Působiště autorů: Laboratoř experimentální hematologie a buněčné imunoterapie (LEHABI), FN Brno, Bohunice, 2Interní hematoonkologická ¹; klinika, FN Brno - Bohunice, 3Oddělení klinické hematologie, FN Brno - Bohunice, I. dětská interní klinika, FN Brno, Dětská nemocnice ⁴
Vyšlo v časopise: Transfuze Hematol. dnes,12, 2006, No. 4, p. 244-248.
Kategorie: Souhrnné práce, původní práce, kazuistiky

Souhrn

Východiska:
K průkazu cytotoxického efektu T lymfocytů vůči cílovým, resp. nádorovým buňkám, je standardně používán in vitro test s radioaktivním chromem ⁵¹Cr. Tento test má však určité limitace, zejména vysoké procento nespecifického pozadí, nízkou citlivost a použití radioaktivních materiálů. Vědomi si těchto limitací zavedli jsme neradioaktivní cytotoxický test s využitím fluorochromu 5-(6-) karboxyfluorescein diacetát sukcinimidyl esteru (CFSE) a propidium iodidu.

Obsah a cíle práce:
Cílem práce bylo ověřit cytotoxický efekt protinádorových T lymfocytů neradioaktivním testem.

Metody:
Ve studii byl použit model specifických T lymfocytů cytotoxických vůči nádorové linii buněk mnohočetného myelomu ARH 77. Specifické cytotoxické T lymfocyty byly získané imunomagnetickou separací na základě produkce interferonu gama a expandované na potřebné množství. T lymfocyty byly barveny CFSE a kultivovány s nádorovými buňkami ARH 77, pozdně apoptotické a nekrotické buňky byly odlišeny barvením propidium jodidem a hodnoceny pomocí průtokové cytometrie.

Výsledky:
Nejprve byla nalezena optimální barvicí koncentrace CFSE (1μM). Cytotoxicita byla hodnocena při poměru efektorové:terčové buňky 2 : 1, 10 : 1 a 50 : 1 a to po 4, 24 a 48 hodinách kultivace. Specificita expandovaných T lymfocytů byla ověřena kultivací s alogenními mononukleárními buňkami a kultivací nespecifických T lymfocytů s buňkami nádorové linie ARH 77.

Závěr:
Takto zavedený test cytotoxicity je cenným nástrojem pro hodnocení efektorové složky imunitního systému a účinnosti protinádorových vakcín.

Klíčová slova:
test cytotoxicity, CFSE, cytotoxické T lymfocyty