Obecné zásady práce s resekovanými tkáněmi a orgány určenými pro histopatologické vyšetření – požadavky patologů na chirurgy


General principles of handling tissues and organs intended for examination in histopathology – pathologists’ requirements for surgeons

Histopathology has continued to develop into a complex discipline of laboratory medicine in the last 30 years. Implementation of new techniques such as immunohistochemistry, in situ hybridization, molecular pathology and gene profiling yields a large amount of information which is used not only to establish diagnosis, but also for prediction and prognosis. The basic conditions for precision and correctness of this information which directly influence the choice of therapy and the outcome for the patient, and eventually the health and the life of the patient, are obtaining a suitable specimen and the best laboratory processing. The first step in this procedure is collection of samples, fixation and submission to the pathology laboratory - the pre-analytical phase. Knowledge of the principles of this phase and their implementation in daily practice in surgery is of main importance for the quality and quantity of information obtained. We introduce the basic rules for proper handling of different specimens depending on the use of conventional and “new” histopathology methods.

Key words:
histopathology – pre-examination phase – fixation – handling of specimens


Autoři: M. Trnková
Působiště autorů: BIOLAB Praha, k. s., ředitelka: MUDr. M. Trnková
Vyšlo v časopise: Rozhl. Chir., 2014, roč. 93, č. 3, s. 156-163.
Kategorie: Postgraduální vzdělávání

Práce je určena k postgraduálnímu vzdělávání lékařů.

Souhrn

Histopatologie se zejména v posledních 30 letech vyvinula v komplexní obor laboratorní medicíny. Zavedení nových metod jako imunohistochemie, in situ hybridizace, molekulární patologie a genetické profilování přináší množství informací, které slouží nejen ke stanovení vlastní diagnózy, ale i prognózy pacienta a předpovědi reakce na léčbu. Předpokladem pro přesnost a správnost těchto informací, které přímo ovlivňují volbu a výsledek dalších léčebných postupů a v konečném důsledku zdraví a život pacienta, je získání vhodného vzorku a jeho správné laboratorní zpracování. Prvním krokem v tomto procesu je odběr vzorku, fixace a jeho transport do laboratoře – preanalytická fáze. Znalost pravidel této fáze a jejich standardní používání v chirurgické praxi má rozhodující význam pro kvalitu i kvantitu získaných informací. Uvádíme obecné postupy pro manipulaci s různými druhy vzorků v závislosti na jejich využití pro tradiční i „nové“ metody v histopatologii.

Klíčová slova:
histopatologie – preanalytická fáze – fixace – manipulace se vzorky

Úvod s trochou historie ústy doktora Williama Jamese Mayo (1861–1939):
‘‘I wish you pathologists would find a way to tell us surgeons whether a growth is cancer or not while the patient is still on the table.’’

Začátek histopatologického vyšetřování chirurgických vzorků sahá do druhé poloviny 19. století, kdy zdokonalováním hemostázy a anestezie došlo k rozvoji chirurgických technik a zesílila tak potřeba po správné a rychlé diagnostice. Vnesení patologie, která byla schopná rozlišit chorobné procesy, zejména záněty od nádorů a maligní nádory od benigních, na operační sál, zásadně ovlivnilo chirurgické postupy, radikalitu výkonu a v neposlední řadě i prognózu pacienta. Základní předpoklady byly koncem 19. století již splněny.

Z technického hlediska byl vynalezen mikroskop a řada histologických a histochemických technik, které umožňovaly zpracovat vzorky na řezy a obarvit je tak, aby bylo možno rozlišit jednotlivé buňky a tkáně a jejich patologické změny.

Chirurgové a patologové byli vybaveni vědomostmi, získanými desetiletími pozorování fyziologických a chorobně změněných autoptických tkání a buněk, popsaných zakladateli patologie Karlem Rokitanským (1804– –1878) a Rudolfem Virchowem (1821–1902).

Zpracování tkání – dr. W. J. Mayo se dočkal

V roce 1981 se dr. William H. Welch, první profesor Ústavu patologie John Hopkins Hospital a učitel a kolega prof. Williama S. Halsteda, jako jeden z prvních pokusil o stanovení peroperační diagnózy pomocí zmrazených řezů. Traduje se, že stanovení trvalo tak dlouho, že prof. Halsted musel operaci prsu ukončit, aniž by se dočkal diagnózy.

Ale už v roce 1905 prof. Louis B. Wilson, patolog Mayo Clinic, publikoval v časopise The Journal of the American Medical Association (1905;45:1737) techniku rychlého zmrazení tkáně a přípravy preparátu pro peroperační diagnostiku. Používal Spencerův automatický zmrazovací mikrotom a diagnóza byla hotová do 5 minut.

Uvádí se, že zavedením peroperačních vyšetření klesl počet inoperabilních karcinomů v Johns Hopkins Hospital v letech 1900 až 1920 z 50 % na méně než 5 %.

Počátek 20. století přinesl novou diagnostickou metodu – biopsii, tedy excizi části či celého chorobného ložiska nebo orgánu za účelem stanovení diagnózy.

