Variabilita protilátkových klonů proti alfa-synukleinu a jejich využití v detekci Lewyho patologie

Neuropatologická diagnostika synukleinopatií se opírá o přítomnost patologických forem proteinu alfa-synukleinu (aSyn) v mozkové tkáni. Parkinsonova nemoc (PD), Parkinsonova nemoc s demencí (PDD) a demence s Lewyho tělísky (DLB) jsou tři formy nemoci s Lewyho tělísky (LBD) charakterizovány přítomností Lewyho patologie – Lewyho tělísek (LB) a dystrofických Lewyho neuritů (LN). Již od popsání aSyn na přelomu tisíciletí jako hlavního patologického proteinu charakterizujícího synukleinopatie se kromě jednoznačně definované Lewyho patologie začali objevovat další patologické agregáty tohoto proteinu.

Protein aSyn se fyziologicky vyskytuje ve formě monomeru zejména v neuronech, s nejvyšší koncentrací v oblasti terminálního butonu axonu. Jeho fyziologická monomerická forma je tvořena 140 aminokyselinami a díky své N-terminální doméně charakteru alfa-helixu má afinitu k buněčným membránám. Agregací monomerů aSyn nekovalentními vazbami vznikají patologické oligomery a fibrily, které dále tvoří komplexnější patologická depozita včetně mikroskopicky definovatelných LB a LN (obr. 1A, B) (1).

LB a LN byly dlouho pokládány za nejdůležitější depozita v patogenezi LBD. Zejména LB ovšem představují komplexní struktury tvořené patologickými agregáty minimálně 90 proteinů, fosfolipidy a dokonce organelami. Pouze část LB tvoří samotný aSyn. Detailní struktura aSyn a jeho agregátů v LB není jasná. Recentní studie ukazují, že fibrily, které byly dlouho pokládané za jejich primární složku, pravděpodobně představují pouze marginální skupiny inkorporovaných patologických forem aSyn (2). Mnohé studie in vivo i in vitro také prokazují vysokou toxicitu oligomerů a volných cytoplazmatických fibril aSyn (3,4). Samotná LB pak představují spíše důsledek patologického procesu agregace než samotnou toxickou entitu. Situaci komplikuje skutečnost, že všechna patologická depozita obsahují různé proteoformy aSyn. Ve specifických lokalizacích řetězce dochází k posttranslačním změnám – fosforylaci, ubikvitinaci, acetylaci a nitraci aminokyselin. Zejména za patologického stavu dochází také k tvorbě krátkých proteoforem zkrácením polypeptidového řetězce (obr. 1C) (1,5).

Korelace mezi Lewyho patologií a některými klinickými projevy LBD je dobře popsána. Toto tvrzení ale není univerzální. Zejména přítomnost a tíže demence u pacienta nelze s rozsahem patologické depozice aSyn spolehlivě korelovat (6). I přes tato zjištění však zůstává Lewyho patologie základním kritériem neuropatologické diagnostiky LBD. Pro běžnou patologickou praxi je zásadní vizualizace zejména LB a LN na parafinových řezech. Existují dva základní morfologické typy LB (7) (obr. 2). Mohou se vyskytovat ve své klasické, kmenové formě, v podobě cirkulárních struktur s eosinofilním centrem a periferním projasnění a dále v podobě kortikálních LB bez typického projasnění. Pravděpodobnými prekurzory klasických LB jsou tzv. pale bodies, homogenní depozita různého tvaru bez periferního projasnění, která jsou často pozorována v jedné buňce současně se samotnými LB. Klasická LB jsou pozorovatelná již v přehledném barvení hematoxylin/eozin. To neplatí pro kortikální LB, pale bodies a LN, které jsou detekovány zpravidla až za využití imunohistochemického nebo imunofluorescenčního značení.

