Výskyt anemie a význam měření hladiny hepcidinu metodou ELISA u dětí s nespecifickými střevními záněty


The incidence of anaemia and the use of the ELISA method for measuring hepcidin levels in children with inflammatory bowel disease

The aim of the study was to identify the incidence of anemia in children with inflammatory bowel disease (IBD) (n=133), to define characteristics of anemia and to assess the results of hepcidin measurement by ELISA test in selected group of IBD patients (n=56). Anemia was found in 47.7% of patients. The ferritin level was decreased and the soluble transferrin level was increased in 43% of anemic patients. These findings correspond with a combination of iron deficient anemia (IDA) and anemia of chronic diseases (ACD). A typical laboratory feature of ACD with increased ferritin level was present in only 7.7% of anemic patients. Mean value of hepcidin level in patients with IBD was 42.0 ng/ml (SD 34.1), which is in normal range delivered by ELISA kit manufacturer (13.3–54.4 ng/ml). The hepcidin levels were increased in 55% of the female IBD patients and in 18% of the male patients. The statistically significant positive correlation between hepcidin and CRP levels was found (R=0.30 and p<0.041). The hepcidin levels were significantly higher in young adults over 18 years old than in children aged <18 years.

Our findings suggest that ACD is the most common type of anemia in IBD children and it is accompanied with true iron deficiency. These results differ from currently published data in adult IBD patients. Measuring hepcidin levels is a helpful tool in iron deficiency diagnosis and may represent an important indicator when selecting the most appropriate treatment option. It may also help clarify the hierarchy of regulatory mechanisms in iron metabolism.

Key words:
anaemia of chronic diseases, iron deficiency anaemia, inflammatory bowel diseases, hepcidin, ferroportin, ELISA


Autoři: J. Houda 1;  P. Džubák 1,2;  E. Karásková 1;  D. Holub 2;  D. Vydra 1;  D. Mlčůchová 2;  M. Hajdůch 2;  O. †pozler 3;  D. Pospíšilová 1
Působiště autorů: Dětská klinika při LF UP a FN, Olomoucpřednosta prof. MUDr. V. Mihál, CSc. 1;  Laboratoř experimentální medicíny, Ústav molekulární a translační medicíny, Lékařská fakulta UP, Olomoucředitel doc. MUDr. M. Hajdúch, Ph. D. 2;  Dětská klinika LF a FN, Hradec Královépřednosta prof. MUDr. M. Bayer, CSc. 3
Vyšlo v časopise: Čes-slov Pediat 2014; 69 (3): 137-147.
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Cílem práce je zhodnotit výskyt anemie a její charakteristiky v souboru dětských pacientů (n = 133) s nespecifickými střevními záněty (IBD) a zhodnotit výsledky měření hladiny hepcidinu metodou ELISA u části dětí souboru (n = 56). Anemie byla zjištěna u 47,7 % pacientů. Ve 43 % případů je doprovázena sníženou hladinou feritinu a zvýšenou hladinou sTfR, nález tedy odpovídá kombinaci absolutního deficitu železa (IDA) s anemií chronických chorob (ACD). Typický obraz ACD se zvýšenou hladinou feritinu byl přítomen pouze u 7,7 % anemických pacientů. Medián hladiny hepcidinu u pacientů s nespecifickými střevními záněty byl 42,0 ng/ml (SD 34,1), tedy v mezích normy udané výrobcem ELISA kitu (13,3–54,4 ng/ml). Hladina hepcidinu byla zvýšena u 55 % dívek a 18 % chlapců s IBD. Byla nalezena statisticky významná pozitivní korelace mezi hladinou hepcidinu a hladinou CRP (R = 0,30 a p <0,041). Dále byly zjištěny signifikantně vyšší hladiny hepcidinu u mladistvých pacientů starších 18 let ve srovnání se skupinou pacientů <18 let.

Naše nálezy nasvědčují tomu, že u dětí s IBD převažuje anemie chronických chorob (ACD) v kombinaci s absolutním deficitem železa. Tyto výsledky se liší od dosud publikovaných dat u dospělých pacientů s IBD. Znalost hladiny hepcidinu může významně přispět k přesnějšímu stanovení stupně skutečného deficitu železa a může být důležitým vodítkem při rozhodování o léčebném postupu u pacientů s IBD. Rovněž může být přínosem pro diskusi o hierarchii jednotlivých regulačních systémů produkce hepcidinu.

Klíčová slova:
anemie chronických chorob, sideropenická anemie, nespecifické střevní záněty, hepcidin, feroportin, ELISA

Úvod

Do skupiny nespecifických střevních zánětů patří Crohnova choroba (CD), ulcerózní kolitida (UC) a indeterminovaná kolitida. Crohnova choroba je chronické zánětlivé onemocnění kterékoliv části trávicí trubice s predilekčním postižením ileocekální oblasti a tlustého střeva. Postižení je segmentální a zánět postihuje celou tloušťku střevní stěny. Histologicky je přítomen smíšený zánětlivý infiltrát s nekaseifikujícími granulomy. Ulcerózní kolitida je chronické zánětlivé onemocnění tlustého střeva. Zánětlivá infiltrace postihuje pouze slizniční vrstvu. Histologicky je typický smíšený zánětlivý infiltrát a kryptové abscesy. Zánětlivé změny postihují vždy rektum a odtud se šíří dále do tlustého střeva. Tlusté střevo je postiženo kontinuálně. Indeterminovaná kolitida je zánětlivé onemocnění tlustého střeva, kdy z endoskopického ani histologického nálezu nelze odlišit CD a UC.

