DNA hypermetylace tumor supresorových genů TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1 u hyperplazie endometria


DNA hypermethylation of tumor suppressor genes TWIST1, GATA4, MUS81 and NTRK1 in endometrial hyperplasia

Objective: To investigate DNA methylation of specific tumor suppressor genes in endometrial hyperplasia compared to normal endometrial tissue. File and methodology: To search for epigenetic events, methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification was employed to compare the methylation status of 40 tissue samples with atypical endometrial hyperplasia, 40 tissue samples with endometrial hyperplasia without atypia, and 40 control tissue samples with a normal endometrium. Results and conclusion: Differences in DNA methylation among the groups were found in TWIST1, GATA4, MUS81, and NTRK1 genes (TWIST1: atypical hyperplasia 67.5%, benign hyperplasia 2.5%, normal endometrium 22.5%; P < 0.00001; GATA4: atypical hyperplasia 95%, benign hyperplasia 65%, normal endometrium 22.5%; P < 0.00001; MUS81: atypical hyperplasia 57.5%, benign hyperplasia 22.5%, normal endometrium 5%; P < 0.00001; NTRK1: atypical hyperplasia 65%, benign hyperplasia 27.5%, normal endometrium 10%; P < 0.00001). Higher methylation rates were observed for the tumor suppressor genes of TWIST1, GATA4, MUS81, and NTRK1 in samples with atypical endometrial hyperplasia compared to samples with normal endometrial tissue, and higher methylation rates were found in samples with atypical endometrial hyperplasia compared to samples of benign endometrial hyperplasia. DNA methylation of TWIST1, GATA4, MUS81, and NTRK1 is involved in the pathogenesis of atypical endometrial hyperplasia.

Keywords:

Epigenetics – Methylation – endometrial hyperplasia – NTRK1 – TWIST1 – GATA4 – MUS81


Autoři: Ondřej Dvořák 1 ;  Marcela Slavíčková 2 ;  Jan Laco 3 ;  Martin Štěpán 1 ;  Eva Čermáková 4 ;  Jiří Špaček 1
Působiště autorů: Porodnická a gynekologická klinika LF UK a FN Hradec Králové 1;  Ústav klinické bio chemie a dia gnostiky, LF UK a FN Hradec Králové 2;  Fingerlandův ústav patologie, LF UK a FN Hradec Králové 3;  Ústav lékařské bio fyziky, LF Hradec Králové 4
Vyšlo v časopise: Ceska Gynekol 2024; 89(4): 261-268
Kategorie: Původní práce
doi: https://doi.org/10.48095/cccg2024261

Souhrn

Cíl: Zjistit míru metylací DNA vybraných genových promotorů u jednotlivých typů hyperplazie endometria ve srovnání s normální endometriální tkání. Soubor a metodika: Byla použita MS-MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). Porovnáno bylo celkem 120 vzorků tkáně endometria; 40 vzorků s atypickou hyperplazií endometria, 40 vzorků s hyperplazií endometria bez atypií a 40 kontrolních vzorků tkáně zdravého endometria. Výsledky a závěry: Rozdíly v metylaci DNA mezi jednotlivými skupinami byly zjištěny v genech TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1 (TWIST1: atypická hyperplazie 67,5 %, benigní hyperplazie 2,5 %, normální endometrium 22,5 %; p < 0,00001; GATA4: atypická hyperplazie 95,0 %, benigní hyperplazie 65,0 %, normální endometrium 22,5 %; p < 0,00001; MUS81: atypická hyperplazie 57,5 %, benigní hyperplazie 22,5 %, normální endo-metrium 5,0 %; p < 0,00001; NTRK1: atypická hyperplazie 65,0 %, benigní hyperplazie 27,5 %, normální endometrium 10 %; p < 0,00001). U genů TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1 byla pozorována vyšší míra metylace u vzorků s atypickou hyperplazií endometria v porovnání se vzorky zdravého endometria a dále byla vyšší míra metylace pozorována u vzorků s atypickou hyperplazií endometria v porovnání se vzorky benigní hyperplazie endometria. Metylace DNA u tumor supresorových genů TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1 se uplatňuje v patogenezi atypické hyperplazie endometria.

Klíčová slova:

hyperplazie endometria – metylace – epigenetika – NTRK1 – TWIST1 – GATA4 – MUS81

Úvod

Hyperplazie endometria je patologický stav charakterizovaný nadměrnou proliferací endometriálních buněk. Nejčastější příčinou hyperplazie endometria je hormonální nerovnováha mezi estrogenem a progesteronem, tedy hormony ovlivňujícími růst a regeneraci endometria. Nedostatek progesteronu vůči estrogenům může vést k nadměrnému růstu endometria. Hyperplazie endometria je přirozenou odpovědí endometriální tkáně na růst stimulující efekt estrogenů. Mezi predispoziční faktory hyperplazie endometria patří obezita, kdy může docházet ke zvýšené produkci estrogenů v tukové tkáni aromatizací testosteronu na estrogen, což následně vede k proliferaci až hyperplazii endometria. Dalšími faktory jsou syndrom polycystických ovarií, nádory produkující estrogeny, pozdní menopauza a užívání neoponovaných estrogenů, kdy dlouhodobé užívání estrogenní léčby bez doprovodné progesteronové terapie opět může zvýšit riziko hyperplazie.

