Analýza mikroRNA u extramedulárního relapsu mnohočetného myelomu


MicroRNA Analysis for Extramedullary Multiple Myeloma Relapse

Introduction and Aims:
Multiple myeloma (MM) is the second most common hematooncological disease. Patient survival has been greatly improved by the introduction of new drugs into clinical practice, but survival is negatively affected by the so-called extramedullary relapse (EM), caused by the loss of plasma cell dependence on the bone marrow microenvironment and their migration out of the bone marrow. The nature and causes of this process are currently unclear. MicroRNAs (miRNAs) are short, non-coding RNA molecules involved in many physiological and pathological processes. Their significance in the pathogenesis of MM has been demonstrated by several studies. We assume that they are also involved in the development of the EM. The aim of this study was to analyze different miRNA expression between MM and EM patients.

Material and Methods:
Using next generation sequencing, we analyzed 39 samples of bone marrow cells from MM patients at diagnosis and 9 bone marrow plasma samples of EM patients.

Results:
In total, 2,278 miRNA were sequenced, but only 658 miRNAs were analyzed as they were expressed in all samples and had at least 20 reads. Expression data were generated using the Chimira tool from fastq data. All sequences were mapped using miRBase v20. Further analyses were performed using the R/Bioconductor package. The Bayesian procedure was used for normalization of expression. P values were adjusted using the Benjamini-Hochberg method. Analysis found 10 miRNA (p < 0.0005) that are statistically significantly expressed in EM vs. MM patients – these are miR-26a-5p, miR-26b-5p, miR-30e-5p, miR-424-3p, miR-503-5p, miR-767-5p, miR-105-5p, miR-5695-5p, miR-450b-5p and miR-92b-3p. These miRNAs will be further verified by qPCR method on a larger set of MM and EM patients.

Conclusion:
Our pilot study has shown that there are differentially expressed miRNAs between MM and EM patients.

Key words:
multiple myeloma – microRNA – carcinogenesis – next generation sequencing

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers

This work was supported by grant MZ ČR AZV 17- 29343A.

Submitted:

17. 3. 2018

Accepted:
20. 3. 2018


Autoři: J. Gregorová 1;  D. Vrábel 1;  L. Radová 2;  NA. Gablo 2;  M. Almaši 3;  M. Štork 4;  O. Slabý 2;  L. Pour 4;  J. Minařík 5;  S. Ševčíková 1,3
Působiště autorů: Babákova myelomová skupina, Ústav patologické fyziologie, LF MU, Brno 1;  CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno 2;  Oddělení klinické hematologie, FN Brno 3;  Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno 4;  Hemato-onkologická klinika LF UP a FN Olomouc 5
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2018; 31(Supplementum1): 148-150
Kategorie: Článek ve sborníku

Souhrn

Východiska a cíle:
Mnohočetný myelom (MM) je druhé nejčastější hematoonkologické onemocnění. Zavedení nových léků do klinické praxe vedlo k výraznému zlepšení přežívání pacientů s MM. I přes tato opatření je přežívání pacientů negativně ovlivněno tzv. extramedulárním relapsem (EM). EM je způsoben ztrátou závislosti plazmatických buněk na mikroprostředí kostní dřeně a jejich migrací do měkkých tkání. Podstata a příčina tohoto procesu nejsou doposud objasněny. MikroRNA (miRNA) jsou krátké, nekódující molekuly RNA, které jsou zapojeny do mnoha fyziologických, ale i patologických procesů. V rámci několika studií byl prokázán význam těchto molekul i u patogeneze MM. Předpokládáme, že se miRNA podílejí rovněž na rozvoji EM. Cílem naší práce bylo analyzovat rozdílné exprese miRNA mezi skupinou MM a EM pacientů.

Materiál a metody:
Pomocí sekvenování nové generace bylo analyzováno 39 vzorků plazmatických buněk z kostní dřeně pacientů s MM při diagnóze a 9 vzorků plazmatických buněk z kostní dřeně nemocných s EM.

Výsledky:
Celkem bylo sekvenováno 2 278 miRNA, ale do analýzy bylo zahrnuto 658 miRNA, které byly exprimovány u všech vzorků a měly nejméně 20 čtení. Expresní data byla generována pomocí Chimira tool z fastq dat. Všechny sekvence byly mapovány pomocí miRBase v20. Další analýzy byly provedeny s použitím R/Bioconductor package. Pro normalizaci exprese byl použit Bayesův postup. P hodnoty byly adjustovány s použitím Benjamini-Hochberg metody. Analýza prokázala, že existuje 10 miRNA (p < 0,0005), které jsou statisticky signifikantně exprimovány u EM vs. MM pacientů – konkrétně se jedná o miR-26a-5p, miR-26b-5p, miR-30e-5p, miR-424-3p, miR-503-5p, miR-767-5p, miR-105-5p, miR-5695-5p, miR-450b-5p a miR-92b-3p. Tyto miRNA budou dále ověřeny metodou qPCR na větším souboru pacientů s MM a EM.

