Identifikace významu exprese MT-3 pro buňky neuroblastomu


Identifying the Importance of MT-3 Expression for Neuroblastoma Cells

Background:
Resistance of cancer cells to cytostatics is caused by a number of mechanisms that are often combined. These include reduced cell entry or increased efflux, increased DNA repair, defects of, apoptotic pathways, increased cytostatic degradation as well as elevated levels of intracellular thiols of glutathione and metallothioneins (MT). It has been reported that high concentrations of thiol groups in the cytoplasm bind platinum alkylation derivatives and chemorezistence is due to the transfer of platinum from the cytostatic to MT, which inactivates them. Because we have shown an increase in MT levels in resistant neuroblastoma (NB) lines, but not in sensitive lines after incubation with platinum cytostatics, we have considered MT-3 for NB cells in our previous studies.

Method:
SiMa NB cell lines transfected with vector containing human MT-3 and GFP or GFP only (control). Expression Microarray Human Cancer 3711 ElectraSense medium density 4 × 2k array slides with 1,609 DNA probes (Custom Array, Bothell, WA, USA), MT-3 expression and most expressed genes validated by real-time polymerase chain reaction. Sensitivity to CDDP (cisplatin) – MTT assay, clonogenicity test, Western blott caspase cleavage and free oxygen radicals fluorescence microscopy after CellROX Deep Red Reagent staining. Levels of MT-3 mRNA in 23 samples of high-risk NB, normal human cortex and bovine adrenal glands were investigated by reverse transcription polymerase chain reaction.

Results:
Expression microarray showed downregulation 3 and overexpression of 19 genes in MT-3 transfected NB cells. Using gene ontology, over-expressed genes have been shown to drive senescence-induced oncogenes (CDKN2B and ANAPC5), and the genes of glutathione S-transferase M3, caspase 4 and DNAJB6 (chaperone neuronal proteins) were also expressed. We have demonstrated a reduced sensitivity of MT-3 transfected cells to CDDP (24h IC50 of 7.48 ± 0.97 and 19.81 ± 1.2 μg/ml), a higher number of colonies after incubation with CDDP, reduced caspase 3 after incubation with CDDP and lower free oxygen radicals after induction of CDDP. High-grade NB cells expressed MT-3 significantly more than non-tumoral adrenal cells but failed to show a clear relationship to disease course.

Conclusion:
We have demonstrated the relationship between MT-3 and senescence-induced oncogene genes and some other genes relevant to cell fate (glutathione S-transferase M3, caspase 4 and DNAJB6) and a significant proportion of MT-3 on CDDP resistance. High levels of MT-3 in high-risk NB could be one of the causes of frequent relapses in this tumor.

Key words:
neuroblastoma – metallothionein 3 – chemoresistance

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

This work was supported by AZV CR grant 15- 28334A.

Submitted:

17. 2. 2018

Accepted:
16. 4. 2018


Autoři: T. Eckschlager 1;  A. Vícha 1;  P. Jenčová 1;  MA. Merlos Rodrigo 2;  S. Dostálová 3;  H. Buchtelová 3;  V. Strmiska 3;  P. Michálek 3;  Z. Heger 3;  V. Adam 3
Působiště autorů: Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol, Praha 1;  Centrum molekulární medicíny, CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno 2;  Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta Mendelovy univerzity v Brně 3
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2018; 31(Supplementum1): 145-147
Kategorie: Článek ve sborníku

Souhrn

Východiska:
Rezistence nádorových buněk k cytostatikům je způsobena řadou mechanizmů, které se často kombinují. Patří k nim redukovaný vstup cytostatika do buňky nebo jeho zvýšený eflux, zvýšená oprava DNA, defekty apoptotických drah, zvýšené odbourávání cytostatika a také zvýšená hladina intracelulárních thiolů glutathionu a metalothioneinů (MT). Bylo popsáno, že vysoká koncentrace thiolových skupin v cytoplazmě váže platinové alkylační deriváty a chemorezistence je způsobena přenosem platiny z cytostatika na MT, které je inaktivují. Protože jsme v našich předchozích studiích prokázali zvýšení hladin MT v rezistentních neuroblastomových (NB) liniích, ale ne v senzitivních liniích po inkubaci s platinovými cytostatiky, zabývali jsme se významem MT-3 pro buňky NB.

Metoda:
Buňky NB linie SiMa transfekované vektorem obsahujícím lidský MT-3 a GFP nebo pouze GFP (kontrola). Expresní microarray Human Cancer 3711 ElectraSense medium density 4 × 2k array slides s 1 609 DNA probami (Custom Array, Bothell, WA, USA), exprese MT-3 a nejvíce exprimovaných genů validována real-time polymerázová řetězová reakce (RT-PCR). Citlivost k CDDP (cisplatina) – MTT test, vyšetření klonogenicity, průkaz štěpení kaspázy 3 Western blottem a volné kyslíkové radikály fluorescenční mikroskopií po barvení CellROX Deep Red Reagent. Hladiny mRNA MT-3 ve 23 vzorcích vysoce rizikových NB buňkách normální lidské kůry nadledviny a bovinní nadledviny byly vyšetřeny RT-PCR.

