Může analýza buněčného lipidomu přispět k rozlišení nádorových a nenádorových buněk tlustého střeva?

Can Analysis of Cellular Lipidome Contribute to Discrimination of Tumour and Non-tumour Colon Cells?

Backgrounds:
Colon cancer development is often characterized by abnormalities in lipid synthesis and metabolism, which may influence energetic balance, structure and function of biological membranes, or production of specific mediators and cell signalling. The changes in lipid profile and metabolism (lipidome) may significantly affect cell behaviour and response to therapy. Permanent epithelial cell lines at various stages of cancer development are used for better understanding of this topic on cellular and molecular levels. In our study, we hypothesized that detailed analyses of colon cancer cell line lipidomes may help to identify major alterations in the amount and profile of specific lipid classes/species, which can contribute to their different response to various stimuli.

Material and Methods:
Cellular lipids were isolated from six human epithelial cell lines derived from tissues at various stages of tumour development. Liquid chromatography coupled with tandem mass spectometry analyses were performed in order to determine amount and mass profiles of all phospholipid (PL), lysophospholipid (lysoPL) and sphingolipid classes. The data was statistically evaluated (cluster and discrimination analyses) with respect to mutual comparison of cell lines and to significantly discriminating lipid types.

Results:
The results of cluster analysis arranged cell lines in order corresponding to their level of transformation (normal cells, adenoma, carcinoma and lymph node metastasis). The results of discrimination analyses revealed the most discriminating lipid types and distinction in PL: lysoPL ratios. Particularly, significant correlation of the amount and profiles of both specific lysoPL and sphingolipid classes with cell transformation level were observed. Similar approaches are now applied to compare lipidomes of colon epithelial cells isolated from tumour vs. non-tumour samples of colon cancer patients.

Conclusion:
Our results indicate that a) selected cancer cell lines are suitable model for lipidomic studies that can serve as a basis for subsequent clinical research, b) cellular lipidome analyses may help to discriminate tumour and non-tumour cells in clinical samples, where specific types of lipids could serve as biomarkers.

Key words:
colon cancer – cell lines – liquid chromatography – mass spektrometry – phospholipids – sphingolipids – bioinformatics

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

This work was supported by Czech Health Research Council, grant No. AZV 15-30585A.

Submitted:
19. 3. 2018

Accepted:
18. 4. 2018

Autoři: J. Hofmanová ¹; J. Slavík ²; Z. Tylichová ^1,3; P. Ovesná ⁴; J. Bouchal ⁵; Z. Kolář ⁵; J. Ehrmann ^5,6; M. Levková ⁵; M. Machala ²; J. Vondráček ¹; A. Kozubík ¹
Působiště autorů: Oddělení cytokinetiky, Biofyzikální ústav AV ČR, v. v. i., Brno ¹; Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i., Brno ²; Ústav experimentální biologie, PřF MU, Brno ³; Ústav biostatistiky a analýz, LF MU, Brno ⁴; Ústav klinické a molekulární patologie, LF UP v Olomouci ⁵; Ústav histologie a embryologie, LF UP v Olomouci ⁶
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2018; 31(Supplementum1): 151-154
Kategorie: Článek ve sborníku

Souhrn

Východiska:
Rozvoj nádorového onemocnění tlustého střeva je mimo jiné charakterizován abnormalitami v syntéze a metabolizmu lipidů, ovlivňujícími energetickou rovnováhu, strukturu a funkci biologických membrán, produkci specifických mediátorů a buněčné signálování. Změny buněčného lipidového profilu a metabolizmu (lipidomu) zásadně ovlivňují chování buněk i jejich odpověď na terapii. K lepšímu pochopení problematiky na buněčné a molekulární úrovni jsou využívány permanentní linie epiteliálních buněk tlustého střeva různého stupně nádorového rozvoje. Naše práce vycházela z předpokladu, že detailní analýza lipidomu různých buněčných linií tlustého střeva může odhalit takové rozdíly v množství a profilu specifických tříd/typů lipidů, které se mohou podílet na jejich rozdílné odpovědi k různým podnětům.

Materiál a metody:
Z buněk šesti lidských epiteliálních linií tlustého střeva odvozených z tkáně v různém stupni nádorového rozvoje byly izolovány lipidy a podrobeny LC/MS/MS (kapalinová chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií) analýze. Bylo stanoveno množství a hmotnostní profily všech tříd fosfolipidů (PL), lysofosfolipidů (lysoPL) a sfingolipidů. Tato data byla matematicky vyhodnocena (shluková a diskriminační analýza) s ohledem na vzájemné srovnání linií a na významně diskriminující typy lipidů.