Nespecifické střevní záněty se nejčastěji manifestují u mladých osob ve druhém až čtvrtém deceniu. V posledních dvaceti letech došlo k několikanásobnému zvýšení výskytu těchto nemocí u dětí. Před 20. rokem života onemocní 25−30 % [1]. V současné době je ve vyspělých zemích Evropy a USA incidence Crohnovy choroby mezi 4–6 případů/100 000 obyvatel a ulcerózní kolitidy mezi 6–12 případů/100 000 obyvatel [2]. V dětském věku se uvádí incidence Crohnovy choroby 4,9–10,9 případů/100 000 dětí, incidence ulcerózní kolitidy 2,1–4,3 případů/100 000 dětí [3].

Přesná příčina těchto onemocnění není známa. Na vzniku se podílí řada faktorů, a to genetických, imunologických i vlivy životního prostředí [3]. Onemocnění má chronický, často závažný průběh a významně ovlivňuje nejen růst a vývoj dítěte, ale také celkovou kvalitu jeho života.

Anemie je jednou z častých komplikací primárního onemocnění u pacientů s IBD [4] a může významně zhoršit kvalitu života dítěte [5]. Prevalence anemie u pacientů s IBD je udávána různě. Vyskytuje se u 40 až 68 % dospělých pacientů. Informace o jejím výskytu u dětí s IBD jsou zatím sporadické. Podle posledních studií je přítomna až u 70 % dětských pacientů [6]. Na vzniku anemie se podílí několik faktorů, z nichž nejvýznamnější roli hrají nedostatečný příjem a poruchy resorpce železa při zánětu střevní sliznice, ztráty krve z gastrointestinálního traktu a změny metabolismu železa při zánětu [7]. Ve vzácných případech se může anemie vyskytnout jako důsledek nežádoucích účinků léčby imunomodulačními léky (azathioprin, methotrexát). U pacientů s IBD se tedy může objevit jak typický obraz anemie chronických chorob (ACD), tak její kombinace s absolutním deficitem železa (ACD/IDA).

Udržení homeostázy Fe je nezbytné nejen pro adekvátní produkci hemoglobinu a myoglobinu, ale i pro zajištění řady oxidativních procesů. Proto je metabolismus Fe v organismu precizně regulován jak na úrovni buněk, tak na úrovni celého organismu. Jedním z hlavních regulátorů homeostázy železa je hepcidin [8]. Tento peptid se tvoří v játrech z prohepcidinu, u kterého nebyla biologická funkce dostatečně prokázána. Hepcidin se váže na feroportin, který je doposud jediným známým transmembránovým přenašečem Fe z intracelulárního prostoru enterocytu do krevního oběhu. Po vazbě hepcidinu na feroportin je celý komplex hepcidin-feroportin internalizován, v cytoplazmě degradován a výdej Fe do krevního oběhu klesá [9]. Hepcidin působí ve sliznici duodena na apikální straně enterocytů, kde snižuje absorpci Fe z gastrointestinálního traktu (GIT). Dále působí na membráně makrofágů fagocytujících senescentní erytrocyty, kde brání exportu železa uvolněného z erytrocytů zpět do krevního řečiště. Snížení hladiny hepcidinu má za následek zvýšení vstřebávání Fe, vysoké hladiny hepcidinu naopak transport Fe snižují, až zastavují. Produkce hepcidinu je negativně regulována deficitem Fe v organismu, zvýšenou aktivitou erytropoézy a hypoxií, pozitivně je regulována zánětem.

Cílem této práce bylo v první řadě stanovit výskyt anemie v souboru dětí s IBD na podkladě analýzy vybraných hematologických a biochemických parametrů. Po roce 2009, kdy byla zavedena komerčně dostupná ELISA metoda měření hladiny hepcidinu, jsme u části pacientů vyšetřených v tomto období provedli stanovení hladiny hepcidinu, srovnání hladin hepcidinu se zdravou dětskou populací a zhodnocení významu měření hladiny hepcidinu pro diagnostiku anemie doprovázející IBD.

Pacienti a metody

Pacienti

Soubor pacientů tvořilo 133 dětí s IBD (46 pa-cientů s UC a 87 s CD) diagnostikovaných v letech 2005–2011. Poměr děvčat a chlapců byl 1:1,56, věkové rozmezí bylo od 4 let do 18 let + 365 dní (medián 14 let). Pacienti byli diagnostikováni na základě Portských kritérií publikovaných v roce 2005 [1].