Výsledky:
Expresní microarray prokázala downregulaci 3 a over-expresi 19 genů u MT-3 transfekovaných NB buněk. Pomocí genové ontologie bylo zjištěno, že over-exprimované geny řídí onkogeny indukovanou senescenci (CDKN2B a ANAPC5), a zvýšeně exprimované byly i geny glutathion S-transferázy M3, kaspázy 4 a DNAJB6 (chaperon neuronálních proteinů). Prokázali jsme sníženou senzitivitu MT-3 transfekovaných buněk k CDDP (24 h IC50 7,48 ± 0,97 a 19,81 ± 1,2 µg/ml), vyšší počet kolonií po inkubaci s CDDP, snížené štěpení kaspázy 3 po inkubaci s CDDP a nižší volné kyslíkové radikály po jejich indukci CDDP. Buňky vysoce rizikových NB exprimovaly MT-3 významně více než nenádorové buňky nadledviny, ale nepodařilo se prokázat jednoznačný vztah k průběhu onemocnění.

Závěr:
Prokázali jsme vztah mezi MT-3 a geny onkogeny indukované senescence a některými dalšími geny významnými pro osud buňky (glutathion S-transferáza M3, kaspáza 4 a DNAJB6) a významný podíl MT-3 na rezistenci k CDDP. Vysoké hladiny MT-3 u vysoce rizikového NB by mohly být jednou z příčin častých recidiv u tohoto nádoru.

Klíčová slova:
neuroblastom – metalothionein 3 – chemoresistence

Úvod

Rezistence nádorových buněk k cytostatikům je jednou z hlavních příčin stále nepříliš uspokojivých výsledků léčby zhoubných nádorů. Je způsobena řadou mechanizmů, které se často kombinují. Patří k nim redukovaný vstup cytostatika do buňky nebo jejich zvýšený eflux, zvýšená oprava poškozené DNA, defekty apoptotických drah, zvýšené odbourávání cytostatika a také zvýšená hladina intracelulárních thiolů glutathionu a metalothioneinů (MT). Bylo popsáno, že vysoká koncentrace thiolových skupin v cytoplazmě váže platinové alkylační deriváty, a chemorezistence je tak způsobena přenosem platiny z cisplatiny (CDDP), karboplatiny i ostatních platinu obsahujících cytostatik na MT, které je inaktivují [1]. V našich předchozích studiích jsme prokázali zvýšení hladin MT v neuroblastomových liniích rezistentních k CDDP po inkubaci s platinovými cytostatiky, ale ne v senzitivních liniích za stejných podmínek. Při kultivaci v mediu bez cytostatik však ani senzitivní ani rezistentní linie neexprimovaly MT zvýšeně [2]. Také u pacientů s hepatoblastomem léčených karboplatinou bylo zjištěno, že pacienti nereagující na léčbu měli vyšší procento buněk exprimujících MT [3]. Suganuma et al [4] prokázali signifikantně vyšší množství MT v buňkách karcinomu žaludku rezistentních k léčbě CDDP. Většina prací ale poukazuje na ubikvitární izoformy MT, a to MT-1 a MT-2. Role dalších izoforem v rozvoji chemorezistence nádorových onemocnění je dosud neznámá.

Z toho důvodu jsme se zabývali významem MT-3 pro buňky neuroblastomu (NB), a to nejen s ohledem na chemorezistenci k CDDP, ale také s ohledem na molekulární mechanizmy, které over-exprese MT-3 ovlivňuje.

Metoda

K experimentům byly užity buňky linie SiMa odvozené z vysoce rizikového NB s amplifikací MYCN transfekované vektorem obsahujícím geny kódující lidský MT-3 a GFP (selekční marker) nebo pouze GFP (kontrola). Exprese genů byla vyšetřena pomocí expresní microarray – Human Cancer 3711 ElectraSense medium density 4 × 2k array slides s 1 609 DNA probami (Custom Array, Bothell, WA, USA). Expresi MT-3 a pěti nejvíce ovlivněných genů jsme validovali pomocí real-time polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) za využití SYBR Green Quantitative RT-PCR Kitu Eppendorf. Citlivost k CDDP jsme testovali MTT testem s různými koncentracemi CDDP (ředění od 20 μg/ml), vyšetřením klonogenicity buněk preinkubovaných s CDDP, průkazem štěpení kaspázy 3 Western blottem a detekcí volných kyslíkových radikálů (reactive oxygen species – ROS) fluorescenční mikroskopií po afinitním barvení (CellROX Deep Red Reagent). Hladiny mRNA MT-3 ve 23 vzorcích vysoce rizikových NB, buňkách normální lidské kůry nadledviny a bovinní nadledviny byly vyšetřeny pomocí kvalitativní RT-PCR.

Výsledky

Úspěšnost transfekce dosahovala přibližně 70 % a byla potvrzena jak mikroskopicky, tak analýzou exprese MT-3 na úrovni mRNA i proteinu. Expresní microarray prokázala down-regulaci 3 a over-expresi 19 genů u MT-3 transfekovaných NB buněk. Analýzou genové ontologie jsme zjistili, že MT-3 přímo reguluje expresi genů ovlivňujících onkogeny indukovanou senescenci (CDKN2B a ANAPC5). Významný regulační efekt byl zjištěn také u genů pro glutathion S-transferázu M3, kaspázu 4 a DNAJB6 (chaperon pro neuronální proteiny).

