Možnosti experimentálního ovlivnění regenerace jaterního parenchymu v souvislosti s ligací větví portální žíly


Experimental promotion of liver regeneration after portal vein branch ligation

Introduction:
Portal vein embolization or ligation (PVE/PVL) is part of most multi-stage liver procedures in the case of low future liver remnant volume (FLRV). PVE initiates compensatory hypertrophy of non-occluded liver parenchyma. This hypertrophy is stimulated by an increased volume of portal blood in the non-occluded veins. PVE results in adequate FLRV growth necessary for resection only in 63-96% patients. The aim of this publication is to summarize the possibilities of influencing liver regeneration after PVE/PVL in an experiment using cytokines (TNF-α, IL-6), a monoclonal antibody against TGF-β1 (MAB TGF-β1) and mesenchymal stem cells (MSC).

Methods:
The experimental model of PVE/PVL was chosen as best compatible for potential use in human medicine. 9 (control group), 9 (TNF-α group), 8 (IL-6 group), 6 (MSC group) and 7 piglets (MAB TGF-β1 group) were enrolled in individual studies. We performed laparotomy with PVL of the right-sided liver lobes under general anaesthesia. The following amounts of substances were applied in the non-occluded portal vein branches immediately after PVL: physiological solution (control group), recombinant porcine TNF-α (5 μg/kg), recombinant porcine IL-6 (0.5 μg/kg) and MSC (8.75, 14.0, 17.0, 17.5, 43.0 and 61.0 x 106 MSC). MAB TGF-β1 was applied 24 hours after PVL (40 μg/kg). Biochemical parameters were analysed repeatedly and FLRV ultrasound assessments were performed in the postoperative period. The experiments were ended on postoperative day 14 by sacryfiing the animals under general anaesthesia. Liver samples of hypertrophic and atrophic liver parenchyma were analysed.

Results:
Repeated ultrasound assessments of the effects of MSC, TNF-α, IL-6 and MAB TGF-β1 compared with the physiological solution in the control group demonstrated statistically significant acceleration of FLRV growth in the experimental groups. For MSC, maximum growth was observed between postoperative days 3 and 7, on day 7 for TNF-α, between days 3 and 7 for MAB TGF-β1 and on day 7 for IL-6. Serum levels of AST and ALT increased after PVL and MSC whereas other biochemical parameters showed no statistically significant differences. We identified individual MSC using immunohistochemistry in the hypertrophic tissue of the MSC group. A statistically significant difference was observed in the number of binucleated hepatocytes, with their increased concentration in the IL-6 group.

Conclusion:
Application of IL-6, TNF-α, MAB TGF-β1 and MSC seems to provide suitable stimulation for achieving faster FLRV growth. Nevertheless, many controversial questions still remain to be answered with respect to the mechanism of their respective effects.

Key words:
liver regeneration − portal vein embolization − large animal experiment − mesenchymal stem cells − cytokines


Autoři: V. Liška 1,3;  V. Třeška 1,3;  H. Mírka 2,3;  O. Vyčítal 1,3;  J. Brůha 1,3;  L. Haidingerová 3;  J. Beneš 3,4;  Z. Tonar 3,5;  R. Pálek 1,3;  J. Rosendorf 1,3
Působiště autorů: Chirurgická klinika, Univerzita Karlova, Lékařské fakulta v Plzni, Fakultní nemocnice Plzeň 1;  Klinika zobrazovacích metod, Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova 2;  Biomedicínské centrum, Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova 3;  Klinika anestezie, resuscitace a intenzivní medicíny, Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova 4;  Ústav histologie a embryologie, Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova 5
Vyšlo v časopise: Rozhl. Chir., 2018, roč. 97, č. 5, s. 239-245.
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Úvod:
Embolizace nebo ligace větve portální žíly (PVE/PVL) je nedílnou součástí etapových výkonů v případě nízkého objemu zbytkového jaterního parenchymu (FLRV). Provedení PVE iniciuje kompenzatorní hypertrofii neokludovaného jaterního parenchymu. Tato hypertrofie je stimulována zvýšeným průtokem portální krve neokludovanou větví portální žíly. V případě provedení PVE je dosaženo adekvátního nárůstu FLRV a tím resekovatelnosti pouze u 63–96 % pacientů. Cílem této práce je souhrnně demonstrovat možnosti ovlivnění regenerace jaterního parenchymu po provedení PVE/PVL v experimentu pomocí cytokinů (TNF-α, IL-6), protilátkou proti TGF-β1 (MAB TGF-β1) a mezenchymálními kmenovými buňkami (MSC).