Závěr:
Naše pilotní studie ukázala, že existuje rozdíl expresních hladin některých miRNA mezi skupinou pacientů s MM a EM.

Klíčová slova:
mnohočetný myelom – mikroRNA – karcinogeneze – sekvenování nové generace

Úvod

S rozvojem sekvenačních metod bylo zjištěno, že je pouze malá část lidského genomu tvořena protein-kódujícími sekvencemi. Bylo stanoveno, že pouze 1,2 % genomu savců je z DNA přepisováno do mRNA. Ostatní sekvence byly považovány za tzv. junk DNA [1,2]. Následně se ukázalo, že tato junk DNA je přepisována do specifických molekul RNA, které ovšem nekódují proteiny [3], ale vykonávají funkce právě ve formě RNA. Tyto nekódující molekuly RNA tvoří přibližně 98 % genomu [4]. Značné množství protein-nekódujících RNA je asociováno s vývojem vyšších organizmů. Podle délky fragmentů bývají tyto nekódující transkripty rozdělovány na krátké (short non-coding RNA – sncRNA) a dlouhé nekódující molekuly RNA (long non-coding RNA – lncRNA) [1,3]. Hraniční hodnota délky fragmentů, rozdělující tyto molekuly do dvou uvedených skupin, je 200 nt [5]. Sekvence sncRNA nepřesahují délku 200 nt a podílejí se především na regulaci translace mRNA. LncRNA jsou naopak delší než 200 nt a jejich funkce jsou velmi rozmanité [6].

Jednou z hlavních tříd sncRNA jsou mikroRNA (miRNA). Tyto krátké (21–23 nt) jednořetězcové molekuly RNA jsou vysoce konzervované a regulují genovou expresi. Molekuly miRNA mají klíčovou úlohu v mnoha biologických procesech, ale i tumorigenezi [7]. miRNA fungují jako negativní regulátory genové exprese. Bylo zjištěno, že regulace prostřednictvím miRNA může probíhat dvěma různými způsoby v závislosti na stupni komplementarity mezi miRNA a cílovou mRNA. Vazba miRNA na příslušnou mRNA indukuje RNA zprostředkovanou interferenční (RNAi) dráhu. Při vysokém stupni komplementarity mezi sekvencemi dochází k degradaci cílové mRNA. Převládajícím mechanizmem u většiny živočišných buněk je pouze umlčení cílové mRNA vzhledem k neúplné sekvenční komplementaritě miRNA a mRNA. Molekuly miRNA vážou s neúplnou komplementaritou na 3’ nepřekládané oblasti (UTRs) jejich mRNA cíle a potlačují jeho genovou expresi posttranskripčně, zejména na úrovni translace [8]. Funkcí miRNA je tedy negativní regulace hladiny proteinů bez ovlivnění hladin mRNA. Nicméně se ukazuje, že i neúplně komplementární miRNA mohou indukovat mRNA degradaci [9,10].

Přibližně polovina anotovaných lidských miRNA je mapována do fragilních míst chromozomů. Nedávné studie naznačují, že miRNA mohou fungovat jako nádorové supresory a onkogeny, a proto jsou označovány jako oncomirs. Faktory, které jsou potřebné pro biogenezi miRNA, jsou rovněž spojovány s různými typy nádorových onemocnění a mohou mít samy funkci nádorových supresorů a onkogenů. Dále bylo zjištěno, že subtypizace a klasifikace nádorů do určitých podskupin pomocí jejich miRNA profilů je přesnější než klasifikace pomocí expresních profilů protein-kódujících genů. Právě rozdíly v expresi určitých miRNA v různých typech nádorových onemocnění by se mohly stát velice užitečným nástrojem při diagnóze a léčbě nádorů [11].

