Cytotoxicita keramických materiálů


Cytotoxicity of Ceramic Materials

Paper presents cytotoxicity testing procedure in vitro of preselected dental ceramics. Direct contact test and extract test were monitored. A population of mouse fibroblasts NIH 3T3 was used for both tests. Results show all tested dental ceramics can be considered non-cytotoxic, except the lithium disilicate material.

Key words:
cytotoxicity, dental ceramics


Autoři: L. Vavřičková 1;  T. Dostálová 2;  J. Ulrichová 3
Působiště autorů: Stomatologická klinika LF UK a FN, Hradec Králové 1;  Dětská stomatologická klinika 2. LF UK a FN Motol, Praha 2;  Laboratoř buněčných kultur LF UP, Olomouc 3
Vyšlo v časopise: Česká stomatologie / Praktické zubní lékařství, ročník 111, 2011, 2, s. 46-52
Kategorie: Původní práce – experimentální studie

Souhrn

Práce se zabývá testováním cytototoxicity in vitro vybraných vzorků dentálních celokeramických materiálů. Materiály byly podrobeny testu přímého kontaktu a testu extraktu. Testy byly prováděny na populaci buněčné linie myších fibroblastů NIH 3T3 v buněčné kultuře. Z výsledků je patrné, že všechny materiály mohou být považovány za netoxické kromě lithium disilikátové keramiky.

Klíčová slova:
cytotoxicita, keramické dentální materiály

ÚVOD

Keramické materiály jsou v současné době považovány ve stomatologii za materiál první volby pro kvalitní protetické fixní rekonstrukce chrupu. Nejenže mají dokonalé estetické vlastnosti, ale i jejich vlastnosti mechanické jsou nyní srovnatelné s kovokeramickými náhradami [8, 10]. Mezi jejich další výhody patří i biologická netečnost keramiky. Na rozdíl od kovových náhrad neuvolňují v prostředí ústní dutiny ionty kovů, které mohou pak cytototoxicky [14] nebo alergogenně působit na okolní tkáně. Keramické materiály můžeme rozdělit podle chemického složení nebo podle technologie výroby [15]. Klasifikace keramiky podle chemického složení je pro zhodnocení vlastností materiálu vhodnější. V současné době keramiku dělíme na křemičitou skelnou, oxidovou sklem infiltrovanou a oxidovou či polykrystalickou [7]. Keramika křemičitá vyniká estetickými vlastnostmi, ovšem její vlastnosti mechanické poněkud zaostávají za  keramikou oxidovou. Keramika oxidová je dnes v popředí zájmu, zvláště keramika obsahující oxid zirkoničitý. Ten lze stabilizovat přidáním oxidů: CaO, MgO, Y2Onebo CeO2. Vzniká slitina, která má tetragonální strukturu i při pokojové teplotě [3, 11]. Tento materiál dobře odolává ohybu a málo mění své vlastnosti vlivem stárnutí [4, 12]. Nejvíce je dnes používán oxid zirkoničitý v podobě 3Y-TZP (yttrium cation-doped tetragonal zirconia polycrystals) s obsahem 3 mol % Y2O3, který slouží jako stabilizátor (např. Cercon®, Noritake atd.) [6] (obr. 1).

Keramická jádra Procera<sup>®</sup> Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub>
Obr. 1. Keramická jádra Procera<sup>®</sup> Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub>

TOXICKÉ A CYTOTOXICKÉ ÚČINKY

Přestože je keramika považována za bioinertní materiál, je však nutné podotknout, že i mezi keramickými materiály existují rozdíly v jejich cytotoxickém působení na buňky gingivy a jiných tkání. Rozdílná cytotoxicita je podmíněná rozdílným chemickým složením jednotlivých materiálů.

Podle Bracketta a kol. [1] není možné považovat lithium disilikátovou keramiku za biologicky inertní. Stejný poznatek uvádějí též Messer a kol. [9]. Dle nich lithium disilikátová keramika, konkrétně Empres II, má horší biologické vlastnosti než většina dentálních slitin a kompozitních materiálů. Ovšem většina keramických materiálů je z hlediska cytotoxicity akceptovatelná stejně dobře jako dentální slitiny nebo kompozitní materiály. Uo a kol. [13] ve své práci publikovali cytotoxické působení některých 3Y-TZP materiálů (oxid zirkoničitý s obsahem 3 mol % Y2O3) na fibroblasty gingivy. Tyto materiály lze považovat za biologicky inertní.