Zpracování biopsie pak probíhalo standardní metodou, v obdobných krocích, jaké používáme dodnes:

Zalévání tkáně do parafínu

Za autora této techniky – odvodnění tkáně alkoholem a obalení do parafínu – je považován profesor pražské tehdy Karlo-Ferdinandovy univerzity v letech 1873–82 patolog Edwin Klebs (1834–1913). Zalévání do bločků použil v roce 1959 v Chicagu prof. McCormick.

V současné době jsou standardním vybavením laboratoře patologie automatické tkáňové procesory, do kterých se vzorky tkáně vkládají v jednorázových kazetách, označených ID pacienta. Zalévací parafínové linky umožňují rychlé vytvoření parafinového bločku, kde původní kazetka slouží jako nosič. Novinkou v přístrojovém vybavení je spojení tkáňového procesoru s automatickým zaléváním bloků.

Krájení řezů na mikrotomu

Název mikrotom použil poprvé A. Oschatz, asistent prof. Jana Evangelisty Purkyně, pro popis nástroje na krájení preparátu, který prof. Purkyně zdokonaloval v letech 1832–1845.

Vylepšováním za přispění např. profesora anatomie Karla Toldta (1840–1920) tak vznikl přístroj, kde je obvykle vzorek upnut a žiletkový nůž se proti němu pohybuje ve standardní vzdálenosti a vznikají tak řezy o tloušťce 2–5 mikronů.

V současné době existují mikrotomy mechanické i polo nebo zcela automatické, sáňkové nebo rotační.

Pro krájení zmrazených vzorků byly vyvíjeny různé typy zmrazovacích mikrotomů. U prvních modelů, jako např. kryostat Linderstrom-Lang a Morgensen z roku 1938, byla tkáň mražena suchým ledem, který byl postupně nahrazen CO2, tekutým dusíkem a mrazicím zařízením.

Barvení

Kombinované barvení hematoxylinem a eosinem (popsané Wissowzkým, Schwarzem aj. kolem roku 1876) je základním barvením v histopatologii dodnes. Jeho výhodou je schopnost barvit širokou paletu tkání a struktur. Hematoxylin, který barví modře až černě jádra, se připravuje různými způsoby a každá laboratoř má svůj standard, nejčastěji se používají kamencové hematoxyliny Mayerův, Harrisův nebo Gillův, nebo železitý Weigertův hematoxylin. Eosinem se pak barví růžově cytoplazma a většina pojivových tkání v různé intenzitě růžové – oranžové – červené.

Existují stovky dalších receptur zaměřených na ozřejmění buněčných či tkáňových struktur, buněčných produktů, pigmentů, minerálů či mikroorganismů, z nich se v běžné praxi patologické laboratoře užívá kolem třiceti.

Vlastní barvení dnes probíhá v barvicích automatech s komerčně dodávanými barvivy, často v kitech.

Kanadský balzám, od doby J. E. Purkyně používaný na montování řezů pod krycí sklo, nahradila koncem 20. století komerčně dodávaná montovací média a místo krycího skla se stále častěji používají transparentní fólie.

Moderní barvicí automaty jsou již propojeny v automatickou linku s pokrývacím (montovacím) automatem.

Speciální metody

Enzymová histochemie

Metoda spočívá v histochemickém průkazu enzymů v místě jejich aktivity. Zakladatelem histochemie u nás a průkopníkem světového formátu byl prof. Zdeněk Lojda, DrSc. (1927–2004), mimo jiné nositel titulu Průkopník histochemie (Pioneer’s award of IFHS Washington, 1988).

Metoda má stále uplatnění např. v detekci deficitů enzymů tenkého střeva při diagnostice celiakie a svalových onemocnění.

Imunohistochemie

Metoda založená na vizualizaci reakce dodávané protilátky s antigenem, přítomným ve tkáni.

Od 70. let 20. století, kdy se začaly specifické, poly i monoklonální protilátky komerčně vyrábět, došlo rychle k rozšíření této metody a v současnosti je standardním vyšetřovacím nástrojem, bez kterého se patologie neobejde nejen při vlastní diagnostice, ale ani při stanovování prediktivních i prognostických markrů, průkazu mikroorganismů apod.

Elektronová mikroskopie

Elektronová mikroskopie využívá podstatně kratší vlnové délky, která umožňuje rozlišení na ultrastrukturální úrovni, což má obrovský význam ve výzkumu. V rutinní diagnostice se možnosti pozorovat buněčné organely a substance, např. mitochondrie, buněčné membrány, event. depozita různých látek, využívá v omezenější míře, nepostradatelná je však v oblasti nefropatologie a neuromuskulárních onemocnění. Tato vyšetření vyžadují zvláštní přípravu vzorků a provádějí se v České republice pouze na několika specializovaných pracovištích.

Molekulárně genetické metody – molekulární patologie

Jedná se o řadu metod, jejichž pomocí jsme schopni ozřejmovat molekulární mechanismy vniku nemocí. Rychlý vývoj těchto metod v posledním desetiletí otevřel cestu k novým klasifikacím nádorových onemocnění, které umožňují např. cílit a personalizovat léčbu.

Jejich využití v diagnostice je stále širší, proto znalost indikací, ale i limitací je důležitá i v denní chirurgické praxi. Těmto metodám a požadavkům na preanalytickou fázi se věnuje samostatný článek.