Dle Světové zdravotnická organizace (WHO) dělíme hyperplazii endometria do dvou kategorií [1]:

  • hyperplazie endometria bez atypií (synonymum: benigní hyperplazie endometria);
  • atypická hyperplazie endometria/endometrioidní intraepiteliální neoplazie (EIN).

 

Atypická hyperplazie endometria je pokládána za prekancerózu v užším slova smyslu, která může progredovat až do endometroidního typu endometriálního karcinomu (EC), který je jedním z nejčastějších zhoubných nádorů ženského pohlavního ústrojí [2].

Změny endometria ve smyslu hyperplazie se obvykle objevují po menopauze, kdy s ukončením pravidelné ovulace přestanou ovaria produkovat progesteron, tyto změny jsou ale již běžné v období perimenopauzy, kdy už samotná nepravidelnost ovulace a následně cyklu může vyvolat tyto hyperplastické změny na endometriu [3]. Nejčastějšími příznaky hyperplazie endometria jsou abnormální děložní krvácení vč. menoragie, krvácení mimo cyklus, postmenopauzální krvácení, dále i nepravidelné krvácení při hormonální substituční terapii nebo léčbě tamoxifenem [4,5].

Přibližně u 25–40 % pacientek s diagnostikovanou atypickou hyperplazií endometria se bez léčby následně vyvine karcinom endometria. U 13–43 % pacientek s atypickou hyperplazií se vyskytuje karcinom endometria již současně. Naproti tomu riziko maligní transformace benigní hyperplazie endometria během následujících 20 let od stanovení diagnózy je < 5 % [6]. Vznik invazivního karcinomu u pacientek s benigní hyperplazií je tedy poměrně vzácný, naopak atypická hyperplazie je pro vysoké riziko rozvoje v karcinom endometria považována za prekancerózu. Z toho vyplývá, že k léčbě benigní a atypické hyperplazie je nutné přistupovat odlišně. Atypická hyperplazie obvykle vyžaduje radikální léčbu ve smyslu hysterektomie, u benigní hyperplazie lze postupovat konzervativně – observačně. V některých případech může být použita hormonální léčba, např. progestinová terapie, a to i u diagnózy atypické hyperplazie [7]. Správné histologické zařazení a rozlišení benigní hyperplazie a atypické hyperplazie je zásadní pro volbu další terapie.

V procesu karcinogeneze hrají významnou roli epigenetické změny. Mohou ovlivňovat klíčové geny související s kontrolou buněčného dělení, reparací DNA a programovanou buněčnou smrtí. Nejvíce studovanou epigenetickou alterací je metylace DNA, kdy dochází k navázání metylové skupiny na cytosinové báze v DNA. Hypermetylace u tumor supresorových genů může způsobit snížení jejich exprese, což vede k nekontrolovanému buněčnému dělení. Naopak hypometylace může aktivovat onkogeny, geny podporující nádorový růst. Změny v metylaci DNA tumor supresorových genů jsou časným krokem v karcinogenezi endometriální tkáně [8]. V naší předchozí práci byly prokázány rozdíly v metylaci DNA tumor supresorových genů mezi jednotlivými typy hyperplazie u některých z 25 vybraných tumor supresorových genů [9]. Vzhledem k velmi slibným výsledkům jsme se rozhodli pro analýzu získaných vzorků hyperplastického endometria a kontrolní skupiny zdravé endometriální tkáně další skupinou 24 tumor supresorových genů. Pro dobré zkušenosti byla použita sada sond MS-MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) kit ME 004.

 

 

Tab. 1. Demografická a klinická data žen s atypickou hyperplazií endometria, s benigní hyperplazií endometria a s nor- málním nálezem na endometriu.
Tab. 1. Demographic and clinical data of women with atypical endometrial hyperplasia, benign endometrial hyperplasia and normal endometrial findings.

  Kontrolní skupina
n = 40
Benigní hyperplazie 
n = 40
  Hyperplazie s atypiemi  
n = 40 

n = 40  

Věk – medián (IQR)

64 (54–71)

52 (50–60,5)

60 (51–66,8)

0,0022

BMI – kg/m2, medián (IQR)

27,3 (24,2–29,3)

28 (24–32,8)

33,8 (27,1–39,1)

0,00013

Hypertenze – četnost (%)

12 (30,0 %)

20 (51,3 %)

31 (77,5 %)

< 0,0001

Diabetes mellitus – četnost (%)

2 (5,0 %)

3 (7,7 %)

12 (30,0 %)

0,0034

Karcinom prsu – četnost (%)

4 (10,0 %)

1 (2,6 %)

0 (0 %)

0,085

Fumator – četnost (%)   2 (5,0 %)   3 (7,7 %) 2 (5,0 %)    0,796

Údaje jsou prezentovány jako medián (mezikvartilové rozpětí), kategoriální údaje jako n (%). Významné hodnoty p jsou uvedeny tučně. Data are presented as median (interquartile range), categorical data as N (%). Significant values P are shown in bold.
BMI – index tělesné hmotnosti, n – počet, IQR – mezikvartilové rozpětí

 

 

Soubor pacientek a metodika

Do studie bylo zařazeno celkem 120 vzorků třech typů tkání endometria – benigní hyperplazie endometria (n = 40), atypické hyperplazie endometria (n = 40) a vzorků zdravé endometriální tkáně (n = 40). Vzorky pochází od žen léčených na Porodnické a gynekologické klinice FN Hradec Králové. Všechny ženy byly léčeny v období od roku 2007 do roku 2014 a byly české národnosti. Vzorky normálního endometria byly získány od pacientek, které byly léčeny chirurgicky pro nemaligní diagnózy, např. prolaps dělohy nebo děložní leiomyomy. Parafinové bločky byly získány z archivu Fingerlandova ústavu patologie FN Hradec Králové. Všechny preparáty byly zrevidovány a případně reklasifikovány atestovaným patologem se subspecializací na gynekologickou patologii (JL). DNA byla extrahována z formalinem fixovaných parafinových vzorků pomocí soupravy Qiagen pro extrakci DNA (Hilden, Německo).