Aktivita onemocnění byla hodnocena pomocí indexů aktivity. U pacientů s CD byla aktivita hodnocena na základě Pediatric Crohn´s Disease Activity Index (PCDAI). Tento index posuzuje aktivitu podle klinických příznaků (bolest břicha, četnost stolic, aktivita pacienta), laboratorních hodnot (hematokrit, sedimentace erytrocytů, hladina sérového albuminu), antropometrických dat (hmotnost, růstová rychlost) a fyzikálního vyšetření pacienta [10, 11]. Pacienti s hodnotou PCDAI pod 10 bodů jsou v klinické remisi, pacienti mezi 11 a 30 body mají lehkou formu onemocnění a nad 30 bodů středně těžkou až těžkou formu onemocnění. U pacientů s UC byl použit Pediatric Ulcerative Colitis Activity Index (PUCAI), který vychází z hodnocení klinických potíží pacienta (počet stolic za den, přítomnost krve ve stolici, bolesti břicha, noční stolice, aktivita pacienta) [12]. Pacienti s hodnotou PUCAI <10 body byli v remisi onemocnění, mezi 10 a 30 body se jedná o malé či střední postižení a u pacientů s indexem >65 bodů hodnotíme onemocnění jako velmi závažné. Hodnocení aktivity onemocnění bylo prováděno v den odběru biologického materiálu.

Vzorky krve použité k výše uvedeným laboratorním vyšetřením byly odebrány při pravidelných klinických kontrolách pacientů v gastroenterologických ambulancích. Po zavedení metody ELISA k vyšetření hladin hepcidinu byly v letech 2009–2011 odebrány vzorky krve u 56 pacientů s IBD (36 pacientů s CD a 20 pacientů s UC).

Výsledky vyšetření hepcidinu pacientů s IBD byly porovnány se skupinou zdravých kontrol (n = 32) ve věku 1–17 let (medián 5 let), do které byli zahrnuti dětští pacienti vyšetření v rámci předoperační přípravy před plánovaným chirurgickým výkonem. Tito pacienti neměli známky akutní infekce a netrpěli žádným onkologickým, autoimunním či hematologickým onemocněním.

Znění informovaného souhlasu bylo schváleno etickou komisí LF UP v Olomouci.

Laboratorní metody

U všech pacientů byl v certifikované laboratoři (ISO 9001:2000) v automatickém analyzátoru vyšetřen krevní obraz se zaměřením na zhodnocení charakteristik erytrocytů – hladiny hemoglobinu (Hb), hematokritu (HTC), počtu erytrocytů (ERY), středního objemu erytrocytu (MCV), koncentrace Hb v erytrocytu (MCH) a šíře distribuce erytrocytů (RDW). Standardními biochemickými metodami byly vyšetřeny parametry metabolismu železa – hladina železa v séru (Fe-S), feritin, solubilní transferinový receptor (sTfR) a vybrané markery zánětu – interleukin-6 (IL-6) a C-reaktivní protein (CRP). Jednotlivé hodnoty vyšetřovaných parametrů byly hodnoceny podle platných norem uvedených v tabulkách 1 a 2.

Tab. 1. Laboratorní normy krevního obrazu pro dětskou populaci rozdělené podle věku a pohlaví (Nathan and Oski’s Hematology of Infancy and Childhood, 7th ed).
Laboratorní normy krevního obrazu pro dětskou populaci rozdělené podle věku a pohlaví (Nathan and Oski’s Hematology of Infancy and Childhood, 7th ed).
Hb – hemoglobin; HTC – hematokrit; ERY – erytrocyty; MCV – střední objem erytrocytů; MCH – obsah hemoglobinu v erytrocytu; RDW – distribuční šířka červené krevní řady

Tab. 2. Laboratorní normy biochemických vyšetření pro dětskou populaci rozdělené podle věku a pohlaví dítěte (Nathan and Oski’s Hematology of Infancy and Childhood, 7th ed).
Laboratorní normy biochemických vyšetření pro dětskou populaci rozdělené podle věku a pohlaví dítěte (Nathan and Oski’s Hematology of Infancy and Childhood, 7th ed).
Fe-S – železo v séru; sTfR – solubilní transferinový receptor; CRP - C-reaktivní protein; IL-6 – interleukin 6

Stanovení hepcidinu ELISA metodou

Plazma určená ke změření hladiny hepcidinu byla rozdělena do alikvotů, aby se předešlo opakovanému rozmrazování, a zamražena při -80 °C. K měření hladiny hepcidinu byl použit komerční ELISA kit (DRG Instruments, Germany, Division of DRG International, Inc.). Parametry metody podle výrobce byly následující: norma pro hladinu hepcidinu 13,3–54,4 ng/ml (5.–95. percentil), dynamický rozsah 0,9–140 ng/ml, senzitivita této metody byla stanovena na 0,9 ng/ml. Reprodukovatelnost metody je stanovena pomocí koeficientu variace v rámci kitu na 4,86 % a mezi kity na 11,42 %. Výsledná absorbance byla změřena při vlnové délce 450 ± 10 nm pomocí spektrofotometru Labsystems iEMS Reader MF (Labsystems Oy, Helsinki, Finland). Vzorky byly měřeny v tripletech a z naměřených hodnot absorbance byla vypočítána průměrná hodnota. K výpočtu kalibrační křivky byly použity průměrné hodnoty absorbance standardních roztoků o známé koncentraci – standard 0,00 – 3,85 – 11,50 – 23,00 – 70,00 a 140,00 ng/ml. Z rovnice kalibrační křivky byly vypočítány hodnoty koncentrace hepcidinu pro naměřenou absorbanci vzorků jednotlivých pacientů.