Preanalytická fáze = od rukou chirurga na operačním sále k rukám patologa v laboratoři

Odběr vzorku a manipulace s ním v průběhu transportu do laboratoře patologie je první část procesu zpracování vzorku. Na kvalitě této fáze závisí, zda bude vzorek vůbec zpracovatelný a jaké množství validních informací z něj dokáže patolog získat.

Preanalytickou fázi ovlivňují pracovníci mimo laboratoř, a to:

  • chirurg
  • sálová sestra
  • pracovník transportní služby

Pro všechny zúčastněné vydávají akreditované laboratoře dokumentované postupy – manuály (nazvané např. laboratorní příručka nebo příručka pro odběr vzorků), kde jsou podrobně popsána pravidla, shrnutá v následujících odstavcích.

Proto: Chcete-li, aby vaše práce chirurga byla dokonalá, věnujte čas a péči i vzorku.

Odběr vzorku

  • omezení zhmoždění

Již při vlastním chirurgickém zákroku je nutné předejít zhmoždění vyjímané tkáně.

Nejčastější způsoby zhmoždění a vzniku artefaktů jsou: stlačení čelistmi pinzet, prošití léze pomocným stehem či svorkou, instilace anestetika do léze, termické artefakty vzniklé účinkem laseru či elektrokauteru.

Zhmoždění tkáně a artefakty mohou zcela znemožnit hodnocení, nebo dokonce vést k diagnostickému omylu.

  • orientace a značení vzorku

Po vyjmutí tkáně z těla je nutné ji zorientovat tak, jak byla původně v těle uložena, a smysluplně označit resekční okraje, event. místo předpokládané léze.

Značení je třeba provádět v souladu s pokyny laboratoře, má-li být excize orientována prostorově, musí být označena nejméně ve třech směrech.

Všechny způsoby značení musejí být provedeny s minimálním porušením tkáně a vždy mimo vlastní vyšetřovanou lézi.

Fixace

Po označení musí být vzorek okamžitě vložen do fixační tekutiny, aby se zabránilo autolýze, tj. degradaci buněčného obsahu uvolněnými enzymy (Obr. 1).

V patologii se využívají jak fyzikální způsoby fixace – již popisované zmražení tkání, tak chemické, pomocí fixačních roztoků, kterých existuje celá řada, a rozdělují se nebo kombinují podle účinku na tkáň.

  • formol

Základním fixačním médiem je 10% formaldehyd (formol). Jedná se o vodný koncentrát – 40% formaldehyd, naředěný vodou 1:10.

Použití formolu k fixaci tkání pro mikroskopii se datuje ke konci 19. století, např. Luis Pasteur fixoval formaldehydem mozky zemřelých na vzteklinu.

Princip: Fixací formolem dochází ke vzniku zkřížených vazeb – můstků mezi bílkovinnými řetězci, které obsazují vazebné místo enzymu, a zabraňují tak degradaci jak bílkovin, tak nukleových kyselin.

Základními parametry, které ovlivňují zachování tkáně, jsou tloušťka tkáně, množství formolu a doba fixace.

Fixační roztok musí být čerstvý, dlouhodobým skladováním dochází k chemickému rozkladu na metanol a kyselinu mravenčí, která by vzorek znehodnotila.

S výhodou se používá neutrální pufrovaný (pH stabilizovaný) formaldehyd.

Délka fixace: formol prostupuje tkání rychlostí asi 1 mm za hodinu! Jeho účinek zeslabuje např. větší přítomnost krve. Rychlost prostupu tkání roste s teplotou, pro urychlení lze použít i např. mikrovlny.

Proto:

optimální doba fixace: 8–48 hodin, v závislosti na velikosti vzorku,

množství formolu – množství formolu má být minimálně 10x větší než objem tkáně,

vhodná nádoba – větší vzorek by neměl ležet na dně (vhodné podložit buničinou) a musí být ponořen (vhodné překrýt buničinou nasáklou formolem). Při fixaci dochází ke ztuhnutí tkáně ve tvaru, v jakém je položena do nádoby, proto z nádoby malé nebo s úzkým hrdlem nelze po fixaci vzorek vyjmout,

koncentrace – formol by měl mít správnou koncentraci – při naředění např. přidáním krvavé tekutiny společně se vzorkem se fixace zpomaluje, při zvýšení koncentrace (např. použití neředěného formaldehydu) vzorek ztvrdne a nelze ho zpracovat,

teplota – vzorek by měl být uložen při pokojové teplotě, nízká teplota vadí více než vysoká, při uložení do mrazničky formol ztuhne a nedochází k fixaci.

další fixativa:

  • dehydratační fixativa,
  • alkoholy, metanol, aceton – využívané zejména k fixaci cytologických nátěrů,
  • Carnoyův roztok používaný na projasňování tukové tkáně k vyhledávání lymfatických uzlin atd.,
  • kombinace dehydratačních fixativ s formaldehydem,
  • Buinův roztok (s přidáním kyseliny pikrové) – používaný k fixaci tkáně varlat při hodnocení spermatogeneze apod.

