Charakteristika molekuly PCSK9 a její klinický význam

PCSK9 Molecule: Characteristics and Clinical Importance

Objective: Introducing the proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9/NARC1) molecule, which significantly participates in lipid metabolism, to describe its chemical structure and properties, its role in metabolism and last but not least its clinical significance.

Design: literature review.

Settings: Institute for Clinical and Experimental Medicine, Vídeňská 1958/9, 140 21 Praha 4

Conclusion: Due to its important role in lipid metabolism, the PCSK9 molecule becomes a very interesting and important analyte across clinical disciplines.

Keywords:

domain – Mutation – PCSK9 – LDLR – lipid metabolism – degradation

Autoři: T. Vacková ^1,2; J. Franeková ^1,2; A. Jabor ^1,2
Působiště autorů: Oddělení klinické biochemie, Pracoviště laboratorních metod, Institut klinické a experimentální medicíny, Praha ¹; Univerzita Karlova, 3. lékařská fakulta, Praha ²
Vyšlo v časopise: Klin. Biochem. Metab., 27, 2019, No. 4, p. 177-182

Souhrn

Cíl studie: Představit molekulu proprotein konvertázy subtilisin/kexin typu 9 (PCSK9/NARC1), která se významně podílí na lipidovém metabolismu, popsat její chemickou strukturu a vlastnosti, její úlohu v metabolismu a v neposlední řadě i klinický význam.

Typ studie: literární rešerše.

Název a sídlo pracoviště: Institut klinické a experimentální medicíny, Vídeňská 1958/9, 140 21 Praha 4

Závěr: Molekula PCSK9 se díky své významné úloze v lipidovém metabolismu stává velice zajímavým a důležitým stanovovaným analytem napříč klinickými obory.

Klíčová slova:

PCSK9 – LDLR – lipidový metabolismus – doména – degradace – mutace

Úvod

PCSK9 patří do skupiny serinových proteáz (konvertáz), které aktivují neaktivní proproteiny na proteiny biologicky aktivní odštěpením části řetězce, čímž odkryjí aktivní místo molekuly. Druhá část názvu subtilisin/kexin je odvozena od názvů enzymů bakteriální (subtilisin) a kvasinkové (kexin) stěny, s nimiž mají proteázy společné aktivní místo obsahující aminokyseliny (AA) aspartát (Asp), Histidin (His) a Serin (Ser) [1].

Lze klasifikovat celkem devět proproteinových konvertáz (PC). Sedm z nich jsou enzymy, jejichž funkcí je aktivace/inaktivace polypeptidů, hormonů, růstových faktorů a jejich receptorů. Aktivace probíhá štěpením vazby na jednoduchých nebo párových bazických aminokyselinách [2]. Do této skupiny patří PC1 (PCSK1), PC2 (PCSK2), furin (PCSK3), PC4 (PCSK4), PC5 (PCSK5), PACE4 (PCSK6) a PC7 (PCSK7) [3]. Názvy jednotlivých konvertáz jsou odvozeny podle genů, které je kódují, například gen kódující furin je FURIN [2]. Dalším členem je subtilisin kexin izoenzym (SKI-1/S1P, PCSK8), který aktivuje membránové transkripční faktory a ovládá, jako jeden z hlavních enzymů, syntézu mastných kyselin a cholesterolu. Kromě uvedených funkcí se spolupodílí na udržení lipidové homeostázy organismu. Posledním enzymem v této skupině je již zmíněná PCSK9, která negativně reguluje hladinu LDL cholesterolu (LDLC). PCSK9 a SKI-1 ovlivňují lipidový metabolismus štěpením receptorů na nebazických zbytcích nebo prostřednictvím indukované degradace [2, 4].

Struktura PCSK9

Gen pro lidskou PCSK9 je lokalizován na prvním chromozomu (1p32.3) [2, 5, 6]. Tento gen je 22-kb dlouhý a obsahuje 12 exonů kódujících 692 aminokyselin (AA) [2, 7]. Jde o glykoprotein o velikosti 74 kDa, který je syntetizován v hrubém endoplazmatickém retikulu (ER) hepatocytu. PCSK9 je produkována v několika tkáních, a to nejvíce v játrech, v tenkém střevu a ledvinách. Byla také detekována v cerebrospinální tekutině a aterosklerotických plátech [7].