Metody:
Experimentální model PVE/PVL byl zvolen tak, aby byl maximálně kompatibilní pro případné využití v humánní medicíně. Do jednotlivých studií bylo zařazeno 9 (kontrolní skupina), 9 (TNF-α skupina), 8 (IL-6 skupina), 6 (MSC skupina) a 7 prasat domácích (MAB TGF-β1 skupina). V celkové anestezii byla provedena laparotomie s PVL pravých jaterních laloků. V jednotlivých experimentálních skupinách bylo aplikováno následující množství látek do neokludovaného kmene portální žíly ihned po provedení PVL: fyziologický roztok (kontrolní skupina) rekombinantní prasečí TNF-α (5 μg/kg), rekombinantní prasečí IL-6 (0,5 μg/kg), MSC (8,75, 14,0, 17,0, 17,5, 43,0 a 61,0 x 106 MSC). V případě podání MAB TGF-β1 byla vlastní aplikace účinné látky provedena 24 hodin po provedení PVL (40 μg/kg). V pooperačním období byly opakovaně analyzovány biochemické parametry a prováděno ultrasonografické sledování FLRV. Experimenty byly ukončené 14. pooperační den usmrcením zvířat v celkové anestezii. Histologicky byly vyšetřeny vzorky jaterní tkáně z atrofické i hypertrofické části.

Výsledky:
Opakovaná ultrasonografická měření efektu podání MSC, rpTNF-α, rpIL-6 a MAB TGF-β1 porovnaná s podáním fyziologického roztoku prokázala význam jejich podání pro akceleraci růstu FLRV. V případě podání MSC bylo maximum růstu se statistickou signifikancí pozorováno mezi 3. a 7. pooperačním dnem, v případě TNF-α 7., MAB TGF-β1 mezi 3. a 7. a IL-6 7. pooperační den. Sérové hladiny AST a ALT narostly po provedení PVL a aplikaci MSC, zatímco ostatní biochemické parametry zůstaly bez statisticky signifikantního rozdílu. V případě porovnání vývoje sérových biochemických parametrů po aplikaci TNF-α, MAB TGF-β1 nebo IL-6 porovnané s kontrolní skupinou nebyly prokázány žádné statisticky signifikantní rozdíly. V případě MSC skupiny jsme identifikovali jednotlivé MSC. Byl prokázán statisticky významný rozdíl v počtu dvoujaderných hepatocytů, a to při jejich zvýšené koncentraci v IL-6 skupině.

Závěr:
Aplikace IL-6, TNF-α, MAB TGF-β1 a MSC se jeví jako vhodné stimulační agens k dosažení rychlejšího růstu FLRV. Přesto zůstává mnoho kontroverzních otázek ve vztahu k mechanismu jejich působení.

Klíčová slova:
regenerace jater − embolizace portální žíly − experiment na velkém zvířeti − mezechymální kmenové buňky − cytokiny

ÚVOD

Současné možnosti jaterní chirurgie jsou dány enormním rozvojem nových technických prostředků do chirurgické praxe. Nedílnou součástí se pak stala vyspělá perioperační péče. Přesto mnoho pacientů s primárními či sekundárními nádory jater není indikováno k radikálním chirurgickým výkonům, jelikož i přes možnosti etapových výkonů zůstává nízká funkční kapacita zbytkového jaterního parenchymu. Nejvýznamnějším argumentem je zvýšené riziko akutního jaterního selhání po provedení rozsáhlého resekčního výkonu s ponecháním zbytkového parenchymu, který není schopen zajistit jeho veškeré funkce [1]. Možností, jak zvýšit objem zbytkového parenchymu (future liver remnant volume – FLRV), je provedení embolizace pravé větve portální žíly [2,3,4]. Provedení PVE iniciuje kompenzatorní hypertrofii kontralaterálního (levého) jaterního laloku. Tato hypertrofie je stimulována zvýšeným průtokem portální krve neokludovanou větví portální žíly. Vlastní hepatotrofické vlastnosti jsou přikládány různým substancím, které mají původ v různých orgánech portálního řečiště [5,6]. V případě provedení PVE je dosaženo adekvátního nárůstu FLRV a tím resekovatelnosti pouze u 63–96 % pacientů [7]. Další příčinou neresekovatelnosti může být i progrese maligních ložisek v embolizovaném laloku.

Adekvátní regenerace jaterního parenchymu je závislá na proliferaci parenchymových a neparenchymových jaterních buněk. Po provedení hepatektomie nebo PVE dochází k nárůstu sérových hladin cytokinů, a to předně tumor necrosis factor alpha (TNF-α) a interleukin-6 (IL-6), které se účastní při primingu hepatocytů, kdy je zahájena jejich proliferace přechodem z G0 do G1 cyklu buněčného dělení [8]. Tyto pleiotropní cytokiny jsou secernovány neparenchymovými jaterními buňkami, a to převážně Kupfferovými buňkami [9,10]. TNF-α je ve své funkci nadřazený IL-6 a stimuluje zvýšení sekrece IL-6. Po provedení hepatektomie dochází k aktivaci signální kaskády následovně: TNF-α → TNFR-1 → NFκB → IL-6 → STAT3[11]. Po zahájení proliferační fáze jsou hepatocyty udržovány v proliferaci pozitivně pomocí zvýšené sekrece Hepatocyte growth factor (HGF), Epidermal growth factor (EGF), Insulin-like growth factor (IGF) a Transforming growth factor-alpha (TGF-α). Naopak ukončení proliferace a stimulaci hepatocytů k diferenciaci a terminální remodelaci jaterní tkáně s produkcí extracelulární matrix je kontrolováno pomocí sekrece Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1 ) [12,13,14]. TGF-β1 hraje velmi významnou roli v obnovení původní struktury jaterního parenchymu inhibicí syntézy DNA [15] a produkce HGF [16]. Jeho zvýšená sekrece taktéž preventuje nekontrolovaný růst hepatocytů regulací jejich přechodu z G1 do S fáze buněčného cyklu [17,18]. Poměr HGF/ TGF-β1 odráží proliferační versus diferenciační stav hepatocytů [19]. Zvýšená exprese TGF-β1 je ovšem také zodpovědná za vznik jaterní fibrózy [20], která je vysvětlována zvýšenou produkcí jaterní extracelulární matrix [21].