Elshahawy a kol. [5] ve své práci uvádějí téměř nulové cytotoxické působení oxidové keramiky ve srovnání s vysoce ušlechtilými slitinami chromniklovými a slitinami obsahujícími ušlechtilou ocel. Covacci a kol. [2] vyloučili jakékoliv mutagenní a onkogenní účinky 3Y-TZP materiálů na fibroblasty. 

CÍL STUDIE

Naším cílem bylo ověřit, zda dochází k cytotoxickému působení námi vybraných keramických materiálů na buněčnou kulturu. 

MATERIÁL A METODIKA

Bylo vybráno jedenáct nejvíce používaných druhů keramických materiálů (tab. 1, tab. 2). Z každého druhu keramiky jsme vyrobili přesně definovaná jádra (10 kusů). Jednalo se o horní střední řezák, síla jádra byla 0,4 mm, hmotnost byla 0,22 g. Většina vzorků byla připravena CAD/CAM technologií, resp. technologií (MAD/MAM).

Tab. 1. Testované skelné nebo oxidové infiltrované keramické materiály
Testované skelné nebo oxidové infiltrované keramické materiály

Tab. 2. Testované polykrystalické keramické materiály
Testované polykrystalické keramické materiály

Zkouška sledovala cytotoxické působení pevného vzorku – jádra vybrané dentální keramiky na buněčnou linii myších fibroblastů NIH 3T3 v buněčné kultuře (European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SPG OJG United Kingdom (free from mycoplasma)). Testování cytotoxicity bylo založeno na aplikaci normy ČSN EN ISO 10993 část 5 (1999) – Biologické hodnocení prostředků zdravotnické techniky; dále pak dle ČSN EN ISO 7405 (1998) Stomatologie – Preklinické hodnocení biologické snášenlivosti prostředků zdravotnické techniky používaných ve stomatologii.

Pro zkoušení cytotoxicity in vitro byl sledován test přímého kontaktu a test extraktu. 

TEST PŘÍMÉHO KONTAKTU

Princip:

Zdravé buňky NIH 3T3 se v kultuře dělí, množí a adherují k vhodným kultivačním povrchům. Cytotoxická látka narušuje tyto procesy, což vede k poškození buněk, jejich odlučování z kultivačního povrchu a snížení jejich počtu v kultuře. Hodnocení cytotoxicity je při této metodě založeno na vizuálním – makroskopickém sledování inkorporace barviva krystalové violeti do živých buněk a mikroskopickém posouzení změn morfologie buněčné vrstvy (vakuolizace, odlučování buněk, cytolýza). Pokud se cytotoxický materiál uvede do kontaktu s buněčnou vrstvou, vytváří ve svém okolí zónu poškozených buněk, do které se barvivo neinkorporuje. Základem pro určení stupně cytotoxicity jsou šířka zóny – vzdálenost hranice nezbarvené zóny od okraje vzorku, popis změn stavu buněčné vrstvy a numerický odhad podílu poškozených buněk.

Pracovní postup:

Vzorky jsme před zahájením každého testu sterilizovali buď ponořením do 96% ethanolu, nebo v autoklávu po dobu 60 min. a analyzovali je v duplikátech. Test byl třikrát nezávisle opakován. Fibroblasty (7 ml suspenze, 105 buněk/ ml), které byly naneseny na Petriho misky, poté jsme do středu misky umístili sterilizovaný vzorek tak, aby nedošlo k porušení buněčné vrstvy. Po 24 hodinách v inkubátoru jsme kulturu hodnotili pomocí inverzního mikroskopu. Poté jsme vzorky kultury obarvili a změny jsme sledovali opět v inverzním mikroskopu. Pozorování jsme současně vyfotografovali.

Hodnocení:

  1. Plochu misky jsme dle šablony rozdělili na čtyři kvadranty.
  2. Posuvným měřidlem bylo možné změřit vzdálenost hranice živých obarvených buněk od okraje testovaného vzorku.
  3. S použitím inverzního mikroskopu při zvětšení 200x jsme posuzovali stav buněčné vrstvy (tab. 3).

Tab. 3. Hodnocení cytotoxicity vzorku v testu přímého kontaktu
Hodnocení cytotoxicity vzorku v testu přímého kontaktu

Hodnocení stupně cytotoxicity:

Cytotoxicita vzorku je charakterizována poměrem Index zóny/Index lýzy (tab. 4).