Pro speciální účely existují k tomu určená fixační média.

Proto:

Při fixaci postupujte vždy podle doporučení spolupracující laboratoře patologie.

Speciální vyšetření vyžadují často speciální preanalytickou fázi.

Skladování vzorku do transportu

Vzorky nefixované – např. určené pro peroperační, imunofluorescenční vyšetření nebo punktáty pro cytologické vyšetření je nutné transportovat do laboratoře ihned, po dobu transportu udržovat v chladu (nedávat na led, ale obalit např. fyziologickým roztokem zvlhčenou gázou) nebo po nezbytnou dobu po odběru v chladničce.

Vzorky ve fixační tekutině – skladovat při pokojové teplotě.

Vzorky ve fixaci vydrží týdny, dlouhá doba fixace však limituje použití pro imunohistochemická a cytogenetická vyšetření. Proto by měl být vzorek dopraven do laboratoře během 1–2 dnů.

Identifikace pacienta

Nutnost absolutní jistoty identifikace vzorku není asi potřeba zdůrazňovat. Ke každému vzorku zasílanému k laboratornímu vyšetření musí být vystaven průvodní list, vzorek bez průvodky musí laboratoř označit jako neshodný a tuto neshodu vyřešit.

Vzorek musí být označen, nejlépe štítkem s nejméně dvěma identifikačními údaji – jménem pacienta a číslem pojištěnce.

Průvodka musí být označena shodně jako vzorek, při zasílání více vzorků od jednoho pacienta je nutné označit nádobky se vzorky číselnou řadou a počet nádobek s další specifikací uvést na průvodce. Excize více lézí z různých lokalit by se měly zasílat v nádobkách samostatně, jinak není možné topografické určení.

Průvodka musí obsahovat tyto údaje:

  1. Identifikaci pacienta:
  2. jméno, příjmení, pohlaví, rok narození a číslo pojištěnce (rodné číslo) pacienta, příslušnost ke zdravotní pojišťovně, event. Uvést, zda jde o samoplátce.
  3. Identifikaci žadatele o vyšetření – zařízení a lékaře, IČP a razítko zařízení, tel. kontakt pro hlášení statimového nebo neočekávaného nálezu.
  4. Druh vzorku, rozsah a lokalizaci léze.
  5. Požadované vyšetření (např. statim, imunohistochemické vyšetření, ISH apod.).
  6. Klinické informace o pacientovi – stručná klinická diagnóza, doba trvání nemoci, předchozí léčba či vyšetření jinde (ozařování, chemoterapie, pokud je známo i číslo biopsie z jiného pracoviště), u gynekologických vyšetření údaj o PM, u diagnostických nenádorových kožních biopsií je vhodný i popis dermatologa.
  7. Datum a čas odběru vzorku.
  8. Potřeba standardizace všech kroků preanalytické fáze se promítá i do nutnosti sledovat a zaznamenávat čas, a to nejen u peroperačních biopsií. Například kvantitativní vyhodnocování exprese různých imunohistochemických markrů a zavádění cytogenetických metod se neobejdou bez standardizace fixace včetně sledování a záznamu doby mezi vyjmutím tkáně a vložením do fixační tekutiny a celkové délky fixace.

Z uvedeného vyplývá první – vstupní – úkol laboratoře: Prověřit, zda je vzorek řádně identifikován, je vybaven průvodkou, jeho množství a kvalita je vhodná pro požadované vyšetření a zda laboratoř je vůbec schopna požadované vyšetření udělat.

Druhy vzorků a pravidla pro preanalytickou fázi:

Druh, množství, resp. velikost a kvalita vzorku by měly odpovídat účelu, pro který je vzorek odebírán. Z tohoto pohledu mohou být vyšetření v patologii rozdělena na:

  • diagnostická
  • terapeutická
  • prognosticko-prediktivní

Odebraný vzorek je většinou unikátní, nenahraditelný, proto je smyslem vyšetření získat maximum možných informací, čímž se stírají hranice tohoto účelového dělení. Přesto v průběhu času se některé druhy vyšetření dostávají do popředí a nabývají většího významu, přínos jiných se naopak omezuje na přesně definované oblasti, což bude podotknuto dále.

Vzorky určené pro cytologické vyšetření

Cytologie využívá minimálního množství vzorku ke stanovení diagnózy na základě morfologie buněk, jejich buněčných detailů a charakteristik nejužšího prostředí, s minimální možností posoudit strukturální uspořádání.

Vzorek je získáván stěrem přístupných povrchových partií těla, zejména sliznic, nebo exkretů natřených přímo na podložní sklo, výplachem, resp. punkční aspirací tekutin z dutin anatomických či vzniklých za patologických stavů, tj. cysty, bursy atd., nebo aspirací solidní tkáně orgánu nebo patologického útvaru (punkce tenkou jehlou tzv. FNAB – štítná žláza, lymfatické uzliny, mama atd.). Další možností je tzv. otisk tkáně přímo na sklo.