Statistická metoda

Ke zpracování naměřených hladin hepcidinu byly použity hodnoty mediánu a 95% interval spolehlivosti. Výsledky byly zobrazeny pomocí krabicových grafů. Ke srovnání výskytu jevů mezi jednotlivými soubory pacientů byl použit Mannův-Whitneyho test (srovnání dvou souborů) a Kruskallův-Wallisův ANOVA test (srovnání 3 souborů). Vztah mezi hladinou hepcidinu a jednotlivými výsledky laboratorních vyšetření byl hodnocen pomocí neparametrické korelační analýzy (Spearmanův korelační koeficient). Za statisticky významné byly považovány hodnoty p <0,05. Statistická analýza byla provedena počítačovým softwarem Statistica (StatSoft CR, s.r.o., Czech Republic).

Výsledky

Výsledky vybraných parametrů krevního obrazu a metabolismu železa v celém souboru 133 dětských pacientů s IBD (CD a UC) jsou shrnuty v tabulce 3. V tabulce jsou uvedeny mediány naměřených hodnot, jejich rozptyl pro jednotlivé parametry a rozdělení podle typu IBD.

Tab. 3. Srovnání výsledků laboratorních vyšetření u celého souboru dětských pacientů rozdělených podle typu IBD.
Srovnání výsledků laboratorních vyšetření u celého souboru dětských pacientů rozdělených podle typu IBD.
UC – ulcerózní kolitida; CD – Crohnova choroba; IBD – nespecifické střevní záněty; MCV – střední koncentrace hemoglobinu v erytrocytu; Fe-S – železo v séru; sTfR – solubilní transferinový receptor; CRP – C–reaktivní protein

Vyšetření krevního obrazu

Prevalence anemie u dětských pacientů s IBD v populaci s vyšetřenou hladinou hepcidinu byla 47,7 % (n = 56), u pacientů s UC 45,7 % (n = 25) a u pacientů s CD 46 % (n = 31). Medián hladiny hemoglobinu u dívek s IBD byl 121 g/l (SD 16,6), u chlapců 123,5 g/l (SD 24,0). Mikrocytóza byla přítomna u 62,4 % pacientů s IBD. Závažná anemie s nutností podání transfuze erytrocytů se vyskytla pouze u 3 pacientů.

 Vyšetření parametrů metabolismu železa

Snížená hladina železa v séru byla u 52 ze 117 pacientů (44,4 %). Snížená hladina feritinu byla zjištěna u 68 ze 116 pacientů (58,6 %). U 55 ze 109 pacientů (50,5 %) byla prokázána zvýšena hladina sTfR. U 9 z 22 pacientů (42,3 %) ze skupiny pacientů s vyšetřenou hladinou Fe-S, feritinu a sTfR byla zjištěna současně snížená sérová hladina železa, snížená hladina feritinu a zvýšená hladina solubilního transferinového receptoru (tab. 3).

Parametry zánětu

U 44 % z 58 pacientů byla zjištěna zvýšená hladina CRP. U 24 pacientů byl vyšetřen IL-6 a u 4 z nich (17 %) byla jeho hladina zvýšena. Byla prokázána statisticky významná pozitivní korelace mezi hladinou hepcidinu a hladinou CRP (R = 0,30 a p <0,041), viz graf 1.

Korelace hladiny hepcidinu s hladinou CRP u pacientů s IBD.
Graf 1. Korelace hladiny hepcidinu s hladinou CRP u pacientů s IBD.

Hepcidin

Z důvodu nově komerčně dostupného ELISA kitu pro měření hladiny hepcidinu bylo vyšetření metabolismu železa u posledních 56 pacientů s IBD (dívky vs. chlapci 1:1,8) doplněno o vyšetření plazmatické hladiny hepcidinu. Jednatřicet pacientů trpělo Crohnovou chorobou (8 dívek a 23 chlapců) a 25 pacientů ulcerózní kolitidou (12 dívek a 13 chlapců). Medián hladiny hepcidinu u všech změřených pacientů s IBD byl 42,0 ng/ml, tedy v mezích normy udané výrobcem kitu (13,3–54,4 ng/ml). Medián hladiny hepcidinu u dívek s IBD byl 65,2 ng/ml (n = 20, SD 40,5) a u chlapců 38,3 ng/ml (n = 36, SD 26,4). U dívek je medián hladiny hepcidinu signifikantně vyšší než u chlapců (p = 0,0042). Podle typu onemocnění pak u pacientů s UC byl medián hladiny hepcidinu 42,2 ng/ml (SD 38,2). U pacientů s CD byl medián hladiny hepcidinu 41,8 ng/ml (SD 30,1). Hladina hepcidinu byla zvýšená (>54,4 ng/ml) u 11 z 20 dívek (55 %) s IBD a u 6 % z 36 chlapců s IBD. Snížená hladina hepcidinu (<13,3 ng/ml) byla u 5 % dívek a u 3,6 % chlapců. Následující korelační analýzy byly provedeny v souboru 56 pacientů, u kterých byla stanovena hladina hepcidinu.

Tabulka 4 ukazuje korelace hladiny hepcidinu s koncentrací hemoglobinu, sérovou hladinou železa, feritinu, solubilního transferinového receptoru, CRP, s indexy aktivity PCDAI a PUCAI v souboru pacientů s IBD (n = 56). Kromě statisticky významné korelace mezi hladinou hepcidinu a hladinou CRP nebyla nalezena významná korelace mezi ostatními vyšetřovanými markery.