Replikace hepatocytů je maximální 7. pooperační den (v proliferaci zůstává ještě 14 % hepatocytů) a návrat do původního předoperačního stavu nastává po 12. pooperačním dni po provedení PVE v experimentu na praseti [22,23]. Nebyl prokázán rozdíl mezi provedením PVE a prostým podvazem pravé větve portální žíly [24] (portal vein ligation – PVL).

Multipotentní mezenchymální kmenové buňky (MSC) jsou frakcí dospělých kmenových buněk odvozenou z kostní dřeně. Obsahují subpopulaci buněk, které se mohou diferencovat do zralých z mezenchymu odvozených tkání, a to za specifických podmínek. In vitro byla prokázána jejich diferenciace v adipocyty, chondrocyty, osteoblasty a myocyty [25]. Zda a jak se MSC podílejí na jaterní regeneraci, není zcela objasněno a tato otázka má dosud protichůdné odpovědi. Iniciálně se předpokládalo, že se MSC mohou transdiferencovat v jaterní buňky po jejich transplantaci [26,27,28,29]. Pozdější výzkum poukázal také na možnost fúze s jaterními buňkami [30,31]. Současně mohou mít i nepřímý význam při parakrinní stimulaci vlastních jaterních buněk, a to produkcí proliferativních cytokinů nebo zajištěním antiapoptotického efektu [32,33,34].

Cílem této práce je souhrnně demonstrovat možnosti ovlivnění regenerace jaterního parenchymu po provedení PVE/PVL v experimentu různými působky (TNF-α, IL-6, protilátkami proti TGF-β1 (MAB TGF-β1) a MSC).

METODY

Všechny uvedené experimenty byly provedeny dle platné legislativy a s povolením Ministerstva zemědělství ČR. Experimentálním zvířetem bylo prase domácí. Experimentální model PVE/PVL byl zvolen tak, aby byl maximálně kompatibilní pro případné využití v humánní medicíně.

Do jednotlivých studií bylo zařazeno 9 (kontrolní skupina), 9 (TNF-α skupina), 8 (IL-6 skupina), 6 (MSC skupina) a 7 zvířat (MAB TGF-β1 skupina). Rozdíly mezi jednotlivými skupinami v hmotnosti, věku a pohlaví nebyly statisticky signifikantní.

Zvířata byla operována v celkové anestezii a mechanicky ventilována během výkonu [34]. Po provedení střední laparotomie byl proveden podvaz větví portální žíly pro lobus caudatus, lobus lateralis a medialis dexter (50–60 % celkového jaterního parenchymu), a to bez poranění arteriálního zásobení uvedených laloků – ověřeno duplexní ultrasonografií (Medison Sonoace 9900, lineární sonda 7,5 MHz) (Obr. 1).

Identifikace MSC, nebo buněk odvozených z MSC – označená solitární buňka pozitivní na BrdU barvení
Fig. 1. Identification of MCS or cells derived from MSC – a cell stained with BrdU
Obr. 1. Identifikace MSC, nebo buněk odvozených z MSC – označená solitární buňka pozitivní na BrdU barvení Fig. 1. Identification of MCS or cells derived from MSC – a cell stained with BrdU

V jednotlivých experimentálních skupinách bylo aplikováno následující množství látek do neokludovaného kmene portální žíly: fyziologický roztok (kontrolní skupina), rekombinantní prasečí TNF-α 5 μg/kg (rpTNF-α, ProSpec TechnoGene, Izrael), rekombinantní prasečí IL-6 0,5 μg/kg (rpIL-6, ProSpec TechnoGene, Izrael), MSC (8,75, 14,0, 17,0, 17,5, 43,0 a 61,0 x 106 MSC). Autologní MSC byly kultivované v expanzním médiu (DMEM s nízkým obsahem glukózy s GlutaMAX, bez pyruvátu, Biochrom) supplementovaném 10% fetálním bovinním sérem (FBS, Biochrom), 1% penicilinem/streptomycinem a 1% glutaminem. Neadherující buňky byly odstraněny 24, 48 a 72 hodin po začátku kultivace z média. Adherující buňky byly získány za použití 0,5% trypsin-EDTA a přeneseny do čerstvého růstového média. Pro histologickou identifikaci transfundovaných MSC v jaterním parenchymu byly kultivované MSC značeny 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU), a to 60 hodin před jejich aplikací [34,35,36,37,39].

Byl proveden uzávěr laparotomie. Současně byl zaveden port-a-cath cestou v. jugularis interna. Zvířata byla extubována a byla sledována v následujících dvou týdnech.

V případě podání MAB TGF-β1 byl proveden prostý výše popsaný podvaz a vlastní aplikace účinné látky byla provedena cestou port-a-cathu 24 hodin po provedení PVL (40 μg/kg) [36, 40].

