Vliv matrixových metaloproteináz na hojení ran po operaci vrozeného rozštěpu rtu


Role of matrix metalloproteinases in wound healing after congenital cleft lip surgery

Objective:
The purpose of this study was to compare the aspects of wound healing after cleft lip surgery within one week of age and wound healing after surgery within 2–4 months of age. We examined extracellular matrix proteins involved in wound healing, especially concentrations of matrix metalloproteinases in tissue removed during surgery.

Material and methods:
30 tissue samples (16 boys and 14 girls) were removed during surgery within one week of age 17 or within 2–4 months of age 13. Proteins were extracted in cacodylic buffer for 24 hours in temperature 2–8 °C. Total protein concentrations were examined using modification of Lowry method. Samples were examined using ELISA kit Amersham Biotrak Activity Assay (GE Healthcare UK) for detection of MMP-1, MMP-2, and MMP-3 concentrations.

Results:
MMP-1: early surgery 0.017 ± 0.023 µg/g of protein (mean ± SD), 2–4 months surgery 0.028 ± 0.026 µg/g. MMP-3: early surgery 0.200 ± 0.142 µg/g, 2–4 months surgery 0.155 ± 0.093 µg/g. Concentrations of MMP-2 were after dilution above working range at 12 µg/l in all tested samples.

Conclusion:
No significant differences in concentrations of protein and MMPs, MMP-1 and MMP-3 according to time of surgery were found.

Key words:
matrix metalloproteinases, cleft lip, wound healing


Autoři: K. Bláha 1;  J. Borský 2;  R. Průša 1;  A. Štekláčová 1;  E. Otoupalová 1;  R. Matějová 1;  M. Pechová 1;  K. Kotaška 1;  T. Dostálová 3
Působiště autorů: Ústav klinické biochemie a patobiochemie UK 2. LF a FN Motol, Praha, přednosta prof. MUDr. R. Průša, CSc., Klinika plastické chirurgie FN Královské Vinohrady, Praha , přednosta doc. MUDr. M. Tvrdek, CSc., Dětská stomatologická klinika UK 2. LF a FN 1
Vyšlo v časopise: Čes-slov Pediat 2012; 67 (1): 11-14.
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Cíl studie:
Cílem bylo analyzovat složky extracelulární matrix zodpovědné za hojení, především stanovit koncentrace matrixových metaloproteináz (MMP-1, MMP-2 a MMP-3) v tkáni odstraněné při operaci. Porovnat hojení ran po operaci rozštěpu rtu do sedmi dnů po narození a hojení ran po operaci podle klasického protokolu ve třech měsících věku.

Materiál a metody:
Vzorky tkáně byly odebrány od 30 dětí (16 chlapců a 14 dívek), 17 dětí bylo operováno během prvního týdne po narození a 13 dětí bylo operováno ve 2–4 měsících věku. Stanovení MMP bylo prováděno v tkáňových zbytcích získaných chirurgickou excizí okrajů rozštěpu rtu, které jsou při výkonu odstraňovány jako nadbytečné. Po odběru byla tkáň skladována zamrazením na -70 ˚C. Extrakce proběhla v kakodylátovém pufru po dobu 24 hodin při teplotě 2–8 ˚C. Ke stanovení koncentrace celkové bílkoviny v tkáni byla zvolena Lowryho metoda. Koncentrace MMP-1, MMP-2, MMP-3 byly stanovovány metodou ELISA, pomocí kitů Amersham Biotrak Activity Assay (GE Healthcare UK).

Výsledky:
MMP-1: u dětí operovaných během prvního týdne po narození byly naměřeny koncentrace 0,017 ± 0,023 µg/g bílkoviny (průměr ± SD), u dětí operovaných ve 2–4 měsících věku 0,028 ± 0,026 µg/g bílkoviny. MMP-3: u dětí operovaných během prvního týdne po narození byly naměřeny koncentrace 0,200 ± 0,142 µg/g bílkoviny, u dětí operovaných ve 2–4 měsících věku 0,155 ± 0,093 µg/g bílkoviny. Koncentrace MMP-2 byly ve všech měřených vzorcích I po zředění vyšší než horní mez koncentračního rozmezí kitů 12 µg/l.

Závěr:
Nezjistili jsme statisticky významné rozdíly v koncentracích celkové bílkoviny, či koncentracích MMP-1, MMP-2 a MMP-3 mezi skupinou dětí operovaných během prvního týdne po narození a skupinou dětí operovaných ve 2–4 měsících věku.