Tab. 4. Korelace hepcidinu s výsledky laboratorních měření a indexy aktivity.
Korelace hepcidinu s výsledky laboratorních měření a indexy aktivity.
Fe-S – železo v séru; sTfR – solubilní transferinový receptor; CRP – C–reaktivní protein; PCDAI – index aktivity Crohnovy choroby u dětí; PUCAI – index aktivity ulcerózní kolitidy u dětí

U pacientů s CD byl spočítán PCDAI. Rozptyl byl 1–16 bodů, medián 1. Nebyla zjištěna statisticky významná korelace mezi PCDAI a hladinou hepcidinu (p = 0,74; R = -0,063; n = 31). V klinické remisi bylo 29 pacientů (94 %), lehkou formu onemocnění měli 2 pacienti (6 %) a těžkou formu onemocnění v našem souboru neměl žádný pacient s CD.

U pacientů s UC byl spočítán PUCAI. Rozptyl byl 0–40 bodů, medián 0. Rovněž nebyla zjištěna korelace mezi PUCAI a hladinou hepcidinu (p = 0,30; R = -0,22; n = 25). V remisi onemocnění bylo 21 pacientů (84 %), malé či střední postižení měli 4 pacienti (16 %) a závažnou formu onemocnění neměl žádný pacient.

Ve skupině pacientů s IBD s vyšetřenou hladinou hepcidinu (n = 49) byla zjištěna významná nepřímá korelace mezi feritinem a sTfR (p <0,000001; R = -0,68; n = 49) a mezi feritinem a RDW (p <0,0002; R = -0,52; n = 48).

U 17 z 56 pacientů (30 %) byla zjištěna anemie a u 7 ze 17 pacientů s anemií byla hladina hepcidinu zvýšená.

V grafu 2 je zobrazena distribuce hladiny hepcidinu u pacientů s UC (n = 25), s CD (n = 31) a u HC (n = 32). Nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl mezi jednotlivými diagnózami pacientů s IBD. Jejich hladina hepcidinu se statisticky významně neliší od zdravých kontrol (HC).

Rozložení hladiny hepcidinu u pacientů s UC, CD a HC. Sloupce vymezují data mezi 5. a 95. percentilem.
Graf 2. Rozložení hladiny hepcidinu u pacientů s UC, CD a HC. Sloupce vymezují data mezi 5. a 95. percentilem.
Rámeček označuje interkvartální rozsah a medián hodnot dané skupiny. UC – ulcerózní kolitida; CD – Crohnova choroba; HC – zdravé kontroly

Pro zhodnocení rozdílů hladiny hepcidinu u dětských pacientů v různých věkových skupinách byl soubor rozdělen do věkové skupiny dětí do 18 let a mladistvých do 19 let. U skupiny pacientů nad 18 let věku byly zjištěny signifikantně vyšší hladiny ve srovnání s mladšími pacienty (p <0,04). Medián hladiny hepcidinu dětí do 18 let byl 45,5 ng/ml (n = 41) a u pacientů ve věku 18 let a více byl medián 69,5 ng/ml (n = 15), viz graf 3. Závislost hladiny hepcidinu na hladině Hb, RDW či MCV se u pacientů s anemií nepotvrdila.

Rozdíl hladin hepcidinu u dětí (pod 18 let) a mladých dospělých (18 a více let).
Graf 3. Rozdíl hladin hepcidinu u dětí (pod 18 let) a mladých dospělých (18 a více let).
 

Diskuse

Z analýzy celého souboru pacientů vyplývá, že anemie je častým doprovodným příznakem u pacientů se zánětlivým střevním onemocněním. Byla přítomná u téměř poloviny sledovaných dětí s IBD, což je v souladu s dosud publikovanými údaji [9, 13, 14]. Většinou se jedná o lehkou anemii, což může být dáno vyšším zastoupením pacientů vyšetřených v remisi onemocnění. Anemie je ve 43 % případů doprovázena sníženou hladinou feritinu a zvýšenou hladinou sTfR. V těchto případech se tedy jedná o kombinaci ACD s absolutním deficitem železa (ACD/IDA). Termín ACD/IDA použil Theurl (2009) a označoval jím ACD charakterizovanou výskytem anemie u pacientů s chronickou infekcí, autoimunitním onemocněním nebo malignitou v kombinaci se sníženou hladinou Hb, zvýšenou vazebnou kapacitou a sníženou hladinou feritinu [15]. Typický obraz ACD, kterou autor definuje jako sníženou hladinu Hb a normální nebo zvýšenou hladinu feritinu, byl v jejich souboru přítomen pouze u 7,7 % pacientů. Podobný nález byl prokázán i v souboru pacientů s vyšetřenou hladinou hepcidinu, ve kterém jsme prokázali anemii charakteru ACD/IDA u 43 % dětí a obraz charakteristický pro ACD u 11,8 % dětí.

Dosud bylo publikováno pouze velmi málo prací hodnotících hladinu hepcidinu u pacientů s IBD [16, 17, 18, 19]. Všechny práce se zabývají pouze dospělými pacienty.