Dle současných doporučených kritérií pro diagnostiku a staging LBD je nezbytné hodnocení přítomnosti Lewyho patologie v konkrétních oblastech mozku. Staging dle Braaka je pořád zlatým standardem. Na podkladě přítomnosti Lewyho patologie v dané anatomické oblasti určuje staging postižení v kaudo-rostrálním směru (9). Mezi další diagnostické systémy patří například staging dle McKeitha nebo jeho modifikace (10). Tyto systémy jsou založeny pouze na určení přítomnosti Lewyho patologie v podobě LB a/nebo LN v dané anatomické oblasti. Recentní klasifikace, tzv. Lewy pathology consensus criteria (LPC), ovšem doporučuje protokol s jednoznačným hodnocením jak pozitivního, tak negativního výsledku značení pro Lewyho patologii (11). Klasifikace LPC je založena na původním stagingu dle McKeitha, přidává však predominantní amygdalický typ a olfaktorický typ LBD (tab. 1).

Obr. 1. Variabilita proteoforem a agregátů alfa-synukleinu.

Obr. 2. Klasická Lewyho tělíska v přehledném barvení hematoxylin-eosin (A, 630x) a v imunohistochemickém značení pro alfa-synuklen, klon 4D6 (B, 630x), pale bodies v přehledném barvení hematoxylin-eosin (C, 630x) a v imunohistochemickém značení pro alfa-synuklen, klon 4D6 (D, 630x), kortikální Lewyho tělíska v imunohistochemickém značení pro alfa-synuklen, klon 4D6 (E, 630x) a dystrofické Lewyho neurity v imunohistochemickém značení pro alfa-synuklen, klon 4D6 (F, 400x).

Cílem naší studie bylo zhodnocení využitelnosti některých komerčně dostupných a široce používaných primárních protilátek v kontextu post mortem diagnostiky LBD. Zaměřili jsme se na imunohistochemický a imunofluorescenční průkaz Lewyho patologie pomocí protilátek proti všem základním částem polypeptidového řetězce aSyn, včetně konformačně specifických klonů a klonů pro detekci posttranslačně modifikovaného aSyn.

MATERIÁL A METODIKA

Soubor pacientů

Do naší studie byli zařazeni 4 pacienti s klinicky manifestní a neuropatologicky verifikovanou diagnózou PD, bez konkomitantního neuropatologického onemocnění charakteru jiné synukleinopatie, tauopatie a TDP-43 proteinopatie, bez malignity a bez akutních ischemických změn mozkové tkáně, bez klinických známek demence. Přehled souboru pacientů ukazuje tabulka 2. Jako negativní kontrola byla použita mozková tkáň 2 subjektů bez neurodegenerativního onemocnění, bez malignity a bez akutních ischemických změn mozkové tkáně. Mozek pacientů a kontrol byl post mortem zpracován dle standardních doporučení pro diagnostiku neurodegenerativních onemocnění (8). Mozková tkáň byla odebrána k diagnostickým a vědeckým účelům, projekt byl schválený Etickou komisí FNOL a LF UP v Olomouci.

Imunohistochemie a imunofluorescence

Parafinové bločky s formalinem fixovaným materiálem mesencefala pacientů byly zpracovány dle standardních doporučení. Byly pořízeny histologické řezy tloušťky 2 μm pro imunohistochemické i imunofluorescenční vyšetření. Byly použity 2 metody odmaskování epitopu – lázeň v 80 % vodním roztoku kyseliny mravenčí (pokojová teplota, 10 min) a teplem indukované odmaskování epitopu (zkr. HIER, z angl. heat-induced epitope-retrieval) za využití přistroje Milestone Micromed T/T Mega (120 °C, pH 6, 15 min). Použitá metoda je vždy uvedena v textu. Imunohistochemická analýza byla provedena s využitím kitu Dako REAL EnVision Detection System (kat. č. K500711-2) dle doporučení výrobce, ve všech značeních byl použit chromogen DAB. Multiplexní imunofluorescenční analýza byla provedena za využití kitu Akoya Opal 3-Plex Manual Detection Kit (kat. č. NEL810001KT). Použitý kit Akoya využívá metodiku tyramidových fluorescenčních značek, v našem případě Opal520 (odpovídá emisními spektru FITC), Opal570 (odpovídá emisnímu spektru Cy3) a Opal 690 (odpovídá emisnímu spektru Cy5). Skla byla montována za využití vodního montovacího média s DAPI (kat. č. ab104139). K potlačení autofluorescence bylo použito barvení TrueBlack® (kat. č. #23007). Analýza signálů byla provedena za využití skeneru Olympus SlideView VS200 s excitační lampou X-Cite Xylis XT720L. V naší studií jsme k detekci aSyn využili 5 klonů primárních protilátek. Použité koncentrace a další informace o klonech jsou uvedeny v tabulce 3. Rozložení epitopů jednotlivých protilátek na polypeptidovém řetězci znázorňuje obr. 3.