Tab. 4. Hodnocení stupně cytotoxicity vzorku v testu přímého kontaktu
Hodnocení stupně cytotoxicity vzorku v testu přímého kontaktu

TEST EXTRAKTU

Princip:

K přesnému zjištění množství živých buněk v kultuře se používá fotometrická metoda – MTT test. Tento test je založen na schopnosti živých buněk redukovat tetrazoliové soli na barevné formazanové produkty. Množství vytvořeného barviva, stanovené foto­metricky při vlnové délce 540 nm a vyjádřené absorbancí, je přímo úměrné metabolické aktivitě a počtu buněk v analyzovaném vzorku. Stupeň cytotoxicity je vyhodnocen na základě životnosti buněk, která je vyjadřována v % absorbance naměřené v kultuře v pří­tomnosti testované látky, vůči kontrolní kultuře bez daného vzorku.

Pracovní postup:

Vzorky jsme před zahájením každého testu sterilizovali buď ponořením do 96% ethanolu nebo v autoklávu po dobu 60 min. a analyzovali je opět v duplikátech. Extrakt jsme připravili v poměru 0,1 g vzorku na 1 ml extrakčního činidla. Extrakce probíhala za aseptických podmínek v kultivační láhvi v inkubátoru. Po ukončení extrakce byl extrakt pipetou přenesen do sterilní centrifugační zkumavky a centrigugován. Poté jsme testování cytotoxicity prováděli pro extrakt neředěný – 100% a při ředění 1:1 a 1:3. Test byl prováděn minimálně ve dvou nezávislých opakovacích cyklech.

Výpočet životnosti kultury:

Životnost kultury se stanovila výpočtem z průměru hodnot absorbance nalezených pro vzorek a pro kulturu buněk (kultura v nepřítomnosti vzorku):

jp_35010_f_1
jp_35010_f_1

Hodnocení stupně cytotoxicity ukazuje tabulka 5.

Tab. 5. Hodnocení stupně cytotoxicity vzorku v testu extraktu
Hodnocení stupně cytotoxicity vzorku v testu extraktu

Výsledky:

Test přímého kontaktu byl ve všech případech negativní. Na obrázku 2 je zachycen mikroskopický obraz kultury fibroblastů při testování s keramickým materiálem LAVA™.

Test přímého kontaktu - LAVA&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;
Obr. 2. Test přímého kontaktu - LAVA<sup>TM</sup>

Životnost buněk v testu extraktu ukazují tabulky 6 a 7 a graf 1.

Tab. 6. Výsledky testu extraktu skelné nebo oxidové infiltrované keramiky
Výsledky testu extraktu skelné nebo oxidové infiltrované keramiky

Tab. 7. Výsledky testu extraktu polykrystalické keramiky
Výsledky testu extraktu polykrystalické keramiky

Životnost buněk v testu extraktu
Graf 1. Životnost buněk v testu extraktu

V případě  lithium disilikátové keramiky a v několika případech u oxidové keramiky infiltrované sklem (ZrO2), klesla v testu extraktu životnost pod osmdesát procent.

V průběhu testování došlo u některých vzorků ke změně barvy.

DISKUSE

Výsledky ukazují, že všechny testované dentální materiály je možné považovat v testu přímého kontaktu za netoxické, s nulovým výsledkem cytotoxicity a Indexem zóny/ Indexu lýzy  0/0. V testu extraktu je stupeň cytotoxicity různý. Lithium disilikátová keramika IPS e. max®  Press se jevila jako lehce toxická. Výsledky této studie jsou podpořeny i výsledky výzkumu zahraničních autorů [1, 9], z nichž plyne, že lithium disilikátovou keramiku není možné považovat za biologicky inertní. Cytotoxicita této keramiky byla dokonce větší než cytotoxicita chromniklových slitin testovaných v předchozí studii [14]. U dvou vzorků keramiky In-Ceram® Zirconia byla životnost buněk nižší než 80 %. Při statistické analýze všech testovaných vzorků této keramiky je však životnost buněk celkově vyšší než 80 %.

U keramiky LAVA™, IPS e. max® Press, In-Ceram® Alumina, In-Ceram® Zirconia a Cerec® došlo při testování u všech vzorků ke změně odstínu testovaného jádra, přičemž nejvýraznější změna byla u keramiky In-Ceram® Zirkonia (obr. 3, obr. 4, obr. 5).