Oustamanolakis (2010) srovnává hladiny hepcidinu u dospělých pacientů s IBD (n = 100) měřených metodou ELISA se zdravou populací (n = 102) [16]. U pacientů s IBD prokázal statisticky významně zvýšenou hladinu hepcidinu, signifikantně negativní korelaci mezi hepcidinem a Hb a pozitivní korelaci mezi hepcidinem a feritinem a mezi hepcidinem a hladinou CRP. V našem souboru pacientů však tyto nálezy nebyly potvrzeny. Rozdíl mezi hladinami hepcidinu mezi dětskými pa-cienty a zdravými kontrolami nebyl statisticky významný. Potvrdili jsme pouze pozitivní korelaci mezi hladinami hepcidinu a CRP. U pacientů s anemií a/nebo mikrocytózou jsme oproti řecké práci prokázali negativní korelaci mezi hladinou hepcidinu a feritinu.

Arnold (2009) ve své práci srovnává soubor dospělých pacientů s IBD (n = 61) se souborem zdravých kontrol (n = 25) [17]. Anemie byla zjištěna u 33 % pacientů s IBD. U 90 % pacientů s anemií byla nižší hladina feritinu a/nebo sérového železa a spadala do skupiny pacientů s IDA. Na rozdíl od řecké práce [16], kde byly hladiny hepcidinu u pacientů s IBD zvýšené, britští autoři zjistili signifikantně nižší hladiny hepcidinu u pacientů s IBD než u zdravých kontrol. Tento nález je v souladu s přítomností kombinace ACD/IDA u pacientů s IBD. Snížení hladiny hepcidinu u pacientů s IBD autor v diskusi přikládá postižení střevní sliznice zánětem a ztrátě tzv. Panethových buněk, které ve střevní sliznici sekretují antimikrobiální peptidy i hepcidin. Zastává hypotézu, že snížení hladiny hepcidinu může být příčinou rozvoje střevního zánětu, nebo že se podílí na chronickém průběhu IBD. Tato hypotéza však dosud nebyla potvrzena.

V nizozemské studii [18] byla změřena hladina hepcidinu v séru dospělé zdravé populace rozdělené podle pohlaví a věku. Autoři uvádí rozdíly mezi jednotlivými pohlavími, kdy hladina hepcidinu byla u žen nižší než u mužů (me-dián u žen 18,1 ng/ml a u mužů 21,8 ng/ml). Odkazují se na práci prof. Ganze [19], který rozdíly mezi pohlavími interpretuje jako důsledek nižších zásob železa u žen především ve fertilním věku (medián věku zdravých amerických žen 32,5 a italských 28 let). U žen dále Galesloot zjistil významně nižší hladinu hepcidinu u premenopauzálních žen v porovnání s postmenopauzálními ženami. U mužů se hladina s věkem neměnila. V naší práci jsme potvrdili rozdíl mezi hladinami hepcidinu v plazmě u dívek a chlapců s IBD (medián pro dívky 65,2 ng/ml a 38,3 ng/ml pro chlapce) a pozorovali jsme stoupající trend mediánu hladiny hepcidinu s věkem, pro což svědčí signifikantní rozdíl hladiny hepcidinu mezi skupinou pacientů pod 18 let věku a starších. Dětští gastroenterologové pečují v odborných ambulancích o pacienty ve věku do 18 let + 365 dní. I v dětském věku je tedy hladina hepcidinu závislá na stáří pacienta. Vzestupný trend hladiny hepcidinu je srovnatelný u chlapců i u dívek.

Údaje o normálním rozmezí hladin hepcidinu u dětí v literatuře zatím chybí. Stanovení norem je v současné době problematické i proto, že doposud nebyla stanovena nejspolehlivější metoda měření hladiny hepcidinu. Kroot [20] se zabýval srovnáním 22 laboratorních metod měřících hladinu hepcidinu. Mezi nejpoužívanější metody ke stanovení hladiny hepcidinu patří metody imunochemické (RIA, ELISA) a metody proteomické (LC-MS/MS, MALDI-TOF MS apod.). Bylo zjištěno, že různé metody přináší různé výsledky a že se jednotlivé metody v absolutních číslech výrazně liší. Standardizace výsledků vyžaduje vyšetřování na velkém souboru pacientů.

Produkce hepcidinu je regulována několika signálními drahami, které řídí transkripci genu pro hepcidin (HAMP). Mezi faktory ovlivňující tyto dráhy patří zánětlivé cytokiny (IL-6) aktivující kaskádu STAT3 [21, 22], která spouští transkripci genu HAMP, kódujícího hepcidin [23]. Hladina železa aktivuje kaskádu BMP6/SMAD [24, 25, 26] a tím inhibuje transkripci genu. Dalšími významnými faktory ovlivňujícími tvorbu hepcidinu jsou hypoxie [27] a aktivita erytropoézy [28]. Erytropoéza je proces vysoce citlivý na dostatečný přísun železa. Dochází-li u pacientů s IBD k chronickým či akutním krevním ztrátám, kostní dřeň kompenzuje tyto ztráty zvýšenou produkcí erytrocytů. Toto zvýšení je doprovázeno zvýšenou spotřebou železa, proto dochází k utlumení tvorby hepcidinu, ke zvýšení absorpce železa z GIT a ke zvýšení výdeje Fe z monocyto-makrofágového systému. U dětí a dospívajících s IBD může tedy být vliv zvýšené potřeby železa v období růstu v kombinaci s chronickými i akutními krevními ztrátami silnější než vliv zánětlivého procesu. Zdá se, že mechanismy zajišťující dostatečnou tvorbu erytrocytů a tedy dostatečný přísun kyslíku do tkání jsou nadřazeny všem ostatním vlivům. Tím by bylo možné vysvětlit převažující ACD/IDA (57 %) u anemických dětí s IBD v remisi onemocnění, u kterých se nejedná o akutní zánět ohrožující život pacienta.