Během experimentu byly získány krevní vzorky cestou port-a-cathu, a to vždy před operací (1.), po provedení PVL (2.), po skončení operace (3.), 2 hodiny po provedení operace (4.), 1., 3., 7., 10. a 14. pooperační den (náběr 5.−9.). Byly stanoveny následující biochemické parametry (analyzátor Olympus 2700): bilirubín, urea, kreatinin, alkalická fosfatáza (ALP), gamaglutamyltransferáza (GGT), cholinesteráza (CHE), aspartylaminotransferáza (AST), alaninaminotransferáza (ALT) a albumin. Dále byly stanoveny sérové imunoanalytické parametry: C-reaktivní protein (CRP), cytokiny (TNF-α a IL-6) a růstové faktory (TGF-β1, IGF), a to pomocí enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) přístrojem Auto-EIA II Analyzer (Lasystems Oy Helsinki, Finland).

Ultrasonografické kontroly byly provedeny bezprostředně po operaci, 3., 7., 10. a 14. pooperační den (Medison Sonoace 9900, 3,5 MHz). Byly měřeny rozměry atrofické i hypertrofické části jaterní tkáně ve třech rovinách (axiální, sagitální a koronární). Výpočet objemu byl proveden pomocí standardního ultrasonografického vzorce užívaného běžně v klinické praxi (axiální x sagitální x koronární rozměr / 2) [38].

Experimenty byly ukončeny 14. pooperační den usmrcením zvířat v celkové anestezii. Histologicky byly vyšetřeny vzorky jaterní tkáně z atrofické i hypertrofické části, a to po obarvení hematoxylínem-eosinem a barvením dle Schiffa (PAS). Proliferační aktivita byla stanovena užitím protilátky Ki67 (MIB 1 MW, 1:1000 DakoCytomation). Soustředili jsme se zejména na měření rozměrů lalůčků a hepatocytů a stanovení dvoujaderných hepatocytů.

Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru CRAN 2.4.0 and STATISTICA 98 Edition. Srovnání distribuce studovaných parametrů ve skupinách bylo provedeno Wilcoxonovým testem. Spearman Rank Correlation coefficient byl použit pro parametry, které nejsou gausovsky rozloženy. Porovnání mezi skupinami bylo provedeno parametrickým ANOVA testem.

VÝSLEDKY

FLRV

Opakovaná ultrasonografická měření efektu podání MSC, rpTNF-α, rpIL-6 a MAB TGF-β1 porovnaná s podáním fyziologického roztoku prokázala význam jejich podání k akceleraci růstu FLRV. V případě podání MSC bylo maximum růstu se statistickou signifikancí pozorováno mezi 3. a 7. pooperačním dnem (p<0,05). V druhém pooperačním týdnu byly již rozdíly mezi MSC a kontrolní skupinou bez statistické signifikace (Graf 1) [34].

Porovnání FLRV mezi skupinou s podáním MSC a kontrolní skupinou
Graph 1. Comparison of FLRV between the MSC and control groups
Graf 1. Porovnání FLRV mezi skupinou s podáním MSC a kontrolní skupinou Graph 1. Comparison of FLRV between the MSC and control groups

V případě podání TNF-α byl absolutní nárůst FLRV v prvních třech dnech, zatímco u kontrolní skupiny byl nárůst bez statistické významnosti. Maximum nárůstu jsme pak pozorovali 7. pooperační den u skupiny TNF-α při porovnání s kontrolní skupinou (p<0,05). Tato statistická signifikance pak byla opět ztracena v průběhu druhého týdne experimentu (Graf 2) [35].

Porovnání FLRV mezi skupinou s podáním TNF-α a kontrolní skupinou
Graph 2 Comparison of FLRV between the TNF-α and control groups
Graf 2. Porovnání FLRV mezi skupinou s podáním TNF-α a kontrolní skupinou Graph 2 Comparison of FLRV between the TNF-α and control groups

Absolutní objem FLRV rostl rychleji v případě aplikace MAB TGF-β1, zatímco u kontrolní skupiny byl růst kontinuálně pomalý v průběhu celého experimentu. Statisticky signifikantního rozdílu jsme zde docílili mezi 3. a 7. pooperačním dnem (p<0,05). Opět došlo ke ztrátě tohoto efektu v průběhu dalšího trvání experimentu (Graf 3) [36].

Porovnání FLRV mezi skupinou s podáním MAB TGF-β1 a kontrolní skupinou
Graph 3. Comparison of FLRV between the MAB TGF-β1 and control groups
Graf 3. Porovnání FLRV mezi skupinou s podáním MAB TGF-β1 a kontrolní skupinou Graph 3. Comparison of FLRV between the MAB TGF-β1 and control groups

V případě aplikace IL-6 byl prokázán statisticky signifikantní rozdíl v porovnání s kontrolní skupinou 7. pooperační den (p<0,05) (Graf 4) [37].

