Fellowship ČSAT: Leiden Academic Centre for Drug Research – Leiden University

27. 8. 2017 až 28. 2. 2018, Leiden, Nizozemsko

V termínu 27. 8. 2017 až 28. 2. 2018 proběhla má stáž na výzkumném pracovišti prof. Mirandy Van Eck na oddělení Biotherapeutics –⁠ Leiden Academic Centre for Drug Research –⁠ Leiden University, Nizozemsko. Zde jsem se byla zapojena do řešení širšího projektu –⁠ Atherosclerosis Regression: A challenging goal with the macrophage as therapeutic target. Tento projekt se zabývá možnostmi navození regrese aterosklerózy s perspektivou potencionální léčby pacientů s již rozvinutou formou aterosklerózy.

Byť byla možnost regrese aterosklerózy zamítána a považována za nepravděpodobnou zejména u pokročilých lézí s nekrotickým jádrem, velkým množstvím vaziva a kalcifikace [13], v posledních 20 letech studie provedené jak v rámci klinických studií, tak na zvířecích modelech (ApoE nebo LDL -⁠ recepror knock outované myši) přinesly důkazy o reverzibilitě aterosklerotického plaku [4]. Dnes je koncept regrese aterosklerózy namnoze přijímán, byť jeho základní mechanizmy a případná užitečnost v klinické praxi, vyžadují další výzkum.

Tento projekt je zaměřen zejména na úlohu makrofágů, které hrají významnou roli jak v rozvoji časných, tak i v pokročilých aterosklerotických lézích. Během progrese atero­sklerózy monocyty migrují do cévní stěny v důsledku působení chemokinů produkovaných zejména buňkami již diferencovanými v lézích [5–6]. Monocyty se následně diferencují na makrofágy a pohlcují lipidové částice, což může vést až k formaci tzv. pěnových buněk [7–10]. Tyto makrofágy produkují prozánětlivé cytokiny a řadu matrix-degradujících enzymů, vedoucích k tenčení vazivové čepičky (fibrous cap) a tkáňové faktory vedoucí k ruptuře plaku, formaci trombu nebo až ucpání cévy [11–17]. Na druhou stranu makrofágy disponují i schopností efluxu cholesterolu, což vede k odstraňování nadbytečného obsahu lipidů, a touto cestou případně až k regresi aterosklerotického plaku [18]. Není však známo, jsou-li pěnové buňky schopny se transformovat na makrofága nebo v dendritické buňky schopné migrace a následně migrovat z léze zpět do oběhu. Je možné, že pěnové buňky, zejména v případě pokročilého aterosklerotického plátu, již potřebují alternativní přístup zahrnující např. indukci programované buněčné smrti (apoptózy). Jiným přístupem k indukci regrese aterosklerózy může být snížení infiltrace nebo diferenciace od prozánětlivých k protizánětlivým makrofágům. V rámci tohoto projektu se studují mechanizmy nezbytné pro zahájení regrese aterosklerotické léze se zaměřením na makrofágy.

V rámci své stáže jsem pracovala zejména na projektech doktorandky Olgy Snip. Na 3 zvířecích modelech byl analyzován (1) vliv cyklodextrinu na regresi aterosklerózy u ApoE KO myší, (2) vliv ApoA1 mimetik (CS6213) u myší po transplantaci kostní dřeně od ApoA1 KO myší do ApoE KO příjemců a (3) znovuzavedení apolipoproteinu E prostřednictvím adeno-asociovaného viru s dalším podáváním CCR2 anta­gonisty (15a) pro inhibici influxu nových makrofágů. Pro tyto projekty jsem na základě literární rešerše navrhla a také zavedla 3 panely pro analýzu průtokovou cytometrií –⁠ panel zaměřený na (a) krvinky bílé řady obecně, (b) makrofágy a (c) monocyty.