Celý enzym PCSK9 se dá rozdělit celkem do čtyř domén o různém počtu aminokyselin. Autoři uvádějí rozdílná zastoupení AA v jednotlivých doménách dle krystalové struktury. Podle Seidah et al. [8] je zastoupení AA v jednotlivých doménách následující:

signální peptid (1-30 AA, kódovaný exonem 1),
prodoména (31-152 AA, kódovaná exony 1-3),
katalytická doména (153-421 AA, kódována exony 3-8) a krátký úsek, tzv. hinge region o 18 AA (HR, 422-439 AA, kódovaný exony 8-10),
C-terminální doména, která je bohatá na cysteinové (Cys) a histidinové (His) zbytky (CHRD, 440-692 AA, kódována exony 10-12) [8, 18] (obr 1).

Fig. 1.The structure of PCSK9’s domains. PCSK9 consists of a total of four domains containing different amounts of amino
acids. The native form of PCSK9 is synthesized in the endoplasmic reticulum, where the signal peptide is cleaved by peptidase
and proPCSK9 is produced. Subsequently, autocatalytic cleavage occurs at the GLU152 position and the cleaved pro-domain
binds to the catalytic domain via non-covalent binding. The newly originated molecule (prosegment with PCSK9) is inactive and
can be released from ER to GA, from where it is further transported to the cell membrane. H - hinge region, CHRD - cysteine/
histidine-rich domain — Fig. 1.The structure of PCSK9’s domains. PCSK9 consists of a total of four domains containing different amounts of amino acids. The native form of PCSK9 is synthesized in the endoplasmic reticulum, where the signal peptide is cleaved by peptidase and proPCSK9 is produced. Subsequently, autocatalytic cleavage occurs at the GLU152 position and the cleaved pro-domain binds to the catalytic domain via non-covalent binding. The newly originated molecule (prosegment with PCSK9) is inactive and can be released from ER to GA, from where it is further transported to the cell membrane. H - hinge region, CHRD - cysteine/ histidine-rich domain

V katalytické doméně jsou obsažena tzv. aktivní místa, která jsou typická pro proteinázy typu K. Jsou to AA Asp₁₈₆, His₂₂₆ a Ser₃₈₆ [2, 9]. V poslední uvedené doméně CHRD můžeme rozlišit tři úseky o různém množství a zastoupení jednotlivých AA: M1, M2 (obsahuje 9 His z celkových 14 v celé CHRD doméně) a M3 [9, 10]. Úseky M1 a M3 jsou zodpovědné za dozrání a sekreci PCSK9 a úsek M2 za degradaci LDL-receptoru (LDLR) [11]. Každý z těchto úseků obsahuje tři disulfidické vazby mezi 1. a 6. Cys, 2. a 5. Cys a 3. a 4. Cys [9, 10, 12]. C-terminální doména obsahuje tři šestivláknové domény, které jsou uspořádané do struktury β-listů a utváří trojrozměrnou symetrii. U této domény se spekuluje o tom, že zprostředkovává protein-protein interakce [9, 10, 12, 13].

Jak už bylo uvedeno, primární struktura PCSK9 v nativní formě je syntetizována v hrubém ER hepatocytu. Zde je odstraněna signální sekvence (1-30 AA) pomocí signální peptidázy a vzniká zymogen proPCSK-9 (31-692 AA) o velikosti 74 kDa. V tomto uspořádání podstupuje proPCSK9 autokatalytické štěpení, při kterém dojde ke štěpení vazby v místech mezi 152. a 153. AA (mezi glutaminem Gln a serinem Ser) a vznikají tak dva segmenty, prosegment (31-152 AA) o velikosti 14 kDa a PCSK9 (153-692 AA) o velikosti 60 kDa, které jsou mezi sebou spojeny nekovalentní vazbou. Místo štěpení je označeno VFAQ↓₁₅₂SIP, kde VFAQ SIP znamená označení aminokyselin: Val-Phe-Ala-Gln₁₅₂↓Ser-Ile-Pro [4, 7-9, 14].