Mnohočetný myelom (MM) je krevní nádorové onemocnění, které je charakterizováno infiltrací kostní dřeně (KD) monoklonálními plazmatickými buňkami (plasma cells – PC), osteolytickými lézemi a přítomností monoklonálního imunoglobulinu v séru a/nebo v moči. Během posledních 10 let bylo dosaženo velkých úspěchů v léčbě, která vedla ke zvýšení mediánu přežití až na 7–8 let [12]. Na druhou stranu éra nových léků přinesla i nová úskalí. Jedním s nich je zvýšená incidence tzv. extramedulárního relapsu (EM) [13]. Proces vývoje EM je zahájen vycestováním subklonu PC a jejich infiltrací do měkkých tkání, tyto buňky ztrácí závislost na mikroprostředí KD [14]. Některé studie ukázaly přítomnost sekundárních změn v subklonu PC, agresivní progresi nemoci a špatnou prognózu pro pacienty [15]. Další hypotézou pro zvýšenou incidenci EM je možnost, že vysoká aktivita nových léčebných protokolů téměř dokonale vymýtí senzitivní maligní buňky, nicméně vede k vývoji rezistentních, agresivních buněk, které ztrácí závislost na mikroprostředí KD [16]. Hypoteticky je možné, že kombinace nových léčebných modalit selektuje více agresivní klony, které osídlují i měkké tkáně [16]. Jiné studie tuto teorii zavrhují [17].

První studie o EM se objevily již ve 40. a 50. letech 20. století [18,19]. Je tedy zřejmé, že EM není nová entita, ale objevoval se i před érou chemoterapie. V současné době však není jasná incidence ani molekulární mechanizmy, které vedou ke vzniku EM. Existuje velmi málo studií, které analyzovaly větší počet pacientů [13,14,20], většina dalších publikací používala velmi malé kohorty.

EM může být identifikován při diagnóze MM (tzv. primární EM) nebo při relapsu MM (tzv. sekundární EM). Další rozlišení EM, které zatím není běžné, je rozlišení podle stupně „samostatnosti“ EM buněk. EM-B (bone-related) je EM, kdy buňky vytvoří nádor, který je stále svou částí připojen ke kosti. Buňky jsou tak alespoň částečně závislé na mikroprostředí KD. Druhým typem je EM-S (soft-tissue), kdy buňky vycestovávají do měkkých tkání, kde buď tvoří nádorky, nebo infiltrují do celého orgánu a jsou již zcela nezávislé na mikroprostředí KD [13]. Důvody a podmínky, za jakých jsou PC schopny vycestovat z KD a přežívat bez pomoci a podpory cytokinů a stromálních buněk, nejsou objasněny.

Vzhledem k tomu, že se miRNA podílejí na mnoha procesech, vč. tumorigeneze, je naší hypotézou zapojení miRNA v procesu EM relapsu. Cílem této práce je pak stanovit rozdílně exprimované miRNA mezi dvěma skupinami pacientů – MM při diagnóze a EM.

Materiál a metody

Pomocí sekvenování nové generace bylo analyzováno 39 vzorků separovaných PC z KD pacientů s MM při diagnóze a 9 vzorků PC z KD nemocných s EM. Všichni pacienti podepsali informovaný souhlas schválený etickou komisí před zařazením do studie.

Výsledky

Celkem bylo sekvenováno 2 278 miRNA, ale analyzováno bylo pouze 658 miRNA, které byly exprimovány u všech vzorků a měly nejméně 20 čtení. Expresní data byla generována pomocí Chimira tool z fastq dat. Všechny sekvence byly mapovány pomocí miRBase v20. Další analýzy byly provedeny s použitím R/Bioconductor package. Pro normalizaci exprese byl použit Bayesův postup. P hodnoty byly adjustovány s použitím Benjamini-Hochberg metody.

Analýza prokázala, že existuje 10 miRNA (p < 0,0005), které jsou statisticky signifikantně exprimovány u EM vs. MM pacientů – jsou to miR-26a-5p, miR-26b-5p, miR-30e-5p, miR-424-3p, miR-503-5p, miR-767-5p, miR-105-5p, miR-5695-5p, miR-450b-5p a miR-92b-3p. Tyto miRNA budou dále ověřeny metodou qPCR na větším souboru pacientů s MM a EM.

Závěr

Naše pilotní studie ukázala, že existují rozdílně exprimované miRNA mezi skupinou pacientů s MM a EM.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Tato práce byla podpořena grantem MZ ČR AZV 17-29343A.

doc. RNDr. Sabina Ševčíková, Ph.D.

Babákova myelomová skupina

Ústav patologické fyziologie, LF MU

Kamenice 5 625 00 Brno

e-mail: sevcik@med.muni.cz

Obdrženo: 17. 3. 2018

Přijato: 20. 3. 2018


Zdroje

1. Calore F, Lovat F, Garofalo M. Non-coding RNAs and cancer. Int J Mol Sci 2013; 14 (8): 17085–17110. doi: 10.3390/ijms140817085.

2. Šána J, Faltejsková P, Svoboda M et al. Novel classes of non-coding RNAs and cancer. J Transl Med 2012; 10: 103. doi: 10.1186/1479-5876-10-103.

3. Ma L, Bajic VB, Zhang Z, 2013. On the classification of long non-coding RNAs. RNA Biol 2013; 10 (6): 924–933. doi: 10.4161/rna.24604.