Porovnání FLRV mezi skupinou s podáním IL-6 a kontrolní skupinou
Graph 4 Comparison of FLRV between the IL-6 and control groups
Graf 4. Porovnání FLRV mezi skupinou s podáním IL-6 a kontrolní skupinou Graph 4 Comparison of FLRV between the IL-6 and control groups

Biochemické parametry

K posouzení funkční kapacity jater a k porozumění možným systémovým vedlejším efektům po aplikaci MSC byly stanoveny biochemické parametry, hladina cytokinů a růstových faktorů v séru. Sérové hladiny AST a ALT narostly po provedení PVL a aplikaci MSC, zatímco ostatní biochemické parametry zůstaly bez statisticky signifikantního rozdílu. Totéž platilo o stanovených hladinách HGF, IGF, TGFβ1 a TNFα [34].

V případě porovnání vývoje sérových biochemických parametrů po aplikaci TNF-α s kontrolní skupinou nebyly prokázány žádné statisticky signifikantní rozdíly. V souvislosti s aplikací TNF-α došlo k statisticky signifikantnímu nárůstu tohoto cytokinu v séru v porovnání s kontrolní skupinou. K normalizaci dochází již 1. pooperační den. Ostatní cytokiny zůstávaly v průběhu experimentu bez významného vývoje.

V případě podání MAB TGF-β1 nebyly prokázány statisticky signifikantní rozdíly ve stanovovaných biochemických parametrech při porovnání s kontrolní skupinou.

Po aplikaci IL-6 zůstávaly všechny studované biochemické parametry a cytokiny srovnatelné s kontrolní skupinou bez průkazu statisticky signifikantního rozdílu.

Histologické parametry

Histologická hodnocení jaterních biopsií byla provedena ke zjištění rozdílů v proliferační aktivitě mezi jednotlivými skupinami. Současně byly sledovány i morfometrické znaky. V případě MSC skupiny jsme identifikovali jednotlivé buňky značené BrdU a je možné je označit za buňky, které jsou buďto vlastními MSC, nebo buňkami z nich odvozenými (Obr. 1). V případě porovnání MSC a kontrolní skupiny nebyly prokázány žádné statisticky významné rozdíly ve velikosti hepatocytů, počtu dvoujaderných hepatocytů a rozměrech lalůčků. Nicméně byla pozorována tendence k větší velikosti lalůčků v MSC skupině. Proliferační aktivita v obou skupinách byla shodná.

V případě histologického vyšetření a porovnání TNF-α a kontrolní skupiny nebyly prokázány statisticky signifikantní rozdíly v případě rozměru lalůčku, nicméně ve skupině TNF-α byl velký rozptyl velikostí jednotlivých lalůčků a v porovnání se skupinou kontrolní byl větší výskyt rozměrných lalůčků. Rozměr hepatocytů, počty dvoujaderných hepatocytů a proliferační aktivita zůstávaly bez statistické významnosti [35].

Při porovnání MAB TGF-β1 a kontrolní skupiny nebyly prokázány statistické rozdíly ve velikosti lalůčků a hepatocytů. Byly zaznamenány rozdíly v distribuci počtu dvoujaderných hepatocytů na jedno optické pole, ale bez průkazu statistické významnosti (1−4 dvoujaderné hepatocyty na jedno optické pole u TGF-β1, zatímco u kontrolní skupiny se jednalo o 2−3,5 dvoujaderných hepatocytů na jedno optické pole) (Graf 5). Proliferační aktivita v obou skupinách byla bez statistického rozdílu [36].

Srovnání koncentrace dvoujaderných hepatocytů mezi MAB TGF-β1 a kontrolní skupinou. Dvoujaderné hepatocyty byly detekovány ve 20 optických polích
Graph 5. Comparison of binucleated hepatocyte concentrations between the MAB TGF-β1 and control groups. Binucleated hepatocytes were detected in 20 optical fields
Graf 5. Srovnání koncentrace dvoujaderných hepatocytů mezi MAB TGF-β1 a kontrolní skupinou. Dvoujaderné hepatocyty byly detekovány ve 20 optických polích Graph 5. Comparison of binucleated hepatocyte concentrations between the MAB TGF-β1 and control groups. Binucleated hepatocytes were detected in 20 optical fields

V případě porovnání histologických nálezů mezi IL-6 a kontrolní skupinou byly bez statistické signifikance velikosti lalůčků a hepatocytů. Byl prokázán statisticky významný rozdíl v počtu dvoujaderných hepatocytů, a to při jejich zvýšené koncentraci v IL-6 skupině ( Graf 6). Proliferační aktivita byla bez významného rozdílu [37].

Srovnání koncentrace dvoujaderných hepatocytů mezi IL-6 a kontrolní skupinou. Dvoujaderné hepatocyty byly detekovány ve 20 optických polích
Graph 6. Comparison of binucleated hepatocyte concentrations between the IL-6 and control groups. Binucleated hepatocytes were detected in 20 optical fields
Graf 6. Srovnání koncentrace dvoujaderných hepatocytů mezi IL-6 a kontrolní skupinou. Dvoujaderné hepatocyty byly detekovány ve 20 optických polích Graph 6. Comparison of binucleated hepatocyte concentrations between the IL-6 and control groups. Binucleated hepatocytes were detected in 20 optical fields

DISKUZE

V prezentované publikaci autoři shrnují všechny experimentální zkušenosti s možností ovlivnění FLRV po provedení PVL, a to jak cytokiny, tak monoklonálními protilátkami proti růstovým faktorům a také použitím kmenových buněk. Experimentální model se snaží přiblížit situaci v humánní chirurgii a přinést návrh řešení pro skupinu pacientů, u kterých není provedení prosté PVE účinné. Vlastní význam PVE spočívá ve zvyšování resekability jaterních malignit, v našem případě kolorektálních jaterních metastáz. Volbou prasete domácího se snažíme co nejvíce přiblížit lidské anatomii a fyziologii [34,35].