Prosegment se váže na aktivní místo katalytické domény molekuly PCSK9, a tím zabrání PCSK9 navázat se na jiné substráty; je enzymaticky inaktivní [8, 11, 14]. Tento komplex je transportován z ER do Golgiho aparátu (GA), odkud je uvolňován na buněčný povrch hepatocytu, kde se váže na cílové proteiny, například na LDL-receptor (LDLR) nebo je dále uvolňován do krevního řečiště [2, 8, 9, 11]. Funkcí vzniklého komplexu prosegment≡PCSK9 je vazba na specifické cílové proteiny a jejich buněčná degradace [8, 11]. Autokatalýza PCSK9 je nutná nejen k aktivaci molekuly, ale také k jejímu uvolnění z ER [14, 15].

Funkcí prodomény (prosegmentu) je alosterická blokace aktivních míst obou zbývajících domén. Jejím odstraněním dojde k odkrytí aktivních míst a až k 10x vyšší afinitě PCSK9 na LDLR, což vede až ke 4x rychlejší degradaci tohoto receptoru. V tomto úseku dochází k častým mutacím, které mohou ovlivnit správnou funkci prodomény, a tím i celé molekuly PCSK9. Prosegment je tedy faktor, který reguluje účinek PCSK9 uvolněním katalytické domény [13, 16].

PCSK9 může být dále štěpena některými dalšími enzymy, např. furinem a PC5/6A, na pozici ²¹⁸Arg a vznikne tak úsek o velikosti 53 kDa. Tato zkrácená PCSK9 má nižší afinitu vůči LDLR. Obě formy PCSK9 mohou být detekovány jak v lidské plazmě, tak u myší [17].

Struktura LDLR

LDLR je transmembránový glykoprotein, který byl poprvé identifikován v roce 1974 [18]. Jeho hlavní funkcí je odstranění lipoproteinů obsahujících cholesterol a apolipoprotein B (apoB) z cirkulace. Gen pro tento receptor je lokalizovaný na chromozomu 19p13.1 – 13.3 a je přibližně 45 kb dlouhý [6]. Celkově je gen pro LDLR kódován 18 exony a tvoří ho přibližně 839 AA, které jsou uspořádány celkem do pěti domén [19]:

první je ligand-vázající doména na N-terminálním konci proteinu (obsahuje 322 AA), která se dále dělí na sedm částí R1-R7, které jsou bohaté na cysteiny. Každá z R částí obsahuje 40 AA a tři atomy vápníku, které jsou nezbytné pro protein-proteinové interakce [13, 19, 24, 29],
druhou doménou je epidermální růstový faktor (EGF, je složen přibližně z 350 AA) [19]. Jde o prekurzor homologní domény, který obsahuje dvojici opakujících se domén EGF-A (40 AA) a EGF-B (40 AA), které jsou od domény EGF-C (40 AA) odděleny β-šroubovicovou doménou [20]. Tento úsek obsahuje 280 AA a spolupodílí se na uvolnění lipoproteinů z vazby v kyselém pH [20],
následuje doména vázající sacharid přes hydroxylovou skupinu (OH) serinu (Ser) nebo threoninu (Thr), obsahující 48 AA [19]. Tento úsek není zahrnut do navazování ligandů, internalizace a recyklace receptoru [19],
předposlední doménou je transmembránová (cytosolová) doména (TM) obsahující 22 AA,
poslední je cytosolový zbytek (cytoplazmatický ocas), který obsahuje 50 AA a je nezbytný pro správnou internalizaci receptoru [19] (obr. 2). LDLR se syntetizuje v ER a jeho molekulová hmotnost je 120 kDa. Z ER se LDLR transportuje do GA, kde postupně dochází ke glykosylacím a na povrchu buňky se formuje zralý glykoprotein o molekulové hmotnosti 160 kDa, který je schopen na sebe navázat LDLC a další lipoproteiny obsahující apolipoprotein B (apoB) a podstoupit proces endocytózy [18, 21].