4. Mattick JS. Non-coding RNAs: the architects of eukaryotic complexity. EMBO Rep 2001; 2 (11): 986–991. doi: 10.1093/embo-reports/kve230.

5. Guttman M, Amit I, Garber M et al. Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals. Nature 2009; 458 (7235): 223–227. doi: 10.1038/nature07672.

6. Ayers D. Long non-coding RNAs: novel emergent biomarkers for cancer diagnostics. J Cancer Res Treat 2013; 1 (2): 31–35.

7. Esteller M. Non-coding RNAs in human disease. Nature 2011; 12 (12): 861–874. doi: 10.1038/nrg3074.

8. Olsen PH, Ambros V. The lin-4 regulatory RNA controls developmental timing in caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after the initiation of translation. Dev Biol 1999; 216 (2): 671–680. doi: 10.1006/dbio.1999.9523.

9. Bagga S, Bracht J, Hunter S et al. Regulation by let-7 and lin-4 miRNAs results in target mRNA degradation. Cell 2005; 122 (4): 553–563. doi: 10.1016/j.cell.2005.07.031.

10. Lim LP, Lau NC, Garrett-Engele P et al. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature 2005; 433 (7027): 769–773. doi: 10.1038/nature03315.

11. Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs – microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer 2006; 6 (4): 259–269. doi: 10.1038/nrc1840.

12. Hájek R, Krejci M, Pour L et al.2011. Multiple myeloma. Klin Onkol 2011; 24 (Suppl 1): 10–13. doi: 10.14735/amko20111S10.

13. Pour L, Sevcikova S, Greslikova H et al. Soft-tissue extramedullary multiple myeloma prognosis is significantly worse in comparison to bone-related extramedullary relapse. Haematologica 2014; 99 (2): 360–364. doi: 10.3324/haematol.2013.094409.

14. Usmani SZ, Heuck C, Mitchell A et al. Extramedullary disease portends poor prognosis in multiple myeloma and is overrepresented in high risk disease even in era of novel agents. Haematologica 2012; 97 (11): 1761–1767. doi: 10.3324/haematol.2012.065698.

15. Katodritou E, Gastari V, Verrou E et al. Extramedullary (EMP) relapse in unusual locations in multiple myeloma: Is there an association with precedent thalidomide administration and a correlation of special biological features with treatment and outcome? Leuk Res 2009; 33 (8): 1137–1140. doi: 10.1016/j.leukres.2009.01.036.

16. Short KD, Rajkumar SV, Larson D et al. Incidence of extramedullary disease in patients with multiple myeloma in the era of novel therapy, and the activity of pomalidomide on extramedullary myeloma. Leukemia 2011; 25 (6): 906–908. doi: 10.1038/leu.2011.29.

17. Varga C, Xie W, Laubach J et al. Development of extramedullary myeloma in the era of novel agents: no evidence of increased risk with lenalidomide-bortezomib combinations. Br J Haematol 2015; 169 (6): 843–850. doi: 10.1111/bjh.13382.

18. Churg J, Gordon AJ. Multiple myeloma with unusual visceral involvement. Arch Pathol 1942; 34: 546–556.

19. Hayes DW, Bennett WA, Heck FJ. Extramedullary lesions in multiple myeloma: Review of literature and pathologic studies. AMA Arch Pathol 1952; 53 (3): 262–272.

20. Varettoni M, Corso A, Pica G et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: A longitudinal study on 1,003 consecutive patients. Ann Oncol 2010; 21 (2): 325–330. doi: 10.1093/annonc/mdp329.

Štítky
Dětská onkologie Chirurgie všeobecná Onkologie

Článek vyšel v časopise

Klinická onkologie

Číslo Supplementum1

2018 Číslo Supplementum1

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Příběh jedlé sody
nový kurz
Autoři: MUDr. Ladislav Korábek, CSc., MBA

Krvácení v důsledku portální hypertenze při jaterní cirhóze – od pohledu záchranné služby až po závěrečný hepato-gastroenterologický pohled
Autoři: PhDr. Petr Jaššo, MBA, MUDr. Hynek Fiala, Ph.D., prof. MUDr. Radan Brůha, CSc., MUDr. Tomáš Fejfar, Ph.D., MUDr. David Astapenko, Ph.D., prof. MUDr. Vladimír Černý, Ph.D.

Rozšíření možností lokální terapie atopické dermatitidy v ordinaci praktického lékaře či alergologa
Autoři: MUDr. Nina Benáková, Ph.D.

Léčba bolesti v ordinaci praktického lékaře
Autoři: MUDr. PhDr. Zdeňka Nováková, Ph.D.

Revmatoidní artritida: včas a k cíli
Autoři: MUDr. Heřman Mann

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se