Tabulka 1. Lewy pathology consensus criteria. Staging je založený na přítomnosti (+) nebo absenci (-) Lewyho patologie. OB – bulbus olfactorius, amy – amygdala, ndX – nucleus dorsalis nervi vagi, sn – substantia nigra, mTCx – mediální temporální kortex, cing cingulární kortex, FCx – frontální kortex, Pcx – parietální kortex. Upraveno dle Attems et al, 2021 (10).

Tabulka 2. Epidemiologická data pacientů.

Tabulka 3. Primární protilátky použité ve studii.

Obr. 3. Epitopy primárních protilátek využitých ve studii.

VÝSLEDKY

V naší studii jsme využili pro detekci aSyn v dopaminergních neuronech substantia nigra pars compacta pacientů s PD celkem 5 protilátek ze všech základních částí polypeptidového řetězce. Naším cílem byla analýza využitelnosti jednotlivých klonů zejména v kontextu mikromorfologie LB. Za tímto účelem jsme využili multiplexní imunofluorescenční značení. V úvodu jsme zvolili odmaskování epitopu za využití kyseliny mravenčí, protože se s výhodou využívá právě pro detekci aSyn v LB. První značení obsahovalo protilátkové klony proti epitopům ze všech základních částí polypeptidového řetězce – z N-terminální domény (klon Syn303), z C-terminální domény (klon 4D6) a částečně z NAC-domény (klon 42). V tomto případě se nejvíce specifický pro detekci pouze Lewyho patologie jeví klon Syn303, který téměř výhradně a specificky značí prstenec ve struktuře LB (obr. 4A, 4B). Naopak klony 4D6 a 42 poskytují přehled i o dalších formách aSyn ve tkáni, značí jak fyziologický aSyn, tak patologická depozita (obr. 4A, 4B). Klon 42 vykazuje spíše difuzní pozitivitu LB (obr. 4B). Protilátka 4D6, obdobně jako Syn303, značí na histologickém řezu prstenec LB (obr. 4B).

Dále jsme přistoupili ke značení fosforylované proteoformy aSyn klonem protilátky Ser129. Společně s ním jsme využili klon 5G4, který má jako jeden z mála dostupných klonů potvrzenou konformační selektivitu pro agregované formy aSyn. V porovnání s difuzní, nespecifickou pozitivitou klonu 42, poskytují Ser129 i 5G4 pouze mírně pozitivní pozadí, pozitivita je pak pozorována zejména v LB (obr. 4C). Klon Ser129 typicky značí prstenec blízko centra LB, zatímco signál poskytovaný klonem 5G4 je spíše difuzní, v rozsahu celého tělíska (obr. 4D).

Analyzovali jsme také možnost využití HIER jako náhradu běžně používané kyseliny mravenčí. Opět jsme značili histologické řezy substantia nigra pars compacta pacientů s Parkinsonovou nemocí. Zde jsme použili pro značení 3 klony protilátek – 4D6, 5G4 a Ser129. V tomto experimentu klon 4D6, obdobně jako v případě odmaskování epitopu za použití kyseliny mravenčí, neznačí pouze LB, ale celé spektrum depozit aSyn. V kontrastu k tomu 5G4 a Ser129 i v případě HIER značí zejména struktury LB (obr. 5A). V kontextu mikromorfologie LB klon 4D6 značí prstenec v terénu tělíska (obr. 5B). Narazili jsme ovšem na malou populaci LB, ve který poskytuje klon 4D6 pouze slabou nebo žádnou pozitivitu (obr. 5C). Klon 5G4 značil LB typicky uniformně, a to zjevně více homogenně a intenzivně než v případě odmaskovaní za využití kyseliny mravenčí (obr. 5B, 5C). Klon Ser129 zpravidla vykazuje pozitivitu v podobě tenkého prstence LB (obr. 5B, 5C), která odpovídá značení v předchozích experimentech.