Studie byla schválena Etickou komisí FM Hradec Králové a výborem institucionální revizní komise (r.n. 20120-4 S21P).

 

Methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA)

V experimentální práci byl použit kit prob SALSA MLPA ME004 Tumour Sup.-4 (MRC-Holland, Amsterdam, The Netherlands), který může analyzovat atypickou metylaci u 24 tumor supresorových genů. Sekvence prob, genová místa a pozice na chromozomu mohou být nalezeny na www.mlpa.com. Jednotlivé geny byly stanoveny pomocí dvou prob, které obsahovaly různá Hha1 restrikční místa. Experimentální postup byl proveden podle protokolu výrobce, s minimem modifikací.

DNA (100 ng) byla rozpuštěna v 5 μl TE-pufru (10 mM Tris·Cl; 0,5 mM EDTA; pH 9,0), denaturována a následně ochlazena na 25 °C. Po přidání směsi prob byly proby přes noc hybridizovány (16–18 hod) při 60 °C. Následně byly vzorky rozděleny na dva podíly: jedna polovina vzorku byla přímo ligována, zatímco druhá polovina vzorku byla společně s ligázou vystavena působení restrikční endonukleázy Hha1 (30 min při 49 °C). Toto štěpení způsobilo ligaci pouze nenaštěpené (metylované) DNA sekvence. Amplifikační PCR reakce byla provedena ve standardním termocykléru (GeneAmp 9700, Applied Biosystems) a využívala teplotní profil: 35 cyklů denaturace při 95 °C 30 s, annealing při 60 °C 30 s a extenze při 72 °C 1 min, zakončeno závěrečnou extenzí 20 min při 72 °C. Alikvoty PCR reakce (0,6 μl) byly smíchány s 0,2 μl vnitřního standardu GeneScan™ –500 LIZ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) a 9,0 μl formamidu. Po denaturaci byly fragmenty separovány a kvantifikovány na ABI3130 kapilárním sekvenátoru a analyzovány pomocí GeneMapper 4.0 (oba Applied Biosystems). Plochy píků s odpovídající velikostí párů bází (bp) byly použity pro další zpracování dat. Poměr metylace byl získán následujícím výpočtem: Dm = (Px / Pctrl) Dig / (Px / Pctrl) Undig, kde Dm je poměr metylace, Px je plocha píku dané sondy, Pctrl je součet ploch píků všech kontrolních sond, Dig znamená HhaI štěpený vzorek a Undig neštěpený vzorek. Dm se může pohybovat od 0 do 1,0 (odpovídá 0–100 % metylované DNA). Na základě předchozích experimentů jsme považovali promotor za metylovaný, pokud Dm ≥ 0,2, což odpovídá 20 % metylované DNA [10]. Cut-off hodnotu jsme nastavili v závislosti na analýze kontrolních vzorků endometrií. CpG univerzálně metylovaná a nemetylovaná DNA (Zymoresearch, Irvine, CA, USA) byly použity v každém běhu jako kontroly.

 

Statistická analýza

Kvantitativní demografické a klinické charakteristiky byly porovnány pomocí neparametrické Kruskal-Wallisovy analýzy rozptylu s následným mnohonásobným porovnáváním Dunnovým testem. Hodnoty jsou prezentovány mediánem a mezikvartilovým rozpětím (IQR). Kvalitativní veličiny byly vyhodnoceny pomocí Fisherova přesného testu a jsou prezentovány absolutními a relativními četnostmi. U testů byla použita Bonferroni modifikace hladiny významnosti. Logistická regrese byla použita ke zhodnocení vlivu případných confounder faktorů. Zvolená hladina významnosti byla pro metylaci DNA a = 0,001, pro všechny další hodnocené parametry a = 0,05. Data byla vyhodnocena pomocí statistického software NCSS 2023 Statistical Software 2023 (NCSS, LLC. Kaysville, Utah, USA, ncss.com/software/ncss a IBM SPSS Statistics verze 29.0.1. – SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

 

Výsledky

Demografické a klinické charakteristiky studijní populace

Celkem bylo do studie zařazeno 120 vzorků endometria (40 vzorků atypické hyperplazie, 40 vzorků benigní hyperplazie a 40 vzorků zdravé tkáně endometria jako kontrolní skupina) a demografické a klinické charakteristiky žen s ohledem na přítomnost benigní hyperplazie a atypické hyperplazie (tab. 1). Všechny proměnné, které byly v univerzální analýze významné (věk žen, body mass index – BMI, diabetes mellitus – DM a hypertenze – HT), byly považovány za potenciální záměnné faktory. Pomocí logistické regrese bylo zjištěno, že rozdílný výskyt genových promotorů mezi skupinami není confounder faktory ovlivněn.