Řadou metod jsme prokázali sníženou senzitivitu k CDDP u MT-3 transfekovaných buněk oproti kontrolním buňkám. MTT testem byly zjištěny následující rozdíly v IC50 po 24hodinové inkubaci (7,48 ± 0,97 a 19,81 ± 1,2 µg/ml). Prokázali jsme také vyšší počet kolonií po inkubaci s CDDP u buněk transfekovaných MT-3 než u buněk kontrolních, snížené štěpení kaspázy 3 po inkubaci s CDDP a přítomnost nižšího množství ROS po jejich indukci CDDP.

Vzorky tkání vysoce rizikových NB exprimovaly MT-3 významně více než nenádorové buňky nadledviny. Neprokázali jsme ale jednoznačný vztah k formě onemocnění ani k prognóze.

Diskuze

Naše experimenty prokázaly snížení citlivosti k CDDP u linie zvýšeně exprimující MT-3. Pro tuto linii je charakteristické zvýšení exprese některých genů ovlivňujících onkogeny indukovanou senescenci. Otázkou zůstává vlastní mechanizmus rezistence. Uvažovat lze o vazbě platinového cytostatika na MT, ale i změny v drahách onkogeny indukované senescence se mohou podílet na snížení citlivost k cytostatikům [5]. Lze spekulovat, zda by vysoké hladiny MT-3 u vysoce rizikového NB, které jsme v naší studii nalezli, nemohly být jednou z příčin velmi častých recidiv u tohoto nádoru [6].

Závěry

Prokázali jsme vztah mezi MT-3 a geny dráhy onkogeny indukované senescence a některými dalšími geny významnými pro osud buňky (glutathion S-transferáza M3, kaspáza 4 a DNAJB6) a významný podíl MT-3 na rezistenci k CDDP. Ve všech vzorcích vysoce rizikových NB jsme detekovali vysoké hladiny MT-3 m-RNA.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Práce byla podpořena AZV ČR grant 15-28334A

prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc.

Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84 150 06 Praha 5

e-mail: tomas.eckschlager@lfmotol.cuni.cz

Obdrženo: 17. 2. 2018

Přijato: 16. 4. 2018


Zdroje

1. Galluzzi L, Vitale I, Michels J et al. Systems biology of cisplatin resistance: past, present and future. Cell Death Dis 2014; 5: e1257. doi: 10.1038/cddis.2013.428.

2. Fabrik S, Krizkova D, Huska V et al. Employment of electrochemical techniques for metallothionein determination in tumor cell lines and patients with a tumor dinase. Electroanalysis 2008; 20 (14): 1521–1532.

3. Endo T, Yoshikawa M, Ebara M et al. Immunohistochemical metallothionein expression in hepatocellular carcinoma: relation to tumor progression and chemoresistance to platinum agents. J Gastroenterol 2004; 39 (12): 1196–1201. doi: 10.1007/s00535-004-14 71-1.

4. Suganuma K, Kubota T, Saikawa Y et al. Possible chemoresistance-related genes for gastric cancer detected by cDNA microarray. Cancer Sci 2003; 94 (4): 355–359.

5. Matt S, Hofmann TG. The DNA damage-induced cell death response: a roadmap to kill cancer cells. Cell Mol Life Sci 2016; 73 (15): 2829–2850. doi: 10.1007/s00018-016-2130-4.

6. Moroz V, Machin D, Faldum A et al. Changes over three decades in outcome and the prognostic influence of age-at-diagnosis in young patients with neuroblastoma: a report from the International Neuroblastoma Risk Group Project. Eur J Can 2011; 47 (4): 561–571. doi: 10.1016/j.ejca.2010.10.022.

Štítky
Dětská onkologie Chirurgie všeobecná Onkologie

Článek vyšel v časopise

Klinická onkologie

Číslo Supplementum1

2018 Číslo Supplementum1

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Příběh jedlé sody
nový kurz
Autoři: MUDr. Ladislav Korábek, CSc., MBA

Krvácení v důsledku portální hypertenze při jaterní cirhóze – od pohledu záchranné služby až po závěrečný hepato-gastroenterologický pohled
Autoři: PhDr. Petr Jaššo, MBA, MUDr. Hynek Fiala, Ph.D., prof. MUDr. Radan Brůha, CSc., MUDr. Tomáš Fejfar, Ph.D., MUDr. David Astapenko, Ph.D., prof. MUDr. Vladimír Černý, Ph.D.

Rozšíření možností lokální terapie atopické dermatitidy v ordinaci praktického lékaře či alergologa
Autoři: MUDr. Nina Benáková, Ph.D.

Léčba bolesti v ordinaci praktického lékaře
Autoři: MUDr. PhDr. Zdeňka Nováková, Ph.D.

Revmatoidní artritida: včas a k cíli
Autoři: MUDr. Heřman Mann

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se