Metodologii za využití HIER jsme aplikovali také na multiplexní značení pro detekci LN. Za využití klonu 4D6 jsme pozorovali častou selektivní pozitivitu pouze části LN (obr. 6). Klon 5G4 značil menší část depozit než klon 4D6, ovšem typicky pozitivní byly i oblasti, které jsme nebyli schopni detekovat s klonem 4D6 (obr. 6). Klon Ser129 vykazoval pouze slabou pozitivitu, která se částečně kryje se značením klonem 5G4 (obr. 6).

Na závěr jsme se zaměřili na zhodnocení spektra patologických depozit charakteru kmenových LB, pale bodies, nebo jejich předpokládaných prekurzorů, a to jak za využití imunohistochemického, tak multiplexního fluorescenčního značení při odmaskovaní epitopu metodou HIER. Výsledky ukazují, že pro jednoduchou a jednoznačnou interpretaci přítomnosti pouze LB se jeví jako vysoce specifické protilátkové klony 5G4 a S129, které vykazují silnou pozitivitu zejména v pozdních stádiích vývoje LB. Naproti tomu klon 4D6 poskytuje lepší přehled o všech formách aSyn, jak ukazuje imunohistochemické i imunofluorescenční značení (obr. 7). V komplexním porovnání imunohistochemického značení aSyn klony 4D6 a 5G4 ve větších okrscích mesencephala můžeme jednoznačně pozorovat vyšší selektivitu klonu 5G4 (obr. 8).

Obr. 4. Vizualizace Lewyho tělísek v substantia nigra po odmaskovaní epitopu za využití kyseliny mravenčí. Mulitplexní značení za využití tří fluorescenčních značek – zelené (FITC), žluté (Cy3) a červené (Cy5) – vizualizuje různou specificitu protilátkových klonů 4D6, 42, Syn303, 5G4 a Ser129 a kolokalizaci signálů v kontextu mikromorfologie Lewyho tělíska. Reprezentativní skeny substantia nigra pacientů PD1 (A, B) a PD3 (C, D).

Obr. 5. Vizualizace Lewyho tělísek v substantia nigra po odmaskovaní epitopu za využití HIER. Mulitplexní značení za využití tří fluorescenčních značek – zelené (FITC), žluté (Cy3) a červené (Cy5) – vizualizuje různou specificitu protilátkových klonů 4D6, 5G4 a Ser129 a kolokalizaci signálů v kontextu mikromorfologie Lewyho tělíska. Reprezentativní skeny substantia nigra pacienta PD1.

Obr. 6. Vizualizace dystrofických Lewyho neuritů v substantia nigra po odmaskovaní epitopu za využití HIER. Mulitplexní značení za využití tří značek – zelené (FITC), žluté (Cy3) a červené (Cy5) – vizualizuje různou specificitu protilátkových klonů 4D6, 5G4 a Ser129 a kolokalizaci signálů v kontextu mikromorfologie Lewyho neuritů. Reprezentativní skeny substantia nigra pacienta PD2.

Obr. 7. Vizualizace Lewyho tělísek, pale bodies a prekurzorových depozit v substantia nigra po odmaskovaní epitopu za využití HIER. Mulitplexní značení za využití tří značek – zelené (FITC), žluté (Cy3) a červené (Cy5) – vizualizuje různou specificitu protilátkových klonů 4D6, 5G4 a Ser129. Pro porovnaní vizualizace za pomoci imunohistochemického značení za využití klonu 4D6. Reprezentativní skeny substantia nigra pacienta PD4.

Obr. 8. Mikrofotografie okrsků substantia nigra s imunohistochemickým značením za využití klonu 4D6 (A, B, 400x) a 5G4 (C, D, 400x). A a C jsou reprezentativní skeny pacienta PD1, B-D jsou reprezentativní skeny pacienta PD4.