 

Přítomnost metylace genů u žen s normální tkání endometria, s benigní hyperplazií a s atypickou hyperplazií

Rozdíly v metylaci DNA mezi jednotlivými skupinami byly zjištěny v promotorech genů TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1 (TWIST1: atypická hyperplazie 67,5 %; benigní hyperplazie 2,5 %; normální endometrium 22,5 %; p < 0,00001; GATA4: atypická hyperplazie 95,0 %; benigní hyperplazie 65,0 %; normální endometrium 22,5 %; p < 0,00001; MUS81: atypická hyperplazie 57,5 %; benigní hyperplazie 22,5 %; normální endometrium 5,0 %; p < 0,00001; NTRK1: atypická hyperplazie 65,0 %; benigní hyperplazie 27,5 %; normální endometrium 10,0 %; p < 0,00001) (tab. 2). U promotoru GATA4, TWIST1, MUS81 a NTRK1 byla pozorována vyšší míra metylace u vzorků s atypickou hyperplazií endometria v porovnání se vzorky zdravého endometria (GATA4 p < 0,001; TWIST1 p < 0,001; MUS81 p < 0,001 a NTRK1 p < 0,001), dále byla vyšší míra metylace pozorována u vzorků s atypickou hyperplazií endometria v porovnání se vzorky benigní hyperplazie endometria (GATA4 p < 0,01; TWIST1 p < 0,001; MUS81 p < 0,01 a NTRK1 p < 0,01). Rozdíl v míře metylace ve skupině benigní hyperplazie v porovnání se skupinou zdravých endometrií byla pouze u protomoru GATA4 a TWIST1 (GATA4 p < 0,001; TWIST1 p < 0,05). Naopak nebyly nalezeny signifikantní rozdíly v míře metylace u promotoru MUS81 a NTRK1 mezi vzorky skupin benigní hyperplazie a zdravého endometria (tab. 3).

 

 

Tab. 2. Frekvence metylace DNA vybraných genů u podskupin žen s atypickou hyperplazií endometria, s benigní hyperplazií endometria a s normálním nálezem na endometriu.
Tab. 2. DNA methylation frequency of selected genes in subgroups of women with atypical endometrial hyperplasia, benign endometrial hyperplasia and normal endometrial findings.

Geny Kontrolní skupina 
n = 40
Benigní hyperplazie
n = 40
Hyperplazie s atypiemi
n = 40

n = 40

EPHB2 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

1 (2,5)

1

BCL2 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

2 (5,0)

0,328

KLLN – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

4 (10,0)

0,0338

NF1(a) – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

8 (20,0)

0,000275

RARRES1 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

PRPF31 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

TERT – četnost (%)

4 (10,0)

2 (5,0)

8 (20,0)

0,134

THBS1 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

SFRP1(a) – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

1 (2,5)

1

IGF2R(a) – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

2 (5,0)

0,328

NF1b – četnost (%)

2 (5,0)

0 (0)

1 (2,5)

0,772

BRCA1 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

TWIST1 – četnost (%)

9 (22,5)

1 (2,5)

27 (67,5)

< 0,00001

APAF1(a) – četnost (%)

5 (12,5)

9 (22,5)

17 (42,5)

0,00896

PCDH15 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

PCNA – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

DNAJC15 – četnost (%)

39 (97,5)

32 (80,0)

38 (95,0)

0,0276

NTRK1 – četnost (%)

4 (10)

11 (27,5)

26 (65,0)

< 0,00001

PXMP4(a) – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

MEN1(a) – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

LMNA – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

OPA1 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

APAF1(b) – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

PCCA – četnost (%)

0 (0)

1 (2,5)

4 (10,0)

0,125

PAX6 – četnost (%)

2 (5,0)

3 (7,5)

8 (20,0)

0,139

BMPR2 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

RBM14 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

MUS81(a) – četnost (%)

2 (5,0)

9 (22,5)

23 (57,5)

< 0,00001

IGF2R(b) – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

SFRP1(b) – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

1 (2,5)

1

GATA4 – četnost (%)

9 (2,5)

26 (65,0)

38 (95)

< 0,00001

RANGAP1 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

PXMP4(b) – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

LEPRb – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

MEN1(b) – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

JAG1 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

MUS81 – četnost (%)

1 (2,5)

1 (2,5)

1 (2,5)

1

WIF1 – četnost (%)

1 (2,5)

7 (17,5)

8 (20,0)

0,032

CDH1 – četnost (%)

0 (0)

0 (0)

0 (0)

Údaje v kategorii jsou prezentovány jako n (%). Významné hodnoty p jsou uvedeny tučně. – nelze vypočítat, protože žádná ze skupin neobsahuje metylovaný gen
Data in a category are presented as N (%). Significant values P are shown in bold. – cannot be calculated because none of the groups contain a methylated gene
n – počet

 

 

Tab. 3. Rozdíly v metylaci DNA vybraných genů u podskupin žen s atypickou hyperplazií endometria, s benigní hyper- plazií endometria a s normálním nálezem na endometriu.
Tab. 3. Differences in DNA methylation of selected genes in subgroups of women with atypical endometrial hyperplasia, benign endometrial hyperplasia and normal endometrial findings.