Izolované vyšetření hladiny Fe v séru je nespolehlivý ukazatel jeho stavu v organismu. Vždy je nutno jej doplnit vyšetřením dalších přesnějších markerů, především feritinu a solubilního transferinového receptoru. V práci českých autorů [29] je k odlišení typu anemie u dětských pacientů s IBD vhodný index sTfR/log feritin. Hepcidin je rovněž diskutován jako potenciální biomarker schopný rozlišit sideropenickou anemii od anemie chronických chorob. Jeho tvorba je ovlivněna mnoha faktory, z nichž těmi nejdůležitějšími u pacientů s IBD jsou zvýšený obrat erytropoézy při deficitu Fe po opakovaných krevních ztrátách a na druhé straně zánětlivé onemocnění s tvorbou cytokinů. Zmíněné faktory působí protichůdně. Onemocnění, která zahrnují oba patogenetické mechanismy ovlivňující tvorbu hepcidinu, pak mohou představovat diagnostický problém. U dětské populace se na rozvoji anemie podílí významněji než u dospělých skutečný deficit Fe a anemie má charakter ACD/IDA.

Hladina hepcidinu našich pacientů měřená metodou ELISA se při hodnocení celého souboru významně neliší mezi pacienty s ACD, ACD/IDA a zdravými kontrolami. Pravděpodobně se zde podílí nerovnoměrné rozložení (větší rozptyl) hodnot hladin hepcidinu od nižších hladin přes normální ke zvýšeným ve srovnání s kontrolami. Při použití proteomické metody, která je ve srovnání s metodou ELISA schopna lépe podchytit škálu nízkých hodnot hladin hepcidinu, byl tento předpoklad již potvrzen [30]. Proteomická metoda je při detailním rozlišování snížených hodnot hepcidinu pravděpodobně citlivější.

Závěr

V současné době je širší využití metody ELISA ke stanovení hladiny hepcidinu v diagnostice anemií u dětských pacientů s IBD limitované. Dosud nejsou komerčně dostupné ELISA kity, u kterých by výrobce deklaroval použití pro dětskou populaci. Kromě toho nebyly doposud definovány normy hepcidinu pro dětskou populaci. Je nezbytné vyšetřit dostatečně velký soubor dětských pacientů s IBD, aby bylo možno srovnat citlivost metody pro rozlišení ACD od ACD/IDA. Na dostatečně velkém souboru pacientů bude možno zhodnotit korelaci hepcidinu s dosud běžně používanými ukazateli (MCV, RDW, feritin a sTfR). Rovněž je nezbytné vybrat optimální metodu vyšetření s dostatečně významnou senzitivitou a specificitou. Další využití měření hepcidinu, především pomocí proteomické analýzy, může přinést přesnější informace důležité pro bližší specifikaci anemie u IBD.

Měření hladiny hepcidinu u pacientů s IBD může být jednoznačným přínosem při rozlišování mezi klasickou ACD a kombinací ACD s relativním nebo absolutním deficitem Fe. Může tak významně přispět k určení algoritmu léčby těchto pacientů. V nepřítomnosti anemie může hepcidin potenciálně sloužit i jako další důležitý marker aktivity zánětu.

Poděkování

MUDr. Josefu Srovnalovi, Ph.D., Mgr. Gabriele Rylové a Mgr. Tomáši Oždianovi za odborné konzultace.

Finanční podpora práce:

Grant IGA MZ ČR NS9951–4/2008, IGA LF 2012_17, infrastrukturní část projektu byla podpořena z projektu operačního programu VaVpI CZ.1.05/2.1.00/01.0030.

Došlo: 28. 6. 2012

Přijato: 11. 4. 2014

MUDr. Jiří Houda

Dětská klinika FN

Puškinova 6

779 00 Olomouc

e-mail jiri.houda@fnol.cz


Zdroje

1. IBD Working Group of the European Society for Paediatric Gastroenterology. Hepatology and Nutrition. Inflammatory bowel disease in children and adolescents: recommendations for diagnosis--the Porto criteria. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2005; 41 (1): 1–7.

2. Lukáš M. Farmakoterapie idiopatických střevních zánětů. Prakt Lékáren 2009; 5 (4):164–167.

3. Wyllie R, Hyams JS, Kay M. Pediatric Gastrointestinal and Liver Disease. 4th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders, 2011: 472–504.

4. Bergamaschi G, Di Sabatino A, Albertini R, et al. Prevalence and pathogenesis of anemia in inflammatory bowel disease. Influence of anti-tumor necrosis factor-alpha treatment. Haematologica 2010; 95 (2): 199–205.

5. Wells CW, Lewis S, Barton JR, et al. Effects of changes in hemoglobin level on quality of life and cognitive function in inflammatory bowel disease patients. Inflamm Bowel Dis 2006; 12 (2): 123–130.

6. Goodhand JR, Kamperidis N, Rao A, et al. Prevalence and management of anemia in children, adolescents, and adults with inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 2012; 18 (3): 513–519.

7. Gerasimidis K, McGrogan P, Edwards CA. The aetiology and impact of malnutrition in paediatric inflammatory bowel disease. J Hum Nutr Diet 2011; 24 (4): 313–326.