DISKUSE

Výběr správného klonu protilátky a využití optimalizovaného protokolu včetně efektivního odmaskování epitopu je pro vizualizaci LB a LN klíčové. Z pohledu diagnostiky je ideální klon protilátky poskytující dostatečný přehled o přítomnosti Lewyho patologie bez zbytečného pozitivního pozadí v podobě fyziologického aSyn, nebo jiných agregátů, které v současném konceptu stagingu onemocnění nehrají roli. V posledních letech se ukazuje, že mnohé protilátkové klony, které měly být specifické právě pro oligomery, fibrily a nefibrilární agregáty aSyn neplní tuto funkci vůbec, nebo pouze s velkými otazníky. Dle dostupných informací není momentálně na trhu jednoznačně validovaná, komerčně dostupná protilátka, která je specifická pouze pro fibrily aSyn. Obdobná situace je v případě oligomerů (12).

Nemalá část imunohistochemických analýz LB a LN využívá pro diagnostiku protilátky proti oblastem C-terminálního řetězce. Afinita celého spektra protilátek je ale zásadním způsobem ovlivňována četnými modifikacemi v této oblasti proteinu. Vůbec nejčastější posttranslační modifikací v depozitech charakteru LB a LN je fosforylace polypeptidového řetězce aSyn na serinu v pozici Ser129 (13). V naší studií jsme použili klon 4D6 s epitopem v pozici 124-134 a dále klon Ser129 s afinitou k nejběžnější fosforylované proteoformě aSyn se stejným epitopem a fosforylovaným serinem v pozici Ser129. Klon 4D6 značil v naší studií široké spektrum fyziologicky i patologicky se vyskytujících forem a agregátů aSyn. Nedokáže ale označit, stejně jako klon Ser129, vůbec nejčastější zkrácené proteoformy aSyn 1-119 a 1-122

(14). Jelikož v LB a LN jsou ale pravděpodobně vždy přítomné proteoformy bez zkrácení na C-terminálním řetězci, poskytují oba klony základní přehled o přítomnosti Lewyho patologie. Otázka, proč klon 4D6 v naší studii nevizualizuje celé spektrum LB, nesouvisí tedy nejspíše se zkaracováním polypeptidového řetězce. Jednou z interpretací je přítomnost vícečetných posttranslačních změn na C-terminální doméně. Kombinace fosforylace, ubikvitinace, acetylace a nitrace C-terminálního řetězce zřejmě způsobuje nemožnost protilátky se navázat na svůj epitop. Obdobná situace platí pro klon Ser129, i když ten se jeví jako robustnější alternativa, protože jeho reaktivita je ovlivněná dalšími postranslačními modifikacemi C-terminálního řetězce pravděpodobně v menší míře (15). V naší studií klon S129 značil všechna patologická depozita charakteru LP, intenzita pozitivního signálu ovšem byla variabilní. Druhou interpretaci nabízí metodologie odmaskování epitopu, protože zcela ojedinělé, 4D6-negativní LB jsme pozorovali pouze v případě využití HIER.

Protilátkový klon Syn303 s epitopem na N-terminální doméně v pozici 1-5 je dle výrobce a některých dostupných studií specifický pro patologické formy aSyn obsažené v inkluzích (16). Tato tvrzení ale vyžadují další verifikaci. V naší studii klon Syn303 značil LB specificky, ovšem stále bylo možné pozorovat nevýraznou pozitivitu pozadí.

Protilátkový klon 42, známy také jako Syn-1, je díky svému epitopu na hranici NAC domény a C-terminální domény v pozici 91-99 dobrou alternativou pro značení všech fyziologických i patologických forem aSyn. Posttranslační modifikace jsou v této části polypetidového řetězce málo časté. Jeho nevýhodu je tedy v kontextu detekce LB a LN vysoce nespecifické pozadí, které bylo pozorováno i v naší analýze.

Klon 5G4 dle dostupných studií vykazuje silnou afinitu zejména ke všem agregovaným formám proteinu (12,17). Jelikož se váže na hranici mezi NAC-doménou a N-terminální doménou proteinu v pozici 46-53, je stejně jako v případě klonu 42 eliminované riziko, že nezachytí nejčastější zkrácené proteoformy aSyn. Naše studie jasně ukazuje, že klon 5G4 specificky značí agregované formy a aSyn v oblastech bez Lewyho patologie značí pouze v malé míře.