Fig. 2. The structure of LDLR’s domains. LDLR contains 5 domains. The first is a ligand-binding domain that contains a total of
seven repeats. The EGF-precursor homologous domain follows. This domain consists of four parts: EGF-A, EGF-B, ß-propeller,
and EGF-C. The following part is the O-linked sugar domain, which is connected to the transmembrane domain that is part
of the plasma membrane. The last domain is the cytoplasmic tail, which contains the amino acid sequence of FDNPVY. This
sequence is responsible for rapid endocytosis through clathrin-coated pits. TM - transmembrane domain/cytosolic domain — Fig. 2. The structure of LDLR’s domains. LDLR contains 5 domains. The first is a ligand-binding domain that contains a total of seven repeats. The EGF-precursor homologous domain follows. This domain consists of four parts: EGF-A, EGF-B, ß-propeller, and EGF-C. The following part is the O-linked sugar domain, which is connected to the transmembrane domain that is part of the plasma membrane. The last domain is the cytoplasmic tail, which contains the amino acid sequence of FDNPVY. This sequence is responsible for rapid endocytosis through clathrin-coated pits. TM - transmembrane domain/cytosolic domain

Úloha PCSK9 a LDLR v metabolismu

Existují dvě metabolické dráhy PCSK9, a to intracelulární a extracelulární. Při vnitrobuněčné cestě uvolněná PCSK9 z GA interaguje přímo s LDLR a vzniklý komplex je transportován přímo do lysozomu, kde dochází k jeho degradaci. Při extracelulární dráze je PCSK9 uvolněna na povrch hepatocytu, kde se naváže na LDLR. Odtud je tento komplex internalizován do endozomu a následně do lysozomu, kde dojde k degradaci [11, 22, 23].

Cyklus LDLR

Na buněčné stěně dojde k otevření konformace ligand-vázající domény, a tím je umožněno navázání lipoproteinů na LDLR [24]. Cytosolová doména LDLR obsahuje sekvenci aminokyselin FDNPVY (F-Fenylalanin, D-Aspartát, N-Asparagin, P-Prolin, V-Valin, Y-Tyroxin), která je nutná pro rychlou endocytózu zprostředkovanou přes váčky pokryté klatrinem (clathrin-coated pits) [25, 26]. Internalizace vzniklého komplexu LDLR≡LDLC do hepatocytu je kontrolována pomocí LDL receptorového adaptorového proteinu (LDLRAP1/ARH) [6], který je můstkem mezi LDLR a klatrinem [27]. Po endocytóze je komplex transportován do endozomu. Kyselé pH endozomu způsobí změnu konformace LDLR, a to tím, že β-šroubovicová doména uzavírá „otevřenou“ ligand-vázající doménu, což má za následek odštěpení lipoproteinové částice z komplexu [24, 26, 28].

Tato částice následně putuje do lysozomu, kde je pomocí cholesterol esterázy hydrolyzována na cholesterol a volné mastné kyseliny a proteinová část lipoproteinu je dále degradována na aminokyseliny [26].

LDLR se recykluje a vrací se zpět na povrch membrány, pokud není zachycen PCSK9 v intracelulární metabolické dráze, viz výše. Takto se může recyklovat až 150x [24, 26].

Komplex PCSK9≡LDLR

Mechanismus vazby PCSK9 na LDLR probíhá přes EGF-A doménu tohoto receptoru na buněčné stěně hepatocytu při neutrálním pH [29]. Při snížení pH ze 7,0 na 5,2 vzroste afinita PCSK9 k LDLR až 50x, proto je vazba komplexu LDLR≡PCSK9 po internalizaci do buňky mnohem silnější [29]. V kyselém prostředí prodoména stabilizuje solné můstky s β-šroubovicovou doménou LDLR a pozitivně nabitá CHRD doména se váže na záporně nabitou ligand-vázající doménu LDLR. Tím dojde k blokaci receptoru a tato otevřená konformace LDLR brání zpětné recyklaci LDLR na povrch membrány a receptor směřuje do lysozomu, kde je degradován [28, 29].

Ve studii in vitro bylo zjištěno, že jedním ze spouštěčů degradace LDLR v lysozomu je vznik dimeru PCSK9, který vzniká mnohem snadněji v kyselém prostředí lysozomu než v neutrálním prostředí a zvyšuje degradaci LDLR oproti monomeru PCSK9. Zdá se, že katalytická doména PCSK9 sehrává významnou roli při vzniku polymeru, při aktivaci molekuly, správném složení a sekreci, ale neovlivňuje degradaci LDLR [30].