8. Ganz T. Hepcidin and its role in regulating systemic iron metabolism. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2006; 507: 29–35.

9. Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J, et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science 2004; 17: 306.

10. Hyams JS, Ferry GD, Mandel FS, et al. Development and validation of a pediatric Crohn‘s disease activity index. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1991; 12 (4): 439–447.

11. Otley A, Loonen H, Parekh N, et al. Assessing activity of pediatric Crohn‘s disease: which index to use? Gastroenterology 1999; 116 (3): 527–531.

12. Turner D, Hyams J, Markowitz J, et al. Appraisal of the pediatric ulcerative colitis activity index (PUCAI). Inflamm Bowel Dis 2009; 15 (8): 1218–1223.

13. Wiskin AE, Fleming BJ, Wootton SA, et al. Anaemia and iron deficiency in children with inflammatory bowel disease. J Crohns Colitis 2012; 6 (6): 686–691.

14. Wilson A, Reyes E, Ofman J. Prevalence and outcomes of anemia in inflammatory bowel disease: a systematic review of the literature. Am J Med 2004; 116 (Suppl 7A): S44–S49.

15. Theurl I, Finkenstedt A, Schroll A, et al. Growth differentiation factor 15 in anaemia of chronic disease, iron deficiency anaemia and mixed type anaemia. Br J Haematol 2010; 148 (3): 449–455.

16. Oustamanolakis P, Koutroubakis IE, Messaritakis I, et al. Serum hepcidin and prohepcidin concentrations in inflammatory bowel disease. Eur J Gastroenterol Hepatol 2011; 23 (3): 262–268.

17. Arnold J, Sangwaiya A, Bhatkal B, et al. Hepcidin and inflammatory bowel disease: dual role in host defence and iron homoeostasis. Eur J Gastroenterol Hepatol 2009; 21 (4): 425–429.

18. Galesloot TE, Vermeulen SH, Geurts-Moespot AJ, et al. Serum hepcidin: reference ranges and biochemical correlates in the general population. Blood 2011; 117 (25): e218–225.

19. Ganz T, Olbina G, Girelli D, et al. Immunoassay for human serum hepcidin. Blood 2008 Nov 15; 112 (10): 4292–4292.

20. Kroot JJ, Kemna EH, Bansal SS, et al. Results of the first international round robin for the quantification of urinary and plasma hepcidin assays: need for standardization. Haematologica 2009; 94 (12): 1748–1752.

21. Wrighting DM, Andrews NC. Interleukin-6 induces hepcidin expression through STAT3. Blood 2006; 108 (9):3204–3209.

22. Huang H, Constante M, Layoun A, et al. Contribution of STAT3 and SMAD4 pathways to the regulation of hepcidin by opposing stimuli. Blood 2009; 113 (15): 3593–3599.

23. Nicolas G, Chauvet C, Viatte L, et al. The gene encoding the iron regulatory peptide hepcidin is regulated by anemia, hypoxia, and inflammation. J Clin Invest 2002; 110 (7): 1037–1044.

24. Kautz L, Meynard D, Monnier A, et al. Iron regulates phosphorylation of Smad1/5/8 and gene expression of Bmp6, Smad7, Id1, and Atoh8 in the mouse liver. Blood 2008 Aug 15; 112 (4): 1503–1509.

25. Andriopoulos B Jr, Corradini E, Xia Y, et al. BMP6 is a key endogenous regulator of hepcidin expression and iron metabolism. Nat Genet 2009; 41 (4): 482–487.

26. Meynard D, Kautz L, Darnaud V, et al. Lack of the bone morphogenetic protein BMP6 induces massive iron overload. Nat Genet 2009; 41 (4): 478–481.

27. Peyssonnaux C, Zinkernagel AS, Schuepbach RA, et al. Regulation of iron homeostasis by the hypoxia-inducible transcription factors (HIFs). J Clin Invest 2007; 117 (7): 1926–1932.

28. Pinto JP, Ribeiro S, Pontes H, et al. Erythropoietin mediates hepcidin expression in hepatocytes through EPOR signaling and regulation of C/EBPalpha. Blood 2008 Jun 15; 111 (12): 5727–5733.

29. Šuláková A, Pozler O, Nováčková L, et al. Prevalence a typ anemie v době stanovení diagnózy nespecifického střevního zánětu u dětí. Čes-slov Pediat 2012; 67 (1): 3–10.

30. Pospíšilová D, Houda J, Holub D, et al. Význam stanovení hladiny hepcidinu v diagnostice vybraných typů anemií v dětském věku. Transfuze Hematol dnes 2012; 18 (2): 58–65.

Štítky
Neonatologie Pediatrie Praktické lékařství pro děti a dorost

Článek vyšel v časopise

Česko-slovenská pediatrie

Číslo 3

2014 Číslo 3

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Pacient na antikoagulační léčbě v akutní situaci
nový kurz
Autoři: MUDr. Jana Michalcová

Kopřivka a její terapie
Autoři: MUDr. Petra Brodská

Uroinfekce v primární péči
Autoři: MUDr. Marek Štefan

Roztroušená skleróza a plánování těhotenství
Autoři: MUDr. Radek Ampapa

Alergenová imunoterapie v léčbě inhalačních alergií
Autoři:

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se