Po aplikaci MSC došlo k významné akceleraci růstu FLRV. Tento efekt však byl postupně ztracen v porovnání s kontrolní skupinou. Vysvětlením může být stacionární poměr tělesné hmotnosti k hmotnosti jater, který nelze po dosažení jeho původní hodnoty významným způsobem navyšovat [34]. Předchozí práce se snažily vysvětlit potenciál a přínos MSC k regeneraci jater, a to především na hlodavcích. Většina z těchto prací ovšem používala modely toxického poškození jater s vyřazením intrahepatálních progenitorů [33,41]. Di Bonzo pozoroval pouze 0,2 % lidských hepatocytů po transplantaci lidských MSC do imunodeficitních myší s chronickým poškozením jaterního parenchymu [42]. Trvale zůstává nezodpovězená otázka, zda MSC významně přispívají k regeneraci jater in vivo [43,44,45]. Přesto MSC vykazují schopnost diferenciace v hepatocyty za určitých podmínek in vitro [46,47]. Chamberlain pozoroval diferenciaci lidských MSC v hepatocyty po transplantaci do ovčích plodů [48]. Hepatocyty vhodné pro transplantaci byly získány z MSC stimulovaných růstovými faktory [49,50]. Je předpokládána také schopnost MSC produkovat hepatotropní působky s parakrinním efektem (například IL-6), které mohou stimulovat mikroprostředí periportálních prostor, ve kterých se předpokládá iniciace regenerace jaterního parenchymu [32]. V rámci našeho projektu jsme prokázali, že aplikace MSC je bezpečná v preklinickém modelu bez předpokládaných vedlejších účinků, jako například imunologických reakcí – hypersenzitivita nebo vznik významné imunitní reakce, vznik metabolických dysregulací nebo vznik intraportálních embolů [34].

Akcelerace růstu FLRV po aplikaci TNF-α a IL-6 potvrdila výsledky získané v předchozích in vitro modelech a na malých laboratorních zvířatech [8,12]. Zvolená dávka aplikovaného cytokinu akcelerovala regeneraci FLRV [51,52,53].

V případě aplikace MAB TGF-β1 došlo ke statisticky významné akceleraci růstu FLRV, nicméně tento efekt byl podobně jako po aplikaci MSC postupně ztracen. Výsledky naší studie potvrdily předchozí závěry získané v in vitro modelech nebo na malých experimentálních zvířatech [15,54,55,56]. Výběr monoklonální protilátky proti růstovému faktoru, který ukončuje první fázi regenerace a stimuluje hepatocyty k diferenciaci a produkci extracelulární hmoty s remodelací jaterní tkáně, imituje efekt zkoumaných cytokinů a preventuje tak eventuální vznik celkové reakce po podání TNF-α a IL-6 [5,13].

ZÁVĚR

Aplikace IL-6, TNF-α, MAB TGF-β1 a MSC se jeví jako vhodná stimulační agens k dosažení rychlejšího růstu FLRV. Přesto zůstává mnoho kontroverzních otázek ve vztahu k mechanismu jejich působení. Pro skutečné ověření jejich efektu v humánní medicíně bude zapotřebí jejich další zhodnocení v rámci klinických studií.

Poděkování: Tato studie byla podpořena programem UNCE/MED/006 „Centrum klinické a experimentální jaterní chirurgie“ Univerzity Karlovy a dále programem rozvoje vědních oborů Univerzity Karlovy (Progres Q39) a Národním program udržitelnosti I (NPU I) č. LO1503 poskytovaným Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy.

Konflikt zájmů

Autoři článku prohlašují, že nejsou v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise.

doc. MUDr. Václav Liška

Chirurgická klinika, UK, LF v Plzni, FN Plzeň

alej Svobody 80

304 60 Plzeň

e-mail: liskav@fnplzen.cz


Zdroje

1. Abdalla EK, Hicks ME, Vauthey JN. Portal vein embolization: rationale, technique and future prospects. British Journal of Surgery 2001;88:165–75.

2. Makuuchi M, Takayasu K, Takayama T. Preoperative transcatheter embolization of portal venous branch for patient receiving extended lobectomy due to the bile duct carcinoma. Journal of Japanese Society for Clinical Surgery 1984;45:14−20.

3. Makuuchi M, Thai BL, Takayasu K, et al. Preoperative portal embolization to increase safety of major hepatectomy for hilar bile duct carcinoma: a preliminary report. Surgery 1990; 107: 521−7.

4. Harada H, Imamura H, Miyagawa S, et al. Fate of human liver after hemihepatic portal vein embolization: cell kinetic and morphometric study. Hepatology 1997;26:1162−70.