Geny                                   Kontrolní vs. benigní                     Kontrolní vs. hyperplazie                                         Benigní hyperplazie hyperplazie                                         s atypiemi                              vs. hyperplazie s atypiemi

TWIST1

0,0143*

0,0001***

< 0,00001***

NTRK1        0,0834   < 0,00001*** 0,0015**

MUS81

0,0476

< 0,00001***

0,0027**

GATA4          0,0003***        < 0,00001*** 0,0015**

Významné hodnoty p jsou uvedeny tučně.
*, **, *** je určena hladina významnosti po Bonferroni modifikaci (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). Significant values P are shown in bold.
*, **, *** is the significance level after Bonferroni modification (* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001).

 

 

Diskuze

Karcinogeneze je obecně způsobena pozvolnými genetickými změnami, které jsou závislé na množství vnitřních a vnějších faktorů. DNA metylace je epigenetický proces, který hraje důležitou roli v regulaci genové exprese a chromatinové struktury. V kontextu karcinogeneze dochází k různým změnám v DNA metylaci, což může ovlivnit regulaci genů a přispět k nekontrolovanému růstu buněk. Vzhledem ke své stabilitě v biologických vzorcích se DNA metylační změny jeví jako atraktivní biomarker různých typů onemocnění a jsou potenciálním cílem pro terapeutické intervence [11]. Všechny vzorky byly přezkoumány patologem, jenž se gynekologické onkologii věnuje dlouhodobě a systematicky. Vzhledem k tomu, že byl hodnocen pouze vybraný panel nádorových supresorových genů, mohli jsme analyzovat v jeden moment vybrané spektrum tumor supresorových genů.

Tato studie prokázala významné aberantní změny v metylaci DNA tumor supresorových genů, konkrétně TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1.

 

TWIST1

TWIST1 (twist family BHLH transcription factor 1) je gen, který kóduje transkripční faktor bHLH (basic helix-loop-helix). Tento faktor je zapojen do regulace genové exprese, regulace růstu a migrace buněk, angiogeneze a osteogeneze. Ovlivňuje procesy spojené s embryonálním vývojem a tvorbou orgánů. Za fyziologických podmínek je jeho exprese regulována, ale v některých patologických stavech, vč. nádorových onemocnění, může docházet k její deregulaci, což může přispět k nádorovému růstu a invazi [12]. Mutace genu TWIST1 je spojována s karcinomem prsu nebo také se Sézaryho syndromem, vzácným typem lymfomu kůže [13,14]. TWIST1 byl identifikován jako jeden z faktorů zapojených do procesu epiteliálně-mezenchymální transformace (EMT), což je klíčový proces při invazi a metastazování nádorových buněk [15].

TWIST1 jako transkripční faktor může ovlivňovat i běžné buněčné procesy v endometriální tkáni. Byla zjištěna hormonální závislost exprese TWIST1 v souvislosti s normální fyziologií endometria během menstruačního cyklu a byla také popsána spojitost hypometylace TWIST1 genu s následnou expresí TWIST proteinu s patogenezí endometriózy [16]. Dále byla popsána významně vyšší exprese TWIST1 u pacientek s atypickou hyperplazií a endometroidním karcinomem oproti kontrolní skupině zdravého endometria, naopak u exprese TWIST1 mezi skupinami atypického endometria a endometroidního karcinomu již nebyl signifikantní rozdíl [17]. To koreluje s našimi výsledky metylace TWIST1, kdy byl statisticky významný rozdíl hypermetylace TWIST1 genu ve skupině atypické hyperplazie (67,5 %) oproti skupině benigní hyperplazie (2,5 %) i skupině zdravých endometrií (22,5 %).

Exprese TWIST1 může dále úzce souviset s hloubkou nádorové invaze, metastazováním a prognózou u pacientek s endometroidním adenokarcinomem endometria [18]. S obdobnými závěry přichází studie zabývající se expresí TWIST1 u kolorektálního karcinomu. Exprese TWIST1 zde významně koreluje s rizikem metastatického postižení, stadiem onemocnění a s tím souvisejícím kratším intervalem přežití a zdá se být klíčovým prediktorem progrese onemocnění [19].

 

GATA4

GATA4 je gen kódující protein GATA-binding protein 4. Tento protein patří do skupiny transkripčních faktorů GATA, která hraje klíčovou roli v regulaci genové exprese, zejména během vývoje a diferenciace buněk. Gen GATA4 je významný především v kontextu embryonálního vývoje, zejména pro správný vývoj a funkci srdce a trávicího systému [20].

GATA4 je také důležitý pro vývoj endokrinních orgánů, jako jsou vaječníky, nadledvinky a pankreas. Má vliv na správnou diferenciaci a funkci buněk v těchto orgánech [21].

Mutace, ztráta exprese nebo naopak nadměrná exprese faktorů GATA4 jsou spojeny s celou řadou nádorových onemocnění, vč. leukemie, karcinomu prsu, rakoviny zažívacího traktu a dalších. Potlačení exprese GATA4 na podkladě hypermetylace promotorových sekvencí byla popsána ve většině buněčných linií rakoviny tlustého střeva a žaludku a stejně tak i u velké části karcinomu jícnu a plic [22–25]. Metylace GATA4 byla pozorována také u gynekologických malignit – karcinomů vaječníků a endometroidního karcinomu endometria [26]. Výsledky v této studii prokazují signifikantně vyšší metylaci GATA4 (81,5 %) ve skupině karcinomů ve srovnání s kontrolní skupinou zdravých endometrií (0 %) [26]. Všechny tyto závěry podporují hypotézu, že potlačení exprese GATA4 na podkladě metylačních změn může přispívat k nádorové maligní transformaci.