Reakce PCSK9 s apolipoproteinem B (apoB)

H. Sun a kol. [31] ve své studii ukázali, že dlouhodobá exprese proteinu PCSK9 u myší vede ke zvýšené koncentraci plazmatického cholesterolu, triacylglycerolů (TAG) a apoB bez ohledu na přítomnost LDLR. H. Sun a kol. [31] popsali přímou interakci mezi PCSK9 a apoB za fyziologických podmínek nezávisle na LDLR [31]. Při této interakci je zabráněno degradaci apoB, který může být odbouráván dvěma hlavními metabolickými cestami, a to buď přes proteazom nebo přes autofagozomy/lysozomy a roste tak jeho koncentrace v krvi [32].

ApoB100 je primárně exprimován v játrech. Skládá se celkem ze 4536 AA, z toho je 25 Cys (16 z nich je součástí disulfidické vazby) a 20 tvoří glykosidickou vazbu přes N konec AA [33]. Kromě apoB100 existuje i zkrácená forma apoB48, která je exprimována kromě jater také ve střevě [33]. Tato zkrácená forma vzniká při post-transkripční modifikaci apoB mRNA na kodonu 2153, který přenáší glutaminový kodon jako stop kodon ve 48 % délky apoB100. Oba apoB obsahují amfipatické NH2 domény a hydrofobní domény složené z β-listů [33]. ApoB100 navíc obsahuje α-helikální úsek, další doménu složenou z β-listů a další α-helikální doménu [33].

Mutace PCSK9

Můžeme rozlišit dva základní typy mutací v molekule PCSK9. Jedním z nich je tzv. gain-of-function mutace (GOF), při které dochází ke snížení koncentrace LDLR a následně navýšení koncentrace LDLC v krvi [8]. Tento typ mutace se fenotypově projeví jako familiární hypercholesterolémie (FH) [9, 34]. Druhý typ, tzv. loss-of-function mutace (LOF), vede k navýšení koncentrace LDLR, a tím se urychlí vychytávání LDLC z krve a sníží se jeho koncentrace. Tato mutace má charakter ochrany před koronárními chorobami [8, 9, 34].

GOF mutace může být způsobena zařazením jiné AA v nukleotidu, jedná se o tzv. missense mutaci. V tomto případě dojde k záměně buď na 374. AA (D374Y) nebo na 127. AA (S127R) [34].

Mutace D374A zvyšuje afinitu vazby PCSK9 na LDLR. Aminokyseliny, které mohou být zařazeny v nukleotidu na místo ³⁷⁴Asp jsou Tyr, Ala, Glu, Phe, Lys nebo Leu. Mutace na ¹²⁷Ser (S127R) nemá přímý vliv na sílu vazby PCSK9 na LDLR, ale urychluje vychytávání LDLR, a tím způsobuje navyšování koncentrace LDLC [34]. Aminokyseliny, které mohou nahradit Ser na pozici 127 v nukleotidu, jsou Arg, Ala, Asp, Lys, Leu a Thr [9,34]. Kombinace obou mutací má aditivní účinek na funkci PCSK9 [34].

LOF mutace může být způsobena buď missense mutací (R46L, L253F, A433T) nebo nonsense mutací (Y142x a C679x), které jsou asociovány s nízkými koncentracemi LDLC a se sníženým rizikem aterosklerózy [9,34].

Objev obou typů mutací a jejich působení na metabolismus lipidů vedly k vývoji protilátek blokujících PCSK9. Tyto protilátky jsou dnes v klinickém použití, zatím jsou k dispozici dvě blokující molekuly – alirocumab a evolocumab. Měření koncentrace PCSK9 může pomoci stratifikovat riziko rozvoje aterosklerózy u pa-cientů a přispět k objasnění efektu terapie.

Závěr

Molekula PCSK9 byla objevena teprve nedávno, ale její významná úloha v lipidovém metabolismu je zřejmá. Z tohoto důvodu je testována a zkoumána napříč klinickými obory včetně farmaceutického odvětví. Stanovení této molekuly má velký potenciál a do budoucna bude jistě součástí běžného vyšetření.