5. Kusaka K, Imamura H, Tomiya T, et al. Factors affecting regeneration after portal vein embolization. Hepatogastroenterology 2004;51:532−5.

6. Azoulay D, Castaing D, Smail A, et al. Resection of non-resectable liver metastases from colorectal cancer after percutaneus portal vein embolization. Annals of Surgery 2000;231:480−6.

7. Stefano D, de Baere T, Denys A, et al. Preoperative percutaneus portal vein embolization: evaluation of adverse events in 188 patients. Radiology 2005;234:625−30.

8. Cornell RP. Acute phase responses after acute liver injury by partial hepatectomy in rats as indicators of cytokine release. Hepatology 1990;11:923−31.

9. Fausto N. Liver regeneration. Journal of Hepatology 2000;32:19−31.

10. Fausto N, Riehle KJ. Mechanisms of liver regeneration and their clinical implications. Journal of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery 2005;12:181−9.

11. Michalopoulos GK, DeFrances MC. Liver regeneration. Science 1997;237:60−6.

12. Fukuhara Y, Hirasawa A, Li XK, et al. Gene expression in the regenerating rat liver after partial hepatectomy. Journal of Hepatology 2003;38:784−92.

13. Mangnall D, Bird NC, Majeed AW. The molecular physiology of liver regeneration following partial hepatectomy. Liver International 2003;23:124−38.

14. Zimmermann A. Regulation of liver regeneration. Nephrology Dialysis Transplantation 2004;19:iv6−iv10.

15. Armendariz-Borunda J, Katai H, Jones CM, et al. Transforming growth factor beta gene expression is transiently enhanced at a critical stage during liver regeneration after CCl4 treatment. Laboratory Investigation 1993;69:283−94.

16. Bustos M, Sangro B, Alzuguren P, et al. Liver damage using suicide genes: a model for oval cell activation. The American Journal of Pathology 2000;157:549−59.

17. Kusaka K, Imamura H, Tomiya T, et al. Expression of transforming growth factor-alpha and -beta in hepatic lobes after hemihepatic portal vein embolization. Digestive Diseases and Sciences 2006; 51:1404−12.

18. Oe S, Lemmer ER, Conner EA, et al. Intact signaling by transforming growth factor beta is not required for termination of liver regeneration in mice. Hepatology 2004;40:1098−105.

19. Lilja H, Kamohara Y, Neuman T, et al. Transforming growth factor beta1 helps maintain differentiated functions in mitogen-treated primary rat hepatocyte cultures. Molecular Cell Biology Research Communications 1999;1:188−95.

20. Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis. Gastroenterology 2008;134: 1655−69.

21. Viebahn CS, Yeoh GC. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2008; 40:855−73.

22. Coelho MC, Tannuri U, Tannuri AC, et al. Expression of interleukin 6 and apoptosis-related genes in suckling and weaning rat model of hepatectomy and liver regeneration. Journal of Pediatric Surgery 2007;45:613−9.

23. Duncan JR, Hicks ME, Cai SR, et al. Embolization of portal vein branches induces hepatocyte replication in swine: a potential step in gene therapy. Radiology 1999;210:467−77.

24. Broering DC, Hillert C, Krupski G, et al. Portal vein embolization vs. portal vein ligation for induction of hypertrophy of the future liver remnant. Journal of Gastrointestinal Surgery 2002;6:905−13.

25. Barry FP. Biology and clinical applications of mesenchymal stem cells. Birth Defects Research Part C: Embryo Today 2003;69:250−6.

26. Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002;418:41−9.

27. Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nature Medicine 2000;6:1229−34.

28. Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science 1999;284:1168−70.

29. Ringe J, Kaps C, Schmitt B, et al. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell and Tissue Research 2002;307:321−7.

30. Vassilopoulos G, Wang PR, Russell DW. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion. Nature 2003;422:901−4.

31. Wang X, Willenbring H, Akkari Y, et al. Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes. Nature 2003,422:897−901.

32. Aldeguer X, Debonera F, Shaked A, et al. Interleukin-6 from intrahepatic cells of bone marrow origin is required for normal murine liver regeneration. Hepatology 2002;35:40−8.

33. Dahlke MH, Popp FC, Bahlmann FH, et al. Liver regeneration in a retrorsine/CCl4-induced acute liver failure model: do bone marrow-derived cells contribute? Journal of Hepatology 2003;39:365−73.

34. Liska V, Slowik P, Eggenhofer E, et al. Intraportal injection of porcine multipotent mesenchymal stromal cells augments liver regeneration after portal vein embolization. In Vivo 2009;23:229−36.

35. Liska V, Treska V, Mirka H, et al. Tumour necrosis factor-alpha stimulates liver regeneration after partial portal vein ligation – experimental study on porcine model, Hepatogastroenterology 2012;59:114.

36. Liska V, Treska V, Mirka H, et al. Inhibition of transforming growth factor beta-1 augments liver regeneration after partial portal vein ligation in a porcine experimental model. Hepatogastroenterology 2012;59:235−40.

37. Liska V, Treska V, Mirka H, et al. Interleukin-6 augments activation of liver regeneration in porcine model of partial portal vein ligation. Anticancer Research 2009;29:2371−7.