Výsledky:
Výsledky shlukové analýzy seřadily buněčné linie dle stupně jejich nádorové transformace (normální buňky, adenom, karcinom, lymfatická metastáza). Výsledky diskriminačních analýz odhalily nejvíce rozlišující typy lipidů i odlišnosti v poměru PL: lysoPL. Ukázaly se zejména významné korelace zastoupení a profilu některých specifických tříd lysoPL a sfingolipidů se stupněm nádorové transformace buněk. Podobné přístupy jsou nyní aplikovány při srovnání lipidomu střevních epiteliálních buněk izolovaných z nádorové vs. nenádorové tkáně pacientů s nádory tlustého střeva.

Závěr:
Naše výsledky ukázaly, že a) vybrané buněčné linie jsou vhodným modelem pro lipidomické studie a mohou sloužit jako základ k navazujícímu klinickému výzkumu, b) analýza buněčného lipidomu by mohla přispět k rozlišení nádorových a nenádorových buněk také u klinických vzorků, u nichž by specifické typy lipidů mohly být využity jako biomarkery.

Klíčová slova:
nádory tlustého střeva – buněčné linie – kapalinová chromatografie – hmotnostní spektrometrie – fosfolipidy – sfingolipidy – bioinformatika

Východiska

Rozvoj nádorového onemocnění tlustého střeva je kromě jiného provázen abnormalitami v buněčném metabolizmu, které zahrnují rovněž specifické změny v syntéze, signálování a metabolizmu lipidů. Ty kromě energetické rovnováhy ovlivňují strukturu a funkce biologických membrán, a tak i aktivitu různých receptorů a transportérů, produkci specifických lipidových metabolitů, redoxní stav a buněčné signálování [1]. V souhrnu tzv. buněčný lipidom zásadně ovlivňuje buněčné chování a funguje jako důležitý modifikátor nádorů tlustého střeva [2]. Celkové změny pak přispívají k heterogenitě nádorů a ovlivňují odpověď buněk na endogenní i exogenní podněty vč. terapie. Existují studie dokumentující významné změny jak obsahu a složení fosfolipidů (phospholipids – PL), tak mastných kyselin (MK) doprovázející maligní transformaci tlustého střeva [3]. Pacienti často vykazují abnormality v profilu MK v plazmě a membránách erytrocytů [4]. Hledání rozdílů mezi nádorovou a nenádorovou tkání směřuje k nalezení takových změn lipidů a jejich metabolizmu, které by mohly sloužit jako biomarkery vývoje těchto onemocnění.

Buněčné linie odvozené z nádorové či nenádorové tkáně tlustého střeva jsou vhodným modelem pro studium molekulárních mechanizmů působení endogenních regulátorů i látek z vnějšího prostředí vč. složek diety a farmak. Výzkum změn jejich lipidomu může přinést další užitečný úhel pohledu a položit základ pro navazující klinické studie. Naše předcházející výsledky ukazují, že modulace lipidomu buněčných linií tlustého střeva působením dietetických polynenasycených MK (např. kyselina dokosahexaenová – DHA) a MK s krátkým řetězcem (butyrát) významně ovlivňuje proliferaci a apoptózu buněk tlustého střeva, přičemž odpověď na dané podněty se liší u buněk v různém stupni nádorového rozvoje [5,6]. I když přibývají další studie, spojitost specifických typů MK či lipidů a změn jejich metabolizmu s určitým stadiem rozvoje nádorů není doposud zdaleka objasněna. Naše práce proto vycházela z předpokladu, že detailní analýza lipidomu různých buněčných linií tlustého střeva může odhalit takové rozdíly v množství a profilu specifických lipidů, které se mohou podílet na jejich rozdílné odpovědi k různým podnětům.