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů

Do redakce došlo 22. 8. 2019

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Tereza Vacková

Oddělení klinické biochemie

Pracoviště laboratorních metod

Institut klinické a experimentální medicíny

Vídeňská 1958/9

140 21 Praha 4

E-mail: vact@ikem.cz

Zdroje

1. Seidah, N. G., Chrétien, M., Day, R. The family of subtilisin/kexin like pro-protein and pro-hormone convertases: Divergent or shared functions. Biochimie, 1994, Vol. 76(3-4), p. 197-209.

2. Seidah, N. G., Prat, A. The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases. Nat Rev Drug Discov., 2012, Vol. 11(5), p. 367-383.

3. Artenstein, A. W., Opal, S. M. Proprotein convertases in health and disease. N Engl J Med., 2011, Vol. 365(26), p. 2507-2518.

4. Seidah, N. G., Prat, A. The proprotein convertases are potential targets in the treatment of dyslipidemia. J Mol Med., 2007, Vol. 85(7), p. 685-696.

5. Wiciński, M., Źak, J., Malinowski, B., Popek, G., Grześk, G. PCSK9 signaling pathways and their potential importance in clinical practice. EPMA J., 2017, Vol. 8(4), p. 391-402.

6. OMIM. An Online Catalog of Human Genes and Genetic Disorders. Dostupné z WWW: https://omim.org/entry/607786, https://omim.org/entry606945?search=606945&highlight=606945, https://omim.org/entry605747?search=605747&highlight=605747

7. Benjannet, S., Rhainds, D., Essalmani, R., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. J Biol Chem., 2004, Vol. 279(47), p. 48865-48875.

8. Seidah, N. G., Awan, Z., Chrétien, M., Mbikay, M. PCSK9: a key modulator of cardiovascular health. Circ Res., 2014, Vol. 114(6), p. 1022-1036.

9. Cunningham, D., Danley, D. E., Geoghegan, K. F., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nat Struct Mol Biol., 2007, Vol. 14(5), p. 413-419.

10. Piper, D. E., Jackson, S., Liu, Q., et al. The Crystal Structure of PCSK9: A Regulator of Plasma LDL-Cholesterol. Structure, 2007, Vol. 15(5), p. 545-552.

11. Nishikido, T., Ray, K. K. Non-antibody approaches to proprotein convertase subtilisin kexin 9 inhibition: siRNA, antisense oligonucleotides, adnectins, vaccination, and new attempts at small-molecule inhibitors based on new discoveries. Front Cardiovasc Med., 2019, Vol. 5, p. 1-17.

12. Hampton, E. N., Knuth, M. W., Li, J., Harris, J. L., Lesley, S. A., Spraggon, G. The self-inhibited structure of full-length PCSK9 at 1.9 Å reveals structural homology with resistin within the C-terminal domain. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, Vol. 104(37), p. 14604-14609.

13. Kwon, H. J., Lagace, T. A., McNutt, M. C., Horton, J. D., Deisenhofer, J. Molecular basis for LDL receptor recognition by PCSK9. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, Vol. 105(6), p. 1820-1825.

14. Benjannet, S., Hamelin, J., Chrétien, M., Seidah, N. G. Loss- and gain-of-function PCSK9 variants: cleavage specificity, dominant negative effects, and low density lipoprotein receptor (LDLR) degradation. J Biol Chem., 2012, Vol. 287(40), p. 33745-33755.

15. Seidah, N. G., Benjannet, S., Wickham, L., et al. The secretory proprotein convertase 1 (NARC-1): Liver regeneration and neuronal differentiation. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, Vol. 100(3), p. 928-933.

16. Lagace, T. A., Curtis, D. E., Garuti, R., et al. Secreted PCSK9 decreases the number of LDL receptors in hepatocytes and in livers of parabiotic mice. The J Clin Invest., 2006, Vol. 116(11), p. 2995-3005.

17. Han, B., Eacho, P. I., Knierman M. D., et al. Isolation and characterization of the circulating truncated form of PCSK9. J Lipid Res., 2014, Vol. 55(7), p. 1505-1514.