Klíčová slova:
matrixové metaloproteinázy, rozštěp rtu, hojení ran

ÚVOD

Hojení ran je komplexní proces, na němž se podílejí buněčné elementy a mediátory. Zahrnuje reakce mezi buňkami (neutrofily, makrofágy, monocyty, fibroblasty, keratinocyty, lymfocyty a endoteliální buňky) a mediátory (cytokiny, růstové faktory, proteázy, eikosanoidy, kininy a další), produkci buňek a mediátorů, remodelaci a zrání [1]. Ve fázi remodelace hrají významnou roli extracelulární proteázy, především serinové proteázy a matrixové metaloproteinázy (MMP) a jejich tkáňové inhibitory TIMP. MMP jsou zinek dependentní endopeptidázy degradující extracelulární matrix (ECM) a hrají klíčovou roli v její remodelaci. Tyto enzymy mohou zvýšit invazi leukocytů, regulovat zánětlivou aktivitu serinových proteáz, cytokinů a chemokinů [2]. Většina MMP je vylučována z buněk ve formě neaktivního proenzymu (zymogenu) a je aktivována extracelulárně proteinázami, malé množství může být aktivováno chemickou cestou v buňce [3]. Zvýšené koncentrace MMP a TIMP byly pozorovány v souvislosti s rupturou membrán [4].

MMP mohou být též skupinou proteinů zodpovědných za etiologii rozštěpu rtu vzhledem k jejich roli v kraniofaciální modelaci. Při vzniku rozštěpu nedochází při embryonálních faciálních procesech k úplnému spojení, neboť normální vývoj faciálního primordia vyžaduje remodelaci ECM [5]. Kromě výše zmíněného může mít koncentrace MMP a růstových faktorů v plazmě asociace s porodní hmotností, krevním tlakem a vaskulární funkcí [6].

Orofaciální rozštěpy patří k nejčastějším vrozeným vývojovým vadám a labioplastika vede k tvorbě pooperačních jizev ztěžujících socializaci pacientů.

Cílem práce bylo porovnat aspekty hojení ran po operaci rozštěpu rtu do 7 dnů po narození a hojení ran po operaci podle klasického protokolu ve třech měsících věku. Hojení sutury rtu po časné operaci se vyznačuje méně nápadnými jizvami v porovnání s hojením po pozdější operaci rtu provedené podle klasického protokolu. Hlavním cílem práce bylo analyzovat složky ECM zodpovědné za hojení, především stanovit koncentrace matrixových metaloproteináz (MMP-1, MMP-2, MMP-3) v tkáni odstraněné při operaci.

Výše zmíněné metaloproteinázy byly vybrány z důvodu jejich funkce při remodelaci ECM, a to především při štěpení kolagenu. Hojení rány je dáno mnoha faktory, přičemž jedním z nejvýznamnějších faktorů je depozice kolagenu. Fetální hojení je bezjizevnaté. Při depozici kolagenu se vyznačuje zvýšenou organizací kolagenních vláken a vyšším zastoupením kolagenu III ku kolagenu I v porovnání s dospělými jedinci, u nichž se hojení vyznačuje jizvou [7]. MMP-1 patří mezi kolagenázy a její hlavní funkcí je degradace komponent ECM, převážně kolagenu I, II a III. MMP-2 je želatináza a její hlavní funkcí je degradace denaturovaného kolagenu, především kolagenu I, II a III. MMP-3 patří mezi stromelysiny, kromě degradace ECM aktivuje řadu pro-MMP, přičemž hraje klíčovou roli při generaci aktivní MMP-1 [3].

METODY

Vzorky tkáně byly odebrány od 30 dětí (16 chlapců a 14 dívek), 17 dětí operovaných během prvního týdne po narození a 13 dětí operovaných ve 2–4 měsících věku. Analýza byla prováděna v tkáňových zbytcích získaných chirurgickou excizí okrajů rozštěpu rtu, které jsou při výkonu odstraňovány jako nadbytečné. Po odběru byla tkáň skladována zamrazením na -70 ˚C. Po rozmrazení byl vzorek tkáně v prvním kroku analýzy zvážen a extrahován v kakodylátovém pufru (kyselina kakodylová C2H7AsO2 10 mmol/l, NaCl 0,15 mol/l, CaCl2 20 mmol/l, ZnCl2 0,001 mmol/l, NaN3 1,5 mmol/l a 0,01% Triton X-100), kde byl homogenizován. K extrakci byl použit čtyřnásobek hmotnosti vlhké tkáně kakodylátového pufru. Extrakce probíhala 24 hodin při teplotě 2–8 ˚C. Po extrakci byl supernatant oddělen centrifugací (30 minut 13 000 g) a použit k další analýze.