38. Liska V, Treska V, Skalicky T, et al. Cytokines and liver regeneration after partial portal vein ligation in porcine experimental model. Bratislavske lekarske listy 2009;110:447−53.

39. Teoh N, Field J, Farrell G. Interleukin-6 is a key mediator of the hepatoprotective and pro-proliferative effects of ischaemic preconditioning in mice. Journal of Hepatology 2006;45:20−7.

40. Deneme MA, Ok E, Akcan A, et al. Single dose of anti-transforming growth factor-beta1 monoclonal antibody enhances liver regeneration after partial hepatectomy in biliary-obstructed rats. The Journal of Surgical Research 2006;136:280−7.

41. Kang XQ, Zang WJ, Song TS, et al. Rat bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into hepatocytes in vitro. World Journal of Gastroenterology 2005;11:3479−84.

42. di Bonzo LV, Ferrero I, Cravanzola C, et al. Human mesenchymal stem cells as a two-edged sword in hepatic regenerative medicine: engraftment and hepatocyte differentiation versus profibrogenic potential. Gut 2008;57:223−31.

43. Dahlke MH, Popp FC, Larsen S, et al. Stem cell therapy of the liver--fusion or fiction? Liver transplantation 2004;10:471−9.

44. Lysy PA, Campard D, Smets F, et al. Persistence of a chimerical phenotype after hepatocyte differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Proliferation 2008;41:36−58.

45. Popp FC, Piso P, Schlitt HJ, et al. Therapeutic potential of bone marrow stem cells for liver diseases. Current Stem Cell Research & Therapy 2006;1:411−8.

46. Najimi M, Khuu DN, Lysy PA, et al. Adult-derived human liver mesenchymal-like cells as a potential progenitor reservoir of hepatocytes? Cell Transplantation 2007;16:717−28.

47. Ong SY, Dai H, Leong KW. Hepatic differentiation potential of commercially available human mesenchymal stem cells. Tissue Engineering 2006;12:3477−85.

48. Chamberlain J, Yamagami T, Colletti E, et al. Efficient generation of human hepatocytes by the intrahepatic delivery of clonal human mesenchymal stem cells in fetal sheep. Hepatology 2007;46:1935–45.

49. Banas A, Teratani T, Yamamoto Y, et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology 2007;46:219−28.

50. Yamamoto Y, Banas A, Murata S, et al. A comparative analysis of the transcriptome and signal pathways in hepatic differentiation of human adipose mesenchymal stem cells. Federation of European Biochemical Societies Journal 2008;275:1260−73.

51. Heinrich S, Jochum W, Graf R, et al. Portal vein ligation and partial hepatectomy differentially influence growth of intrahepatic metastasis and liver regeneration in mice. Journal of Hepatology 2006;45:35−42.

52. Teoh N, Field J, Farrell G. Interleukin-6 is a key mediator of the hepatoprotective and pro-proliferative effects of ischaemic preconditioning in mice. Journal of Hepatology 2006;45:20−7.

53. Baier PK, Baumgartner U, Wolff-Vorbeck G, et al. Hepatocyte proliferation and apoptosis in rat liver after liver injury. Hepato-Gastroenterology 2006;53:747−52.

54. Armendariz-Borunda J, LeGros L Jr, Campollo O, et al. Antisense S-oligodeoxynucleotides down-regulate TGFbeta-production by Kupffer cells from CCl4-injured rat livers. Biochimica et Biophysica Acta 1997; 1353:241−52.

55. Deneme MA, Ok E, Akcan A, et al. Single dose of anti-transforming growth factor-beta1 monoclonal antibody enhances liver regeneration after partial hepatectomy in biliary-obstructed rats. The Journal of Surgical Research 2006;136:280−7.

56. Delgado-Rizo V, Salazar A, Panduro A, et al. Treatment with anti-transforming growth factor beta antibodies influences an altered pattern of cytokines gene expression in injured rat liver. Biochimica et Biophysica Acta 1998;1442:20−7.

Štítky
Chirurgie všeobecná Ortopedie Urgentní medicína

Článek vyšel v časopise

Rozhledy v chirurgii

Číslo 5

2018 Číslo 5

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Příběh jedlé sody
nový kurz
Autoři: MUDr. Ladislav Korábek, CSc., MBA

Krvácení v důsledku portální hypertenze při jaterní cirhóze – od pohledu záchranné služby až po závěrečný hepato-gastroenterologický pohled
Autoři: PhDr. Petr Jaššo, MBA, MUDr. Hynek Fiala, Ph.D., prof. MUDr. Radan Brůha, CSc., MUDr. Tomáš Fejfar, Ph.D., MUDr. David Astapenko, Ph.D., prof. MUDr. Vladimír Černý, Ph.D.

Rozšíření možností lokální terapie atopické dermatitidy v ordinaci praktického lékaře či alergologa
Autoři: MUDr. Nina Benáková, Ph.D.

Léčba bolesti v ordinaci praktického lékaře
Autoři: MUDr. PhDr. Zdeňka Nováková, Ph.D.

Revmatoidní artritida: včas a k cíli
Autoři: MUDr. Heřman Mann

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se