Výsledky naší studie zaměřené na přednádorové stavy endometriální tkáně prokazují signifikantní rozdíly v metylacích GATA4 u vzorků hyperplazie endometria s atypiemi (95,0 %) ve srovnání se zdravou tkání 22,5 %, stejně tak i v porovnání se vzorky benigní hyperplazie (65,0 %) Toto zjištění podporuje myšlenku významu metylace GATA4 v karcinogenezi endometria [26].

 

MUS81

Gen MUS81 není typicky považován za klasický tumor supresorový gen. MUS81 kóduje protein MUS81, který hraje roli v opravě DNA a v replikaci genomu. MUS81 může mít vliv na kontrolu buněčného cyklu, zejména na kontrolu G2/M fáze, kde dochází k finálním přípravám buňky na mitózu [27]. Zvláště v kontextu replikačního stresu, např. při rychlém buněčném dělení, může hrát MUS81 významnou roli. Některé studie naznačují, že dysregulace MUS81 nebo neobvyklá aktivace tohoto genu může být spojena s určitými typy nádorů [28]. Přesný charakter role MUS81 v onkogenezi a jeho případná úloha v tvorbě nádorů jsou stále předmětem výzkumu.

Exprese MUS81 byla popsána u hormonálně rezistentního karcinomu prostaty, karcinomu žaludku, hepatocelulárního karcinomu, karcinomu tlustého střeva nebo u serózního ovariálního karcinomu. Všechny tyto studie se dále shodují, že MUS81 má velmi významný vliv na protinádorový účinek chemoterapeutické léčby a jeho inhibice, případně popisovaný knockdown by mohly zvýšit chemosenzitivitu nádorových buněk [29–32]. Proto by MUS81 mohl představovat nový molekulární cíl pro chemoterapii některých nádorů [33].

MUS81 a jeho případné metylace v souvislosti s hyperplazií endometria či endometriálním karcinomem nebyly v literatuře popsány. V naší studii vyšel statisticky významný rozdíl v DNA metylaci MUS81 mezi skupinami atypické hyperplazie, benigní hyperplazie a zdravého endometria (atypická hyperplazie 57,5 %; benigní hyperplazie 22,5 %; zdravé endometrium 5,0 %).

 

NTRK1

NTRK1 je gen, který kóduje receptor s názvem tropomyosin receptor kináza A (TrkA). TrkA je členem rodiny neurotrofních receptorů, které jsou známé také jako neurotrofní receptorová tyrosinkináza. Za fyziologických podmínek regulují synapse v nervovém systému. Dojde-li k fúzi v rámci této skupiny genů, spustí se buněčná signální kaskáda, která může ovlivnit mnoho buněčných funkcí, vč. buněčného růstu, přežití a diferenciace neuronů během vývoje nervového systému [34,35].

Mutace v genu NTRK1, které vedou ke změnám v proteinu TRKA, mohou mít různé biologické důsledky, mohou přispívat k vývoji nádorů, jako je např. sekreční karcinom slinných žláz nebo papilární karcinom štítné žlázy, nebo se mohou projevovat rozvojem některých neurologických poruch, např. familiární dysautonomie (FD). Gen NTRK1 byl opakovaně zmiňován u děložních sarkomů, u subtypu s tzv. rekurentními genetickými fúzemi, jako je low-grade endometriální stromální sarkom (LGESS), high-grade endometriální stromální sarkom (HGESS) a inflamatorní myofibroblastický tumor (IMT). Incidence těchto nádorů se vzhledem k rostoucí dostupnosti molekulárního testování bude pravděpodobně dále zvyšovat [36,37]. V pátém vydání klasifikace nádorů ženských pohlavních orgánů WHO 2020 jsou klasifikovány nově vznikající jednotky, tzv. emerging entities, což jsou případy vřetenobuněčných nádorů dělohy s přestavbou genu NTRK1 [38]. NTRK1 byl dále zmíněn ve vztahu s jeho častější amplifikací u endometriálního karcinomu ve spojitosti s užíváním tamoxifenu (TAM) [39]. Spojitost NTRK1 a patologií endometria není dostatečně prozkoumána. Vztah hyperplazie endometria a metylace DNA NTRK1 nebyl doposud publikován. Z našich zjištěných výsledků je jasně patrný trend nárůstu frekvence metylací DNA NTRK1 v jednotlivých typech hyperplazie ve srovnání s kontrolní skupinou zdravých endometriíí (10,0 %) vs. benigní hyperplazie (27,5 %) a atypické hyperplazie (65,0 %). Naše nálezy jsou v tomto ohledu prioritní.

V rámci onkologického screeningu je dnes již možné využití metylačních změn některých konkrétních genů. Některé jsou již v praxi zavedené, jiné jsou zkoumány v rámci studií a experimentů. Nejvíce využívané jsou v rámci screeningu kolorektálního karcinomu, karcinomu prsu, karcinomu plic či leukemie. Díky detekci metylace DNA příslušných genů v tělních tekutinách, například krevní plazmě, je možné volit tento minimálně invazivní přístup. Příkladem může být screening kolorektálního karcinomu průkazem metylace SEPT9 v plazmě [40].

 

Závěr

Naše výsledky prokazují metylační změny DNA u tumor supresorových genů TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1. Předpokládáme, že by identifikace specifických vzorců DNA metylace u jednotlivých pacientek mohla vést k další personalizaci léčebného přístupu, který by zohledňoval individuální genetické a epigenetické charakteristiky tohoto nejčastějšího gynekologického nádoru.