Koncentrace MMP-1, MMP-2 a MMP-3 byly stanovovány metodou ELISA, pomocí kitů Amersham Biotrak Activity Assay (GE Healthcare UK). Vzhledem k dosud nepublikované koncentraci MMP v chirurgicky odstraněné tkáni dětských rozštěpů časně po narození, tj. do jednoho týdne věku novorozence, byla stanovována koncentrace celkových MMP-1 metodou ELISA (rozsah 0,1–50 ng/ml s citlivostí 0,1 ng/ml, měřeno při 405 nm). Koncentrace celkových MMP-3 byly stanovovány metodou ELISA (rozsah 0,25–32 ng/ml s citlivostí 0,1 ng/ml, měřeno při 405 nm). Koncentrace MMP-2 metodou ELISA (rozsah 0,19–12 ng/ml, citlivost 0,19 ng/ml, měřeno při 405 nm). Vzorky, u nichž byly zjištěny koncentrace MMP vyšší než deklarovaná horní mez pracovního rozsahu soupravy, byly ředěny reakčním pufrem (50mM Tris-HCl pufr pH 7,6 obsahující 1,5 mM NaCl, 0,5 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 0,01% (v/v) BRIJTM 35 a 0,005% (w/v) želatinu). Naměřené koncentrace MMP-1 a MMP-3 byly následně vztaženy na koncentraci celkové bílkoviny ve vzorku.

Ke stanovení koncentrace celkové bílkoviny v tkáni byla zvolena Lowryho metoda (Na2CO3 0,19 mol/l, NaOH 0,1 mol/l, CuSO4 0,125 mol/l, C4H4KNaO6 0,095 mol/l, Folinovo činidlo (Na2WO4, Na2MoO4, H3PO3, HCl, Li2SO4, Br), rozsah 0,01 až 1 mg/ml, 750 nm). Metoda byla validována na koncentračních hladinách 0,40 mg/ml (CV1 = 13,43 %) a 0,85 mg/ml (CV2 = 18,25 %).

Statistická analýza

K porovnání koncentrací MMP byl použit neparametrický nepárový t-test na hladině významnosti α = 0,05. Hodnoty p <0,05 byly považovány za statisticky významné. K vyhodnocení byl použit software GraphPad verze 5.03 (San Diego, Kalifornie).

VÝSLEDKY

Koncentrace celkových MMP-1 u dětí operovaných během prvního týdne po narození byly 0,017 ± 0,023 μg/g bílkoviny (průměr ± SD), u dětí operovaných ve 2–4 měsících věku 0,028 ± 0,026 μg/g bílkoviny. Měřením celkových MMP-3 u dětí operovaných během prvního týdne po narození byly zjištěny hodnoty 0,200 ± 0,142 μg/g bílkoviny, u dětí operovaných ve 2–4 měsících věku 0,155 ± 0,093 μg/g bílkoviny. Koncentrace MMP-2 byly ve všech měřených vzorcích i po zředění reakčním pufrem v poměru 1:1 vyšší než deklarovaná horní mez pracovního rozsahu diagnostické soupravy (>12 ng/ml). Výsledky MMP-2 tedy nelze validně statisticky vyhodnotit.

Ačkoliv je mezi průměrnými hodnotami MMP-1 a MMP-3 v obou skupinách nápadný rozdíl, nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly ani v množství celkové bílkoviny, ani v koncentracích MMP mezi oběma skupinami podle časnosti operace (neparametrický t-test; p = 0,42 (MMP-1) a p = 0,49 (MMP-3)).

DISKUSE

Naše práce se zabývá dosud nepublikovaným tématem stanovení koncentrací MMP metodou ELISA v chirurgicky odstraněné tkáni dětských rozštěpů časně po narození, tj. do jednoho týdne věku novorozence, stanovení koncentrací MMP metodou ELISA v tkáni dětských rozštěpů odstraněné během 2–4 měsíců věku a následném porovnání výsledků obou skupin.