18. Melendez, Q. M., Krishnaji, S. T., Wooten, C. J., Lopez, D. Hypercholesterolemia: The role of PCSK9. Arch Biochem Biophys., 2017, Vol. 625-626, p. 39-53.

19. Yamamoto, T., Davis, C. G., Brown, M. S., et al. The human LDL receptor: a cysteine-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA. Cell, 1984, Vol. 39(1), p. 27-38.

20. Russel, D. W., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Different combinations of cysteine-rich repeats mediate binding of low density lipoprotein receptor to two different proteins. J Biol Chem., 1989, Vol. 264(36), p. 21682-21688.

21. Tolleshaug, H., Goldstein, J. L., Schneider, W. J., Brown, M. S. Posttranslational processing of the LDL receptor and its genetic disruption in familial hypercholesterolemia. Cell, 1982, Vol. 30(3), p. 715-724.

22. Poirier, S. Mayer, G., Poupon, V., et al. Dissection of the endogenous cellular pathways of PCSK9-induced low density lipoprotein receptor degradation: evidence for an intracellular route. J Biol Chem., 2009, Vol. 284(42), p. 28856-28864.

23. Maxwell, K. N., Fisher, E. A., Breslow, J. L. Overexpression of PCSK9 accelerates the degradation of the LDLR in a post-endoplasmic reticulum compartment. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, Vol. 102(6), p. 2069-2074.

24. Zhang, D. W., Garuti, R., Tang, W. J., Cohen, J. C., Hobbs, H. H. Structural requirements for PCSK9-media-ted degradation of the low-density lipoprotein receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, Vol. 105(35), p. 13045-13050.

25. Chen, W. J., Goldstein, J. L., Brown, M. S. NPXY, a sequence often found in cytoplasmic tails, is required for coated pit-mediated internalization of the low density lipoprotein receptor. J Biol Chem., 1990, Vol. 265(6), p. 3116-3123.

26. Gent, J., Braakman, I. Low-density lipoprotein receptor structure and folding. Cell Mol Life Sci., 2004, Vol. 61(19-20), p. 2461-2470.

27. Garuti, R., Jones, Ch., Li, W. P., et al. The modular adaptor protein autosomal recessive hypercholestero-lemia (ARH) promotes low density lipoprotein receptor clustering into clathrin-coated pits. J Biol Chem., 2005, Vol. 280(49), p. 40996-41004.

28. Rudenko, G., Henry, L., Henderson, K., et al. Structure of the LDL receptor extracellular domain at endosomal pH. Science, 2002, Vol. 298(5602), p. 2353-2358.

29. Zhang, D. W., Lagace, T. A., Garuti, R., et al. Bin-ding of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 to epidermal growth factor-like repeat A of low density lipoprotein receptor decreases receptor recycling and increases degradation. J Biol Chem., 2007, Vol. 282(25), p. 18602-18612.

30. Fan, D., Yancey, P. G., Qiu, S., et al. Self-association of human PCSK9 correlates with its LDLR-degrading activity. Biochemistry, 2008, Vol. 47(6), p. 1-22.

31. Sun, H., Samarghandi, A., Zhang, N., Yao, Z., Xiong, M., Teng, B. B. Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 interacts with apolipoprotein B and prevents its intracellular degradation, irrespective of the low-density lipoprotein receptor. Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2012, Vol. 32(7), p. 1585-1595.

32. Gillian-Daniel, D. L., Bates, P. W., Tebon, A., Attie, A. D. Endoplasmic reticulum localization of the low density lipoprotein receptor mediates presecretory degradation of apolipoprotein B. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, Vol. 99(7), p. 4337-4342.

33. Fisher, E. A., Ginsberg H. N. Complexity in the secretory pathway: the assembly and secretion of apolipoprotein B-containing lipoproteins. J Biol Chem, 2002, Vol. 277(20), p. 17377-17380.

34. Pandit, S., Wisniewski, D., Santoro, J. C., et al. Functional analysis of sites within PCSK9 responsible for hypercholesterolemia. J Lipid Res., 2008, Vol. 49(6), p. 1333-1343.