Zdroje

1. Singh G, Puckett Y. Endometrial Hyperplasia. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing 2024.

2. Hsu YT, Gu F, Huang YW et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin Cancer Res 2013; 19 (22): 6272–6285. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-13-1734.

3. Chandra V, Kim JJ, Benbrook DM et al. Therapeutic options for management of endometrial hyperplasia. J Gynecol Oncol 2016; 27 (1): e8. doi: 10.3802/jgo.2016.27.e8.

4. Kurman RJ, Kaminski PF, Norris HJ. The behavior of endometrial hyperplasia. A long-term study of “untreated” hyperplasia in 170 patients. Cancer 1985; 56 (2): 403–412. doi: 10.1002/1097-0142 (19850715) 56: 2<403:: aid-cncr2820560233>3.0.co; 2-x.

5. Montgomery BE, Daum GS, Dunton CJ. Endometrial hyperplasia: a review. Obstet Gynecol Surv 2004; 59 (5): 368–378. doi: 10.1097/0000 6254-200405000-00025.

6. Lacey JV Jr, Chia VM. Endometrial hyperplasia and the risk of progression to carcinoma. Maturitas 2009; 63 (1): 39–44. doi: 10.1016/j.maturitas.2009.02.005.

7. Lacey JV Jr, Chia VM, Rush BB et al. Incidence rates of endometrial hyperplasia, endometrial cancer and hysterectomy from 1980 to 2003 within a large prepaid health plan. Int J Cancer 2012; 131 (8): 1921–1929. doi: 10.1002/ijc.27457.

8. Nieminen TT, Gylling A, Abdel-Rahman WM et al. Molecular analysis of endometrial tumorigenesis: importance of complex hyperplasia regardless of atypia. Clin Cancer Res 2009; 15 (18): 5772–5783. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-09-0506.

9. Dvorak O, Ndukwe M, Slavickova M et al. DNA methylation of selected tumor suppressor genes in endometrial hyperplasia. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 2024; 168 (1): 68–73. doi: 10.5507/bp.2022.053.

10. Pavicic W, Perkiö E, Kaur S et al. Altered methylation at microRNA-associated CpG islands in hereditary and sporadic carcinomas: a methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA) -based approach. Mol Med 2011; 17 (7–8): 726–735. doi: 10.2119/molmed.2010.00239.

11. Trimarchi MP, Yan P, Groden J et al. Identification of endometrial cancer methylation features using combined methylation analysis methods. PLoS One 2017; 12 (3): e0173242. doi: 10.1371/journal.pone.0173242.

12. Khan MA, Chen HC, Zhang D et al. Twist: a molecular target in cancer therapeutics. Tumour Biol 2013; 34 (5): 2497–2506. doi: 10.1007/s13277-013-1002-x.

13. Martin TA, Goyal A, Watkins G et al. Expression of the transcription factors snail, slug, and twist and their clinical significance in human breast cancer. Ann Surg Oncol 2005; 12 (6): 488–496. doi: 10.1245/ASO.2005.04.010.

14. van Doorn R, Dijkman R, Vermeer MH et al. Aberrant expression of the tyrosine kinase receptor EphA4 and the transcription factor twist in Sézary syndrome identified by gene expression analysis. Cancer Res 2004; 64 (16): 5578–5586. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-04-1253.

15. Roberts CM, Tran MA, Pitruzzello MC et al. TWIST1 drives cisplatin resistance and cell survival in an ovarian cancer model, via upregulation of GAS6, L1CAM, and Akt signalling. Sci Rep 2016; 6: 37652. doi: 10.1038/srep37652.

16. Juanqing L, Hailan Y, Xiangwei F et al. Relationship between the methylation levels of Twist gene and pathogenesis of endometriosis. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 2019; 65 (3): 94–100.

17. Shen J, Chen Q, Li N et al. TWIST1 expression and clinical significance in type I endometrial cancer and premalignant lesions: a retrospective clinical study. Medicine (Baltimore) 2020; 99 (48): e23397. doi: 10.1097/MD.0000000000023397.

18. Wang XJ, Chen XH. Expression and significance of TWIST1 and MMP-2 in endometrial endometrioid adenocarcinoma. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 2012; 34 (8): 588–591. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2012.08.006.

19. Yusup A, Huji B, Fang C et al. Expression of trefoil factors and TWIST1 in colorectal cancer and their correlation with metastatic potential and prognosis. World J Gastroenterol 2017; 23 (1): 110–120. doi: 10.3748/wjg.v23.i1.110.

20. Perrino C, Rockman HA. GATA4 and the two sides of gene expression reprogramming. Circ Res 2006; 98 (6): 715–716. doi: 10.1161/01.RES.0000217593.07196.af.

21. Molkentin JD. The zinc finger-containing transcription factors GATA-4, -5, and -6. Ubiquitously expressed regulators of tissue-specific gene expression. J Biol Chem 2000; 275 (50): 38949–38952. doi: 10.1074/jbc.R000029200.

22. Akiyama Y, Watkins N, Suzuki H et al. GATA-4 and GATA-5 transcription factor genes and potential downstream antitumor target genes are epigenetically silenced in colorectal and gastric cancer. Mol Cell Biol 2003; 23 (23): 8429–8439. doi: 10.1128/MCB.23.23.84 29-8439.2003.