Povrch keramického jádra Cercon&lt;sup&gt;®&lt;/sup&gt;
Obr. 3. Povrch keramického jádra Cercon<sup>®</sup>

Povrch keramického jádra IPS e. max&lt;sup&gt;®&lt;/sup&gt; Press
Obr. 4. Povrch keramického jádra IPS e. max<sup>®</sup> Press

Povrch keramického jádra In-Ceram&lt;sup&gt;®&lt;/sup&gt; Alumina
Obr. 5. Povrch keramického jádra In-Ceram<sup>®</sup> Alumina

Závěr

Všechny námi testované dentální materiály lze považovat za netoxické v testu přímého kontaktu. V testu extraktu se keramika lithium disilikátová - IPS e. max® Press jevila jako lehce cytotoxická a za určitých podmínek i keramika In-Ceram® Zirconia. V některých případech došlo při testu extraktu ke změně barvy jádra (vznik tmavšího odstínu), nejvíce u keramiky In-Ceram® Zirconia.  

Studie byla podporována projektem GAUK č. 81508 a projektem IGA MZČR 9744-3.

MUDr. Lenka Vavřičková

Stomatologická klinika LF UK a FN

Sokolská 581

500 05  Hradec Králové

e-mail: vavrickova.l@seznam.cz 


Zdroje

1. Brackett, M. G., Lockwood, P. E. et al.: In vitro cytotoxicity response to lithium disilicate dental ceramics. Dent. Mater., 24, 2008, 4, s. 450-456.

2. Covacci, V., Bruzzese, N. et al.: In vitro evaluation of mutagenic and cancerogenic power of high purity zirconia ceramic. Biomaterials, 20, 1999, 4, s. 371-376.

3. Denry, I, Kelly, J. R.: State of the art of zirconia for dental applications. Dent. Mater., 24, 2008, s. 299-307.

4. Deville, S., Chevalier, J., Gremillard, L.: Influence of surface finish and residual stresses on the ageing sensitivity of biomedical grade zirconia. Biomaterials, 27, 2006, s. 2186-2192.

5. Elshahawy, W. M., Watanabe, I. a kol.: In vitro cytotoxicity evaluation of elemental ions released from different prosthodontic materials. Dent. Mater., 25, 2009, 12, s. 1551-1555.

6. Garvie, R. C., Nicholson, P. S.: Phase analysis in zirconia systems. J. Am. Ceram. Soc., 55, 1972, s. 303-305.

7. Hammerle, Ch., Sailer, I. et al: Dental ceramics. Quintessence Publishing, ISBN 987-1-85097-181-8.

8. Chong, K. H., Chai, J., Takahashi, Y., Wozniak, W.: Flexural strength of In-Ceram alumina and In-Ceram zirconia core materials. Int. J. Prosthodont, 15, 2002, s. 183-188.

9. Messer, R. L., Lockwood, P. E. et al.: In vitro cytotoxicity of traditional versus contemporary dental ceramics. J. Prosthet. Dent., 90, 2003, 5, s. 452-458.

10. Ryge, G., Cvar, J. F.: Criteria for clinical evaluation of dental restorative materials. US Dental health Center, Publication No.7902244, San Fran­cisco, USA.

11. Sato, T., Ohtaki, S., Shimada, M.: Transformation of yttria-partially-stabilized zirconia by low-temperature annealing in air. J. Mater. Sci., 20, 1985, s. 1466-470.

12. Sato, T., Shimada, M.: Crystalline phase-change in yttria-partially-stabilized zirconia by low-temperature annealing. J. Am. Ceram Soc., 67, 1984, s. 212-213.

13. Uo, M., Sjogren, G. et al.: Cytotoxicity and boxing property of dental ceramics. Dent. Mater., 19, 2003, 6, s. 487-492.

14. Vavřičková, L., Dostálová, T., Vahalová, D., Šrámková, J., Ulrichová, J.: Cytotoxicita dentálních slitin, Čes. Stomat., 107, 2007, 6, s. 138-143.

15. Vavřičková, L., Pilathadka, S., Dostálová, T.: Celokeramické systémy v klinické praxi. LKS., 18, 2008, 10 (Suppl.), s. A5-A11.

Štítky
Chirurgie maxilofaciální Ortodoncie Stomatologie
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se