Do laboratoře se pak vzorek zasílá v podobě:

  • nátěr na skle – otisky, stěry, FNAB – odebraný vzorek se rozetře na sklo a obvykle fixuje, podle pokynů laboratoře pro konkrétní odběr, nejčastěji alkoholovými fixačními roztoky,
  • v tekutém médiu (liquid based cytologie) – odběrový kartáček se vytřepe do nádobky s transportním médiem a preparát je zhotoven v laboratoři,
  • tekutina, získaná punkcí nebo laváží (likvor, bronchoalveolární laváž – BAL, kloubní punktáty, pleurální výpotky atd.) – do laboratoře se zasílají nefixované, v uzavřených nádobách, po dobu skladování a transportu se musejí udržovat v chladu (2–8 °C), vyšetření musí být provedeno nejpozději do 48 hodin od odběru,
  • moč určená k cytologickému vyšetření vyžaduje fixaci a způsob manipulace podle pokynů laboratoře.

Vyjma punkcí cyst a výpotků se jedná vesměs o diagnostická vyšetření, jejichž výsledek by měl být posuzován s ohledem na limity cytologické diagnostiky. Výhodou zasílání vzorků v podobě aspirátu je možnost dalšího zpracování do cytobloku, kdy z buněčných trsů či tkáňových fragmentů se po centrifugaci vytvoří standardní histologickou technikou parafínové bloky, které umožňují využít širší paletu metod, např. imunohistochemie či cytogenetiky, a tím vyššího stupně typizace patologického procesu.

Důležité uplatnění má cytologie i jako stagingová metoda (např. přítomnost nádorových elementů v laváži dutiny břišní u gynekologických nádorů či v otiscích sentinelových uzlin).

Výhodou cytologie je dosažení výsledku v krátkém čase a při nízkých nákladech.

Nevýhodou pak nutnost značné erudice diagnostika a limity, dané množstvím vzorku.

Vzorky určené pro histologické vyšetření – biopsie

jehlové biopsie – (biopsie tlustou jehlou, core cut)

Současné odběrové techniky umožňují získávání válečků tkáně dostatečných pro velmi komplexní diagnostiku, prakticky ze všech parenchymatózních orgánů, měkkých tkání či solidních patologických útvarů.

Odběr: K odběru se používají obvykle jehly 6-18-gauge, kterými se získávají válečky tkáně od 0,7 do 4 mm tloušťky a délky i přes 20 mm. Stereotaktické nebo ultrazvukem navigované biopsie lokalizují odběr se značnou přesností.

Míra zhmoždění je při správném odběru minimální, vyžaduje však šetrnou manipulaci a okamžitou fixaci v nádobě s plochým dnem nebo ve speciálních kazetách vhodných i např. k následnému RTG vyšetření vzorku.

Správně odebraná jehlová renální biopsie umožňuje i rozdělení vzorku na části pro různé typy vyšetření – elektronovou mikroskopii, fluorescenční vyšetření i klasickou světelnou mikroskopii.

Výtěžnost těchto biopsií v nádorové diagnostice je vysoká, zahrnuje jak vlastní typizaci nádoru včetně gradingu, vyšetření prognostických a prediktivních markrů (Obr. 1a,d,f).

Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu:
a) Autolýza tkáně v barvení hematoxylinem a eosinem (HEO) – setření buněčných hranic a jaderných detailů. Diagnostika je ztížená, grade nelze stanovit.
Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma:
a) Autolysed tissue stained with hematoxylin and eosin (HEO) – blurring of cell borders and nuclear details. Diagnosis is difficult, and the grade cannot be established.
Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu: a) Autolýza tkáně v barvení hematoxylinem a eosinem (HEO) – setření buněčných hranic a jaderných detailů. Diagnostika je ztížená, grade nelze stanovit. Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma: a) Autolysed tissue stained with hematoxylin and eosin (HEO) – blurring of cell borders and nuclear details. Diagnosis is difficult, and the grade cannot be established.

Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu:
d) Stejný nádor v jehlové biopsii s jednoznačnou 100 % membránovou pozitivitou HER 2 skore 3+.
Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma: d) The same tumour in a needle-core biopsy with unequivocal strong circumferential membrane staining in 100% of tumour cells – score 3+
Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu: d) Stejný nádor v jehlové biopsii s jednoznačnou 100 % membránovou pozitivitou HER 2 skore 3+. Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma: d) The same tumour in a needle-core biopsy with unequivocal strong circumferential membrane staining in 100% of tumour cells – score 3+

Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu:
f) Stejný nádor ve správně fixované jehlové biopsii – červené signály centromery 17, hnědé HER2/neu. Poměr HER2/CEN17 > 2, byla nalezena amplifikace a pacientka je indikovaná k léčbě Herceptinem.
Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma: 
f) The same tumour in a correctly fixed needle-core biopsy – red signals of CEN17 and brown signals for HER2. The ratio of HER2 to CEN17 is greater than 2, i.e., HER2 gene is amplified and the patient is a candidate for HER2-targeted therapy (e.g. trastuzumab).
Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu: f) Stejný nádor ve správně fixované jehlové biopsii – červené signály centromery 17, hnědé HER2/neu. Poměr HER2/CEN17 > 2, byla nalezena amplifikace a pacientka je indikovaná k léčbě Herceptinem. Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma: f) The same tumour in a correctly fixed needle-core biopsy – red signals of CEN17 and brown signals for HER2. The ratio of HER2 to CEN17 is greater than 2, i.e., HER2 gene is amplified and the patient is a candidate for HER2-targeted therapy (e.g. trastuzumab).