Na základě studie Letra a spol. popisující vliv polymorfismů v promotorech genů MMP-1 a MMP-3 v souvislosti s rozštěpem rtu [5] a studie Brown a spol. popisující roli MMP-3 při vývoji patra u myší [8] a na základě prací popisujících vliv MMP na vývoj kůže během různých gestačních období [9, 10] jsme předpokládali, že koncentrace MMP v tkáni se po narození fetu mohou měnit s časem a vzhledem k roli MMP při remodelaci ECM budou mít vliv na hojení ran. Tento předpoklad vedl k hypotéze, že v tkáni odstraněné při operaci v různém čase se budou koncentrace MMP lišit.

Li a kol. ve své studii popisují vliv MMP na vývoj kůže během různých gestačních období. Bylo pozorováno, že v kůži fetů v gestačním období 12 až 18 týdnů byly vysoké hladiny MMP-2, MMP-3 a MMP-9, přičemž hladiny v období 24–40 týdnů byly v porovnání s hladinami v období 12–18 týdnů signifikantně nižší. Studie poukazuje na možnost vztahu vyšších hladin MMP-2 a MMP-3 s bezjizevnatým hojením kůže v souladu s raným gestačním obdobím [9]. Při zkoumání hojení ran v ještě ranějších fázích gestačního období u myších fetů byly pozorovány obdobně zvýšené hladiny MMP u ran hojících se bez jizvy v 16. dni gestačního období v porovnání s ranami hojícími se jizvou v 18. dni gestačního období. Maximální vzrůst exprese MMP-1 byl rychlejší a mnohem vyšší u bezjizevnatého hojení [10].

Koncentrace MMP-3 stanovené v souboru našich pacientů naznačují vyšší hodnoty u vzorků pacientů hojících se méně nápadnou jizvou (děti operované během prvního týdne po narození) v porovnání s koncentracemi vzorků pacientů hojících se jizvou (operace během 2–4 měsíců věku). Rozdíly mezi oběma skupinami však nejsou statisticky signifikantní. Koncentrace MMP-1 v tkáni dosahují nižších koncentrací u vzorků pacientů hojících se méně nápadnou jizvou v porovnání s koncentracemi pacientů hojících se jizvou, což je v rozporu s předpokladem vycházejícím z výše uvedených studií.

Ačkoliv je mezi průměrnými hodnotami MMP-1 a MMP-3 v obou skupinách nápadný rozdíl, nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly ani v množství celkové bílkoviny, ani v koncentracích MMP mezi oběma skupinami podle časnosti operace (neparametrický t-test na hladině významnosti p = 0,42 (MMP-1) a p = 0,49 (MMP-3)). Příčinou může být malý soubor pacientských vzorků a malé množství tkáně odstraněné při excizi.

Vliv koncentrací MMP na hojení uvedené v závěrech výše uvedených studií a předpoklady, že koncentrace MMP se v tkáni odstraněné při operaci v různém čase budou lišit, naše výsledky statisticky nepotvrdily. Rozdíly v hypotéze v porovnání s výsledky naší studie mohou být dány několika technickými odlišnostmi (malé množství tkáně odstraněné při excizi, charakter zpracovávané tkáně (kůže, podkoží, sliznice), přítomnost fyziologického roztoku s roztokem adrenalinu).

Pro spolehlivou analýzu je problematické malé množství tkáně odstraněné při chirurgické excizi (průměrně 100 mg vlhké tkáně) u jednoho pacienta. Malé množství vzorku jednoho pacienta bylo limitující pro měření více druhů MMP v jednom vzorku. Tento problém byl řešen výběrem vzorků obsahujících co největší množství tkáně. Přestože byli všichni pacienti operováni jedním chirurgem stejným postupem, mohly se vyskytnout rozdíly v jednotnosti tkáně vzhledem k různé kvantitě kůže, podkoží a sliznice. Pro další měření by bylo vhodné provést separaci tkání ve vzorku na kůži, podkoží a sliznici.