Materiál a metody

Byl použit panel linií lidských epiteliálních buněk tlustého střeva kultivovaných standardně v příslušném médiu s 10 % fetálního séra. Linie byly odvozeny z tkáně normálního střeva – NCM460 (M300F medium – Incell corporation), adenomu – (AA/C1 – medium DMEM), diferencujícího (HT29) a nediferencujícího adenokarcinomu (DLD1, HCT-116) a lymfatické metastázy (SW620 – medium McCoy‘s 5A). Buňky byly sbírány v exponenciální fázi růstu, promyty a shromážděny v 1 ml metanolu. Lipidy byly extrahovány a analyzovány jak bylo uvedeno dříve [5]. PL a sfingolipidy byly separovány z 10⁷ buněk s využitím kapalinové chromatografie (HPLC, Agilent 1200) a detekovány tandemovou hmotnostní spektrometrií (TripleQuad 6410 s ESI a APPI, Agilent). K vyhodnocení hmotnostních spekter (plochy chromatografických píků) každé lipidové třídy/podtypů (PL, lysoPL a sfingolipidy) byl využit software MassHunter (Agilent). Data byla kvantifikována s využitím příslušných lipidových standardů a normalizována na 10⁶ buněk.

Množství lipidů je reprezentováno průměrem ze tří nezávislých opakování. Pro třídy PL jsou to fosfatidyl-cholin (phosphatidylcholines – PC), -etanolamin (phosphatidylethanolamine – PE), -serin (phosphatidylserine – PS), -inositol (phosphatidylinositol – PI) a kyselina fosfatidová (phosphatidic acid – PA). Byla kvantifikována celková suma PL. Pro ostatní třídy – lysoPL všech tříd a sfingolipidy (sfingomyelin (SM), ceramid (Cer), hexaceramid (HexCer), lactoceramid (LacCer) a lysoPL všech tříd) – bylo stanoveno také množství jednotlivých lipidových podtypů v hmotnostních profilech. Vzhledem k lognormálnímu rozložení dat byly hodnoty vyjadřující množství lipidů transformovány funkcí Log10. Analýza byla provedena ve dvou úrovních – 1. zastoupení lipidů z jednotlivých tříd jako celku a 2. zastoupení podtypů z dostupných tříd. Podobnost linií byla hodnocena pomocí shlukové analýzy (Wardova metoda, čtverec euklidovské vzdálenosti) na základě a) celkového zastoupení lipidů v jednotlivých třídách, b) zastoupení jednotlivých podtypů z vybraných tříd a c) poměru PL: lysoPL.

Výsledky

Matematické vyhodnocení dat získaných analýzou lipidů odhalilo, že již celkové množství jednotlivých lipidových tříd (PC, PE, PS, PI, příslušných lysoPL a sfingolipidů) rozlišilo jednotlivé buněčné linie. Výsledky shlukové analýzy seřadily linie dle stupně jejich nádorového potenciálu (normální buňky, adenom, karcinomy, lymfatická metastáza) (obr. 1). Data byla dále podrobena diskriminační analýze a vizualizována jako heat mapy. Nejvíce zastoupené třídy PL nevykázaly velký rozlišovací potenciál. Jako nejvíce diskriminující byly určeny na základě rozptylu hodnot mezi liniemi vůči jejich průměru (poměr SD a průměru) lysoPI, lysoPE, lysoPC a Cer. Proto byly dále detailněji vyhodnoceny i rozdíly v hmotnostních profilech lysoPL a sfingolipidů. Zde se projevila diskriminující úloha zejména některých dihydroCer a SM a nenasycených lysoPI. Posledním kritériem byl poměr jednotlivých PL: lysoPL. U normálních buněk NCM460 byl tento poměr výrazně nižší ve srovnání s ostatními liniemi. Vyšší zastoupení lysoPL tak ukazuje na sníženou syntézu PL. Nejvíce diskriminující byl pak poměr PI: lysoPI (obr. 2).

Obr. 1. Zastoupení jednotlivých tříd fosfolipidů (PL, lysoPL) a sfingolipidů (Cer, SM, So) v buněčných liniích. Absolutní množství lipidů dané třídy (standardizovaná plocha píku/106 buněk) vyjádřené jako Log10 – šedá tečkovaná barva indikuje malé, šedá barva vysoké zastoupení. Třídy lipidů jsou seřazeny dle celkového množství ve všech liniích dohromady od nejméně po nejvíce zastoupené. Linie jsou uspořádány dle podobnosti na základě výsledků shlukové analýzy. Šedě jsou orámovány nejvíce diskriminující třídy lipidů.
So – sfingosin, Cer – ceramidy, SM – sfingomyelin, PL – fosfolipidy, lysoPE – lysofosfatidyl-etanolamin, lysoPC – lysofosfatidyl-cholin, lysoPI – lysofosfatidyl-inositol, lysoPS – lysofosfatidyl-serin, lysoPA – kyselina lysofosfatidová