Použití jehel větších kalibrů má současně i efekt terapeutický – je tak možné minimálně invazivní metodou, ambulantním zákrokem odstranit menší lézi v celém rozsahu.

Endoskopické vzorky – např. gastroenterobiopsie, biopsie respiračního a močového traktu a punch biopsie povrchově přístupných orgánů – kůže, čípek děložní apod.

V obou případech se obvykle jedná o diagnostické vzorky tkáně velikosti 1–5 mm v průměru.

Odběr: Okamžitá fixace a šetrná manipulace je nezbytná. Např. položením na papír do očíslovaných kroužků a následným vložením do nádoby s formolem je možné snadno a rychle topograficky zařadit více odběrů. Vlastní orientace tkáně je pak v rukou zkušené laborantky.

Výtěžnost: Endoskopické odběry mají jak diagnostický, tak často i terapeutický význam, takže např. při polypektomiích je možné vzorek zorientovat tak, aby byl patolog schopen popsat i kompletnost afekce v odběru a vzdálenost afekce od okrajů. Limitace hodnocení někdy způsobují termické změny při použití elektroablačních zařízení.

Zvláštní pravidla platí pro enterobiopsie k histochemickému vyšetření a punch biopsie kůže pro imunofluorescenční vyšetření, kdy je třeba opět postupovat podle pokynů dané laboratoře.

Současná patologie tak výrazně předběhla přání doktora W. J. Mayo – díky jehlovým a endoskopických biopsiím vstupuje chirurg do terapeutického procesu často až po onkologovi a je postaven do situace, kdy operuje lůžko nádoru, který v případě kompletní remise po neoadjuvanci již není přítomen. Roste tak význam spolupráce s radiology, kteří musejí místo nádoru označit, aby bylo vůbec dohledatelné.

V momentě operace by měl dnes ve většině případů chirurg znát nejen diagnózu, staging, ale často i prognózu pacienta:

  • kožní excize

probatorní excize – optimální odběrová technika pro diagnostiku kožních zánětů.

Odběr by měl obsahovat vyvinutou eflorescenci bez sekundárních změn, nejlépe s okrajem nepostižené kůže, označené např. tuší. V každém případě by měla být zastižena kůže v celé tloušťce až na hranici tukové subkutis, optimálně průbojníkem o průměru 3–5 mm.

Člunkovitá excize malých rozměrů je pro účely diagnostiky zánětů nevhodná jednak pro obvykle malou hloubku získaného vzorku, jednak dochází při odběru k daleko většímu zhmoždění, které limituje hodnocení.

V indikovaných případech zejména v kosmeticky nepříznivé lokalitě lze průbojníkovou excizi použít i k diagnostice nádorových i melanocytárních lézí, odběr by však měl být veden dermatologem.

Shave biopsie – povrchový odběr určený k odstranění verukozit kůže s prokázanou benigní povahou. Není vhodná pro terapii ani diagnostiku změn, které zasahují hlouběji než do epidermis.

Člunkovitá excize – standardní metoda pro totální excizi nádorové či nenádorové kožní léze.

Odběr:

Ložisko by mělo být odstraněno s lemem zdravé tkáně. Suspektní melanocytární léze se doporučuje excidovat s 2mm lemem zdravé tkáně.

Orientace a fixace: Větší excize je možné topograficky orientovat např. založením stehu, klipem či barevnou značkou. Tenčí excize mají tendenci se srolovat, proto je vhodné je napnout na korkovou destičku nebo položit např. na filtrační papír a na něm vložit do nádoby vhodné velikosti s fixační tekutinou. Veškeré značení musí být umístěno mimo vlastní lézi. Excize se fixuje v celku, není vhodné lézi nařezávat.

Průvodka by kromě klinické diagnózy měla obsahovat lokalizaci a velikost léze, vztah k okolním strukturám, délku trvání a další klinické detaily, které jsou pro diagnózu důležité, ale po fixaci tkáně již nemusejí být patrné – např. pokud jsou v jedné excizi dvě léze, je nutné tuto skutečnost uvést.

Resekáty – parciální resekáty, totální ektomie, orgánové komplexy (dále jen resekát)

Zásada je umožnit patologovi vyšetřit efektivně místo patologických změn, stanovit rozsah postižení a posoudit radikalitu odstranění.

Při tom je nutno mít na paměti, že:

  • získaný vzorek je unikátní,
  • nevhodnou manipulací může být zničen = nedostatek informací = v konečném důsledku ohrožení života pacienta,
  • nádorovou tkáň můžeme v budoucnosti potřebovat ke stanovení markrů, které dnes neznáme, ale které mohou pacientovi zachránit život.

Odběr: Vyjmutý resekát by měl být opláchnut od krevních sraženin a exkrementů. Resekáty dutých orgánů by měly být rozstřiženy a zbaveny obsahu. Rozstřižení by nemělo procházet nádorem.