Analýzu mohla dále ovlivnit přítomnost fyziologického roztoku obsahující adrenalin (na 10 ml fyziologického roztoku jedna kapka roztoku adrenalinu), který je infiltrován do tkáně při chirurgickém výkonu. Přítomnost roztoku mohla falešně zvyšovat koncentrace MMP v tkáni, nikoli však významným způsobem ovlivnit rozdíly v obou skupinách vzhledem k časnosti operace. Při dalších měřeních by proto bylo vhodné stanovit koncentrace MMP u skupiny pacientů, u nichž se neprovádí infiltrace roztoku a vyloučit tak případné pochybnosti o možnosti pozitivního ovlivnění koncentrací MMP. Přítomnost fyziologického roztoku s roztokem adrenalinu by mohla zvyšovat především nepřesnost při navážce a přepočtu množství celkové bílkoviny a MMP na vlhkou tkáň. Tyto nepřesnosti jsme eliminovali vztažením všech MMP na celkovou bílkovinu naměřenou ve vzorku.

Pro potvrzení teorie odlišnosti koncentrací MMP mezi skupinami dětí operovaných časně a podle klasického protokolu by bylo vhodné rozšířit zkoumaný soubor pacientů v obou skupinách a stanovit koncentrace a aktivity i jiných MMP.

Práce vznikla za podpory grantu IGA MZ ČR č. 10012-4.

Došlo: 29. 3. 2011

Přijato: 27. 9. 2011

Ing. Karel Bláha

Ústav klinické biochemie a patobiochemie

FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5

e-mail: blaha.karel@fnmotol.cz


Zdroje

1. Broughton G, Janis J, Attliger Ch. The basic science of wound healing. Plast Reconstr Surg 2006 Jun; 117 (Suppl 7): 12S–34S.

2. Le NT, Xue M, Castelnoble LA, Jackson CJ. The dual personalities of matrix metalloproteinases in inflammation. Front Biosci 2007 Jan; 112: 1475–1487.

3. Visse R, Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function and biochemistry. Circ Res 2003; 92 (8): 827–839.

4. Edvin SS, Romeo R, Rathnasabapathy CM, Athaydel N, Amant DR, Subramanian MG. Protein dinase C stimulates release of matrix metalloprotein kinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 by human decidual cells. J Matern Fetal Neonatal Med 2002 Oct; 12 (4): 231–236.

5. Letra A, Silva RA, Mezenes R, Astolfi CM, Shinohara A, de Souza AP, Granjiero JM. MMP genepolymorphisms as contributors for cleft lip/palate: Association with MMP3 but not MMP1. Arch Oral Biol 2007 Oct; 52 (10): 954–960.

6. Sesso R, Franco MC. Abnormalities in metalloproteinase pathways and IGF-I axis: a link between birth weight, Hypertension, and vascular damane in childhood. Am J Hypertens 2010 Jan; 23 (1): 6–11.

7. Chen W, Fu X, Ge S, Sun T, Sheng Z. Differential expression of matrix metalloproteinases and tissue-derived inhibitor of metalloproteinase in fetal and adult skins. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39 (5): 997–1005.

8. Brown NL, Yarram SJ, Mansell JP, Sandy JR. Matrix metalloproteinases have a role in palatogenesis. J Dent Res 2002 Dec; 81 (12): 826–830.

9. Li WJ, Chen W, Fu XB, Zhu RZ. Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in fetal skin and their biological significance. Zhuongo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue 2006 May; 18 (5): 303–306.

10. Dang CM, Beanes SR, Lee H, Zhang X, Soo C, Ting K. Scarless fetal wounds are associated with an increased matrix metalloproteinase-to-tissue-derived inhibitor of metalloproteinase ratio. Plast Reconstr Surg 2003; 111 (7): 2273–2285.

Štítky
Neonatologie Pediatrie Praktické lékařství pro děti a dorost

Článek vyšel v časopise

Česko-slovenská pediatrie

Číslo 1

2012 Číslo 1

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Léčba bolesti v ordinaci praktického lékaře
nový kurz
Autoři: MUDr. PhDr. Zdeňka Nováková, Ph.D.

Revmatoidní artritida: včas a k cíli
Autoři: MUDr. Heřman Mann

Jistoty a nástrahy antikoagulační léčby aneb kardiolog - neurolog - farmakolog - nefrolog - právník diskutují
Autoři: doc. MUDr. Štěpán Havránek, Ph.D., prof. MUDr. Roman Herzig, Ph.D., doc. MUDr. Karel Urbánek, Ph.D., prim. MUDr. Jan Vachek, MUDr. et Mgr. Jolana Těšínová, Ph.D.

Léčba akutní pooperační bolesti
Autoři: doc. MUDr. Jiří Málek, CSc.

Nové antipsychotikum kariprazin v léčbě schizofrenie
Autoři: prof. MUDr. Cyril Höschl, DrSc., FRCPsych.

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se