Obr. 2. Poměr PL : lysoPL jednotlivých tříd v buněčných liniích. Celkové zastoupení tříd PL a lysoPL vyjádřené jako poměr (čím vyšší hodnota, tím vyšší zastoupení PL ve srovnání s lysoPL. Např. hodnota 500 značí 500× vyšší množství PL ve srovnání s lysoPL.
PL – fosfolipidy, lysoPE – lysofosfatidyl-etanolamin, lysoPC – lysofosfatidyl-cholin, lysoPI – lysofosfatidyl-inositol, lysoPS – lysofosfatidyl-serin, lysoPA – kyselina lysofosfatidová

Diskuze

Výsledky lipidových analýz jasně prokázaly možnost odlišit od sebe různé typy buněk tlustého střeva podle několika aspektů celkového množství a hmotnostního profilu buněčných lipidů. Množství některých typů zejména lysoPL a sfingolipidů ukázalo na podobnosti či rozdílnosti jednotlivých linií. Specifické diskriminující podtypy v profilech těchto tříd a intenzita syntézy PL zjištěná z poměrů PL: lysoPL pak dále rozlišily zkoumané linie. Za důležité lze považovat zejména změny v úrovni a profilu lysoPL (např. lysoPI, který je ligandem receptoru GPR55) [7] a dále některých typů ceramidů a SM fungujících jako signální molekuly [8].

Závěr

Naše data potvrzují, že vybrané buněčné linie jsou vhodným modelem pro lipidomické studie a mohou sloužit jako základ pro navazující výzkum na klinickém materiálu. Podobné přístupy jsou nyní aplikovány při výzkumu lipidomu střevních epiteliálních buněk (izolace EpCAM pozitivních buněk na magnetických kuličkách) z nádorové a přilehlé nenádorové tkáně pacientů s nádory tlustého střeva. Cílem je detekovat takové typy lipidů a molekul regulujících lipidový metabolizmus, které odlišují nádorové a nenádorové buňky (biomarkery), a tak přispět k lepší diagnostice/prognóze u nádorů tlustého střeva.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Práce byla realizována za podpory agentury Aplikovaného zdravotnického výzkumu (AZV) MZ ČR pod reg. č. AZV 15-30585A.

prof. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc.

Oddělení cytokinetiky

Biofyzikální ústav AV ČR, v. v. i.

Královopolská 135 612 65 Brno

e-mail: hofmanova@ibp.cz

Obdrženo: 19. 3. 2018

Přijato: 18. 4. 2018

Zdroje

1. Santos CR, Schultze A. Lipid metabolism and cancer. FEBS J 2012; 279 (15): 2610–2623. doi: 10.1111/j.1742-4658.2012.08644.x.

2. Gassler N, Klaus C, Kaemmerer E et al. Modifier-concept of colorectal carcinogenesis: Lipidomics as a technical tool in pathway analysis. World J Gastroenterol 2010; 16 (15): 1820–1827.

3. Yan G, Li L, Zhu B et al. Lipidome in colorectal cancer. Oncotarget 2016; 7 (22): 33429–33439. doi: 10.18632/oncotarget.7960.

4. May-Wilson S, Sud A, Law PJ et al. Pro-inflammatory fatty acid profile and colorectal cancer risk: A Mendelian randomisation analysis. Eur J Cancer 2017; 84: 228–238. doi: 10.1016/j.ejca.2017.07.034.

5. Hofmanová J, Slavík J, Ovesná P et al. Dietary fatty acids specifically modulate phospholipid pattern in colon cells with distinct differentiation capacities. Eur J Nutr 2017; 56 (4): 1493–1508. doi: 10.1007/s00394-016-1196-y.

6. Tylichová Y, Straková N, Vondráček J et al. Activation of autophagy and PPARγ protect colon cancer cells against apoptosis induced by interactive effects of butyrate and DHA in a cell type-dependent manner: The role of cell differentiation. J Nutr Biochem 2017; 39: 145–155. doi: 10.1016/j.jnutbio.2016.09.006.

7. Kargl J, Andersen L, Hasenöhrl C et al. GPR55 promotes migration and adhesion of colon cancer cells indicating a role in metastasis. Br J Pharmacol 2016; 173 (1): 142–154. doi: 10.1111/bph.13345.

8. Kurek K, Łukaszuk B, Swidnicka-Siergiejko A et al. Sphingolipid metabolism in colorectal adenomas varies depending on histological architecture of polyps and grade of nuclear dysplasia. Lipids 2015; 50 (4): 349–358. doi: 10.1007/s11745-014-3987-3.