Označení resekátu musí být provedeno vždy, kdy je to nutné k topografické orientaci, a vždy ve třech směrech a podle předem dohodnutých pravidel s patologem.

Ke značení je možné použít svorky, stehy o různé délce nebo barvě, nebo kombinaci obojího, vždy s legendou nejlépe s nákresem, pokud je to vhodné i se snímkem ze zobrazovacích metod.

Značení by nikdy nemělo být založeno do místa předpokládaných patologických změn, resp. nádoru.

Fixace: Odeslání nativního (nefixovaného) vzorku je nezbytností v případě peroperační biopsie a při požadavku na jiné speciální vyšetření, např. fluorescenční, genetické nebo elektronmikroskopické.

Je-li standardně zajištěn okamžitý transport do laboratoře, měl by být resekát odeslán nativní vždy a správnou fixaci s ohledem na použité vyšetření zajistí laboratoř.

Fixace 10% formolem = obvyklý postup. Vzorek se vloží do nádoby s fixační tekutinou, která se doleje do potřebného množství. Důležité je, aby byl vzorek ponořen (event. překryt fixací nasáklou buničinou, která by měla být i mezi dnem a vzorkem) tak, aby fixace probíhala co nejrychleji ze všech směrů.

Fixační tekutiny by mělo být 10–20krát více, než je objem vzorku.

Formol má specifický zápach, proto rychlá kontrola čichem může předejít znehodnocení vzorku špatnou fixací (v praxi se setkáváme se záměnou láhve s formolem za dezinfekční činidla, alkohol, kyselinu octovou apod.).

Proto: Není-li formol (resp. doporučené fixativum) k dispozici, je lépe odeslat vzorek ihned do laboratoře nativní než použít cokoliv jiného (Obr. 1a,c,e).

Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu:
b) Barvení HEO při správné fixaci. Jasně patrná střední jaderná polymorfie, bez tvorby tubulárních formací, apokrinní diferenciace.
Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma: b) Correctly fixed tissue stained with HEO. Clearly visible moderate nuclear polymorphism, absence of tubular structures, and apocrine differentiation.
Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu: b) Barvení HEO při správné fixaci. Jasně patrná střední jaderná polymorfie, bez tvorby tubulárních formací, apokrinní diferenciace. Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma: b) Correctly fixed tissue stained with HEO. Clearly visible moderate nuclear polymorphism, absence of tubular structures, and apocrine differentiation.

Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu: c) Nehodnotitelný průkaz HER 2 imunohistochemickým vyšetřením v autolyzované tkáni nevhodně fixovaného resekátu – výsledek by mohl být interpretován jako negativní.
Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma: c) HER2 tested with immunohistochemistry in autolysed tissue of an incorrectly fixed tumour resection – HER2 status cannot be established, and the result could be interpreted as false negative.
Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu: c) Nehodnotitelný průkaz HER 2 imunohistochemickým vyšetřením v autolyzované tkáni nevhodně fixovaného resekátu – výsledek by mohl být interpretován jako negativní. Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma: c) HER2 tested with immunohistochemistry in autolysed tissue of an incorrectly fixed tumour resection – HER2 status cannot be established, and the result could be interpreted as false negative.

Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu:
e) Vyšetření amplifikace genu HER2/neu a CEN17 metodou In-situ hybridizace Dual ISH – prázdná jádra bez signálu centromery 17 s ojedinělými signály HER2/neu při autolýze v resekátu, výsledek je nehodnotitelný, mohl by být interpretovaný i jako falešně negativní.
Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma: e) Dual in situ hybridization of HER2/CEN17 (SISH) in autolysed tumour tissue – empty nuclei without any signals of CEN17 and only isolated signals for HER2. The result cannot be evaluated and could be interpreted as false negative.
Obr. 1. Následky nesprávné fixace na kvalitu histologického barvení, imunohistochemického vyšetření a in situ hybridizace genu HER 2 u invazivního karcinomu prsu: e) Vyšetření amplifikace genu HER2/neu a CEN17 metodou In-situ hybridizace Dual ISH – prázdná jádra bez signálu centromery 17 s ojedinělými signály HER2/neu při autolýze v resekátu, výsledek je nehodnotitelný, mohl by být interpretovaný i jako falešně negativní. Fig. 1: Consequences of incorrect formalin fixation on the quality of histological staining, immunohistochemistry and in situ hybridization of the HER2 gene in invasive breast carcinoma: e) Dual in situ hybridization of HER2/CEN17 (SISH) in autolysed tumour tissue – empty nuclei without any signals of CEN17 and only isolated signals for HER2. The result cannot be evaluated and could be interpreted as false negative.

Makroskopie vzorku a měření velikosti

Traduje se, že fixací ve formolu se tkáň srazí.

Fixací skutečně dochází ke změnám tvaru a charakteru tkáně. Tkáň ztuhne, změní barvu na monotónní odstíny béžové, šedé a hnědavé pigmentace, dobře patrná v nativním vzorku ztrácí svoji intenzitu.