(a) Panel je zaměřený na lymfocyty obecně. Z tohoto panelu jsme získali informace o zastoupení B-buněk (CD19⁺), T-buněk (CD4⁺ a CD8⁺ T-buňky), monocytů (Ly6C/Ly6G), makrofágů (CD11b⁺F4/80⁺) a jejich polarizaci (CD62L⁺CD44⁺, CD62L^-CD44⁺) v analyzovaných tkáních. (b) Makrofágový panel se zaměřoval na analýzu polarizace makrofágů, což bylo i naším hlavním cílem. Základní znakem makrofágů byla double pozitivita buněk pro F4/80 a CD11b a zároveň negativita CD161 (marker pro NK buňky) a Ly6G (znak neutrofilních granulocytů). Polarizace takto definovaných makrofágů byla dále hodnocena na základě exprese prozánětlivých (CD38, CCR7, MHC II) a protizánětlivých (CD206, CD62L) markerů. (c) Panel pro analýzu monocytů a slezinných makrofágů včetně gateovací strategie byl designován na základě publikace Rose et al [19]. Tento panel byl využit zejména kvůli faktu, že komerčně dostupné protilátky proti F4/80 značí slezinné makrofágy velmi slabě [19]. Po očištění od nemonocytárních populací mono­cyty/makrofágy (Ly6G^-Ly6C^low-neg/Ly6G^-Ly6C^Hi) byly dále analyzovány na základě exprese CCR2 a CD62L proteinů podílející se zejména na extravazaci monocytů z oběhu (jedná se o převážně protizánětlivé znaky). Kromě těchto panelů jsme ve vybraných studiích kvantifikovali množství lipidů v makrofázích respektive pěnových buňkách. K tomu bylo využito barvivo Bodipy (fluorescenčně značí neutrální lipidy kumulované v lipidových kapénkách) v kombinaci se značením proti makrofágům. Prostřednictvím těchto komplexních panelů jsme získali informace o řadě typů leukocytů (monocyty/makrofágy, T-buňky, B-buňky, NK-buňky, eozino­filní a neutrofilní granulocyty) včetně jejich diferenciace v závislosti na typu použité léčby v krvi, slezině a peritoneální dutině, případně i v srdečních lymfatických uzlinách a aortě.

Největší vliv na počty a polarizaci makrofágů v analyzovaných tkáních měla právě poslední forma terapie adenovirem v kombinaci s CCR2-antagonistou. Na základě publikovaných dat CCR2-antagonista vede ke snížení infiltrace makrofágy [20], což se potvrdilo. A léčba v kombinaci s adenovirem vedla k významnému poklesu počtu makrofágů a polarizaci spíše protizánětlivým směrem. Navíc tyto makrofágy měly významně nižší obsah lipidů ve srovnání s negativní kontrolou.

Výsledky z průtokové cytometrie ostatních 2 zvířecích modelů nevedly v námi sledovaných parametrech k tak zásadním změnám. V rámci mé stáže jsme bohužel nestihli provést další analýzy, jako jsou genové exprese, změny v zastoupení lipidů v krevní plazmě a histologické barvení a hodnocení oblasti kořene aorty a oblouku aorty.

Celkově hodnotím svou stáž na pracovišti v Leidenu jako zdařilou a velice přínosnou pro svůj další profesní růst. Je přínosné nahlédnout do fungování zahraniční laboratoře i vzdělávacího systému, v řadě skutečností odlišného od našeho. Stážovala jsem ve fakultní laboratoři, jež zajišťuje z velké části praxe pro studenty. Bakalářští studenti musí závěrem studia splnit několik kratších praxí (4 týdny) zahrnujících vyřešení malého projektu na několika různých pracovištích. To bych přirovnala k našim mírně rozšířeným praktickým cvičením s rozšířeným závěrečným protokolem. Magisterští studenti mají 9 měsíců na naměření experimentální části a sepsání výsledků ve formě diplomové práce. Obě úrovně pregraduálních studentů jsou většinou vedeny doktorandy. Magisterští studenti řeší samostatně ucelenou část projektu, která bývá součástí projektu supervizora, což urychluje řešení a vyhodnocování experimentů. Jedná se však o fakultní pracoviště s převážně pregraduálními studenty, kteří se teprve učí zacházet s laboratorním vybavením, což má často za následek nefunkčnost nebo nepřesnost vybavení, případně neřád v jeho umístění. Ač se kvalita vybavení a témat výzkumu na „západě“ neliší od našich, bylo by pro nás přínosné si osvojit jejich schopnost a chuť prezentovat a diskutovat jakékoli dílčí výsledky a ideje.

Moje stáž byla podpořena programem Erasmus, ale chtěla bych poděkovat za fellowship udělený ČSAT, který mi nesmírně pomohl v při absolvování celé stáže.

Mgr. Soňa Čejková 

cejs@ikem

www.ikem.cz

Doručeno do redakce/Doručené do redakcie/Received 20. 6. 2018