23. Guo M, Akiyama Y, House MG et al. Hypermethylation of the GATA genes in lung cancer. Clin Cancer Res 2004; 10 (23): 7917–7924. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-1140.

24. Guo M, House MG, Akiyama Y et al. Hypermethylation of the GATA gene family in esophageal cancer. Int J Cancer 2006; 119 (9): 2078–2083. doi: 10.1002/ijc.22092.

25. Wen XZ, Akiyama Y, Pan KF et al. Methylation of GATA-4 and GATA-5 and development of sporadic gastric carcinomas. World J Gastroenterol 2010; 16 (10): 1201–1208. doi: 10.3748/wjg.v16.i10.1201.

26. Chmelarova M, Kos S, Dvorakova E et al. Importance of promoter methylation of GATA4 and TP53 genes in endometrioid carcinoma of endometrium. Clin Chem Lab Med 2014; 52 (8): 1229–1234. doi: 10.1515/cclm-2013-0162.

27. Lukaszewicz A, Howard-Till RA, Loidl J. MUS81 nuclease and Sgs1 helicase are essential for meiotic recombination in a protist lacking a synaptonemal complex. Nucleic Acids Res 2013; 41 (20): 9296–9309. doi: 10.1093/nar/gkt703.

28. Chen S, Geng X, Syeda MZ et al. Human MUS81: a fence-sitter in cancer. Front Cell Dev Biol 2021; 9: 657305. doi: 10.3389/fcell.2021. 657305.

29. Gong L, Tang Y, Jiang L et al. Expression of MUS81 mediates the sensitivity of castration-resistant prostate cancer to olaparib. J Immunol Res 2022; 2022: 4065580. doi: 10.1155/2022/ 4065580.

30. Lu R, Xie S, Wang Y et al. MUS81 participates in the progression of serous ovarian cancer associated with dysfunctional DNA repair system. Front Oncol 2019; 9: 1189. doi: 10.3389/fonc.2019.01189.

31. Wang T, Zhang P, Li C et al. MUS81 inhibition enhances the anticancer efficacy of talazoparib by impairing ATR/CHK1 signaling pathway in gastric cancer. Front Oncol 2022; 12: 844135. doi: 10.3389/fonc.2022.844 135.

32. Wu F, Su SC, Tan GQ et al. MUS81 knockdown sensitizes colon cancer cells to chemotherapeutic drugs by activating CHK1 pathway. Clin Res Hepatol Gastroenterol 2017; 41 (5): 592–601. doi: 10.1016/j.clinre.2017.01.011.

33. Xie S, Zheng H, Wen X et al. MUS81 is associated with cell proliferation and cisplatin sensitivity in serous ovarian cancer. Biochem Biophys Res Commun 2016; 476 (4): 493–500. doi: 10.1016/j.bbrc.2016.05.152.

34. Martin-Zanca D, Hughes SH, Barbacid M. A human oncogene formed by the fusion of truncated tropomyosin and protein tyrosine kinase sequences. Nature 1986; 319 (6056): 743–748. doi: 10.1038/319743a0.

35. O‘haire S, Franchini F, Kang YJ et al. Systematic review of NTRK 1/2/3 fusion prevalence pan-cancer and across solid tumours. Sci Rep 2023; 13 (1): 4116. doi: 10.1038/s41598-023-31055-3.

36. Croce S, Hostein I, McCluggage WG. NTRK and other recently described kinase fusion positive uterine sarcomas: a review of a group of rare neoplasms. Genes Chromosomes Cancer 2021; 60 (3): 147–159. doi: 10.1002/gcc.22910.

37. Mohammad N, Stewart CJ, Chiang S et al. p53 immunohistochemical analysis of fusion-positive uterine sarcomas. Histopathology 2021; 78 (6): 805–813. doi: 10.1111/his.14292.

38. Grant L, Boyle W, Williams S et al. Uterine neurotrophic tyrosine receptor kinase rearranged spindle cell neoplasms: three cases of an emerging entity. Int J Gynecol Pathol 2023; 43 (4): 326–334. doi: 10.1097/PGP.00000000000 00988.

39. Saeki H, Horimoto Y, Hlaing MT et al. Clinicopathological and molecular pathological characteristics in tamoxifen-related endometrial cancer. Oncol Lett 2024; 27 (1): 9. doi: 10.3892/ol.2023.14142.

40. Heichman KA, Warren JD. DNA methylation biomarkers and their utility for solid cancer diagnostics. Clin Chem Lab Med 2012; 50 (10): 1707–1721. doi: 10.1515/cclm-2011-0935.

ORCID autorů
O. Dvořák 0000-0003-1372-3729
M. Štěpán 0000-0002-5976-2291
J. Laco 0000-0002-9602-7501
M. Slavíčková 0000-0002-7891-9979
E. Čermáková 0000-0003-3413-4149
Doručeno/Submitted: 21. 4. 2024
Přijato/Accepted: 23. 5. 2024
MUDr. Ondřej Dvořák
Porodnická a gynekologická klinika
LF UK a FN Hradec Králové
Sokolská 581
500 05 Hradec Králové
ondrej.dvorak@fnhk.cz
Štítky
Dětská gynekologie Gynekologie a porodnictví Reprodukční medicína

Článek vyšel v časopise

Česká gynekologie

Číslo 4

2024 Číslo 4
Nejčtenější tento týden
Nejčtenější v tomto čísle
Kurzy Podcasty Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu, se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se