Kožní excize mění svoji velikost, ale ne v důsledku fixace, nýbrž již při vyjmutí, díky vlastní kontraktilitě tkáně. Dochází se smrštění elastických vláken, tedy čím je kůže pružnější, mladší, tím více se vzorek zmenší. Udává se, že člunková excize se průměrně v dlouhé ose zmenší cca o 16–20 %, v šířce 12–18 %, avšak v dosti širokém rozpětí od 0–40 % v závislosti na věku a lokalitě odběru. Lze tedy odvodit, že u kožní excize o ploše 20x10 mm může patolog naměřit velikost od 12x6 mm do 20x10 mm. To je třeba brát v úvahu při posuzování velikosti bezpečných okrajů u nádorů.

Změny velikosti jiných tkání

Posuzování změn velikosti a hmotnosti tkání v závislosti na fixaci je velmi kontroverzní téma. Klinické i experimentální práce se rozcházejí jak v metodikách, tak ve výsledcích.

Přesto je nepochybné, že různé tkáně při fixaci formolem procházejí různými změnami velikosti a hmotnosti v závislosti na jejich složení a obsahu vody. Bylo experimentálně ověřeno, že svalová tkáň mírně zvyšuje svoji hmotnost a objem, kosti se nemění a tuková tkáň naopak mírně zvyšuje hmotnost a zmenšuje velikost cca o 4–9 % (Docquier PL. et al., 2010). Mění se rozměry resekátu ve smyslu rozšíření a oploštění, což je dané ztrátou podpory okolních tkání po vyjmutí a položení na ploché dno transportní nádoby.

Kontrola kvality v laboratořích

Od roku 2003 existuje zvláštní norma pro zdravotnické laboratoře ISO ČSN EN 15189. Většina laboratoří patologie v České republice je v současné době již akreditována Českým institutem pro akreditaci, který posuzuje shodu práce laboratoře s touto normou, nebo je auditem NASKL (Národní autorizační středisko pro klinické laboratoře ČLS JEP) posouzeno dodržování standardů, které vycházejí z této normy.

Slova MUSÍ použitá výše odrážejí požadavky normy ISO 15189 na laboratoře, které musejí sledovat a ovlivňovat i preanalytickou fázi vyšetřování vzorku.

Akreditace laboratoře podle této normy znamená, že laboratoř pracuje podle dokumentovaných, standardních postupů, že sleduje riziková místa ve vyšetřovacím procesu a má nastaveny mechanismy, jak tato rizika v maximální míře eliminovat.

Neznamená to však, že i akreditovaná laboratoř nemůže udělat chybu.

Proto závěrem: Mezioborová spolupráce s oboustrannou znalostí styčných bodů a vzájemnou komunikací je jediná možná cesta k dosažení maximálního výsledku v diagnostice a následně i léčbě pacienta.

MUDr. Markéta Trnková

BIOLAB Praha, k. s. 

Evropská 33B,

160 00 Praha 6 

e-mail: trnkova@biolab.cz


Zdroje

1. Bancroft DJ, et al. Theory and pracitice of histological techniques. Churchil Livingstone Elsevier, Sixth ed. 2008.

2. Dauendorffer JN, et al. Shrinkage of skin excision specimens: formalin fixation is not the culprit. Br J Dermatol 2009;4:810–4.

3. Docquier PL et, al. Formalin fixation could interfere with the clinical assessment of the tumor-free margin in tumor surgery: Magnetic resonance imaging-based study. Oncology 2010;78: 115–124.

4. Gal AA, et al. The Centennial anniversary of the frozen section technique at the Mayo Clinic. Arch Pathol Lab Med 2005; 129:1532–1535.

5. Hewitt SM, et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol Lab Med 2008;12:1929–35.

6. Jain NJ. Essentials before sending biopsy specimens: A surgeon’s prespective and pathologists concern. Maxillofac Oral Surg 2011;10:361–364.

7. Rosai J, et al. The pathology of tumors part II: diagnostic techniques. Cancer J Clin 1979;29:22–39.

8. Thompson JF, et al. Cooperation between surgical oncologists and pathologists: a key element of multidisciplinary care for patients with cancer. Pathology 2004;36:496?503.

9. Česká technická norma ČSN EN ISO 15189 Zdravotnické laboratoře – Zvláštní požadavky na kvalitu a způsobilost. 2013

Štítky
Chirurgie všeobecná Ortopedie Urgentní medicína

Článek vyšel v časopise

Rozhledy v chirurgii

Číslo 3

2014 Číslo 3

Nejčtenější v tomto čísle
Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

hyperpigmentace úvodní foto kurz
Efektivní snižování hyperpigmentace − od výzkumu k inovacím pro praxi
nový kurz
Autoři: dr. Ludger Kolbe, dr. Thierry Passeron, MD, PhD

Postavení moxonidinu a indapamidu v léčbě hypertenze
Autoři: MUDr. Jan Vachek

Magnetická rezonance a diagnostika axiálních spondyloartritid - Virtuální trénink
Autoři: MUDr. Leona Procházková, Ph.D., MUDr. Monika Gregová, Ph.D., MUDr. Vladimír Červeňák, MUDr. Eva Korčáková, Ph.D.

Hybridní zubní náhrady – přežitek nebo perspektiva v moderní protetické péči?

Následná péče po prodělaném covid-19
Autoři:

Všechny kurzy
Kurzy Podcasty Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu, se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se