Analytický profil 1-[3-(3-propoxyfenylkarbamoyloxy)-2-hydroxypropyl]-4-(3-trifluórmetylfenyl)piperazíniumchloridu


Analytical profile of 1-[3-(3-propoxyphenylcarbamoyloxy)-2-hydroxypropyl]-4-(3-tri-fluoromethylphenyl)piperazinium chloride

The purpose of the paper was the completing of the experimentally estimated physicochemical descriptors spectrum of 1-[3-(3-propoxyphenylcarbamoyloxy)-2-hydroxypropyl]-4-(3-trifluoromethylphenyl)piperazinium chloride (labelled as 8e), an effective, highly lipophilic compound against non-tuberculous M. kansasii My 235/80. The identity of the structure 8e was verified by 1H- and 13C-NMR spectral data, IR spectrometry and by elemental analysis as well. The readout from mass spectrometry confirmed an existence of the molecular ion [M + H+]+. The purity of the evaluated compound 8e was checked by absorption thin-layer chromatography, the stability of its aqueous and methanolic solutions was investigated under UV/VIS light. The values of some physicochemical descriptors assigned to 8e, which had been previously published (pKa, log Pexp), were correlated with the constants associated with some antimycobacterially active molecules which are commonly used in therapeutical practice (isoniazid, pyrazinanide, para-aminosalicylic acid, ethionamide, streptomycine). For the content determination of the molecule of 8e, RP-HPLC (reversed-phase HPLC) method with an internal standard and UV/VIS spectrophotometry at the wavelength of 238 nm (aqueous medium) and at 244 nm (methanolic medium) were used.

Key words:
non-tuberculous mycobacteria - analytical evaluation - phenylcarbamates - N-phenylpiperazine


Autoři: Ivan Malík
Působiště autorů: Univerzita Komenského Bratislava, Farmaceutická fakulta, Katedra farmaceutickej chémie
Vyšlo v časopise: Čes. slov. Farm., 2011; 60, 283-289
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Predmetom práce bolo doplnenie niektorých experimentálne stanovených fyzikálno-chemických deskriptorov 1-[3-(3-propoxyfenylkarbamoyloxy)-2-hydroxypropyl]-4-(3-trifluórmetylfenyl)piperazíniumchloridu (pracovne označeného ako 8e), účinnej, relatívne vysokolipofilnej zlúčeniny proti netuberkulóznemu M. kansasii My 235/80. Identita látky 8e bola potvrdená 1H- a 13C-NMR spektrami, spektrometriou v IR oblasti ako aj elementárnou analýzou. Výstup z hmotnostnej spektrometrie potvrdil existenciu molekulového iónu [M + H+]+. Čistota hodnotenej zlúčeniny 8e bola overená pomocou adsorpčnej chromatografie na tenkej vrstve, stabilita jej vodných a metanolových roztokov bola hodnotená pri pôsobení UV/VIS žiarenia. Hodnoty niektorých základných fyzikálno-chemických charakteristík molekuly 8e stanovených v redchádzajúcich publikáciách (pKa, log Pexp) boli korelované s konštantami, ktoré prislúchajú niektorým v praxi používaným antimykobakteriálne aktívnym molekulám (izoniazid, pyrazínamid, kyselina para-aminosalicylová, etiónamid, streptomycín). Pre stanovenie obsahu molekuly 8e sa použila RP-HPLC (reversed-phase HPLC) metóda vnútorného štandardu a UV/VIS spektrofotometria pri vlnovej dĺžke 238 nm (vodné prostredie) a 244 nm (prostredie metanolu).

Kľúčové slová:
netuberkulózne mykobaktérie - analytické hodnotenie - fenylkarbamáty - N-fenylpiperazín

Úvod

Netuberkulózne formy mykobaktérií (non-tuberculous mycobacteria, NTM) sú voľne žijúce saprofyty, ktoré pôsobia pri „vhodných“ podmienkach ako iniciátor mnohých vážnych, prevažne infekčných ochorení, akými sú napríklad infekcie pľúc, mäkkých tkanív, kostí, svalov, ale aj cystickej fibrózy1). NTM sú tradične delené na tzv. pomaly rastúce (slowly growing Mycobacteria), kde patrí napríklad Mycobacterium (M.) avium, M. kansasii, M. malmoense, M. entiflavium alebo M. enopi a tzv. rýchlo rastúce (rapidly growing Mycobacteria), ktoré reprezentuje M. fortuitum, M. abscessus, M. smegmatis, M. ucogenicum alebo M. chelonae2). V ostatných rokoch sa zvyšuje incidencia a revalencia NTM napriek skutočnosti, že prenos NTM medzi postihnutými osobami nebol dokázaný3).

V súčasnosti je známych približne 125 druhov NTM, z ktorých je asi 60 považovaných za patogénnych pre človeka. M. kansasii je oportunistickým intracelulárnym patogénom, ktorý podľa DNA analýz zahŕňa približne 5–7 podtypov, z ktorých je najrozšírenejší podtyp1, 4, 5). Tento patogén je považovaný za vysokovirulentnú formu NTM, jeho výskyt je relatívne častý aj u osôb s neporušenou imunitou, ale najmä u imunodeficientných pacientov, ďalej sa objavuje pri chemoterapeutickej liečbe, pri orgánovej transplantácii alebo u pacientov na dialýze1, 6, 7).

Komplex M. avium (KMA) je tvorený minimálne dvoma typmi: M. avium (významný patogén „pôsobiaci“ pri diseminovaných ochoreniach) a M. intracellulare (najmä ako patogén respiračného systému) s dokázanou genetickou variabilitou. Podľa American Thoracic Society je ubikvitný KMA najčastejším mykobakteriálnym komplexom (na druhom mieste je M. kansasii) zapríčiňujúcim manifestovanie rôznych zdravotných komplikácií u obyvateľstva, akými sú pľúcne ochorenia, lymfoadenitída, abscesy poranení alebo kožné vredy, a to u pacientov s imunodeficienciou5), zdanlivo zdravých ľudí ale aj u osôb s nenarušeným imunitným systémom8, 9).

Liečba takýchto infekčných stavov môže byť v dôsledku obmedzeného spektra v praxi aplikovateľných a účinných antimikrobík komplikovanejšia ako terapeutické zvládnutie ochorení, ktoré spôsobuje tuberkulózne M. tuberculosis5). V súčasnosti je preto potrebné neustále projektovať, pripravovať a analyzovať nové, účinné a antimikobakteriálne rýchlo pôsobiace liečivá s vhodným toxikologickým profilom.

Predmetom predkladanej publikácie je vypracovanie, resp. doplnenie analytického profilu 1-[3-(3-propoxyfenylkarbamoyloxy)-2-hydroxypropyl]-4-(3-trifluórmetylfenyl)piperazíniumchloridu, vysokolipofilnej látky s pracovným označením 8e, ktorá bola pripravená v rámci syntézy, komplexného fyzikálno-chemického a biologického hodnotenia fenylkarbamátových štruktúr s inkorporovaným, variabilne substituovaným, N-fenylpiperazínovým fragmentom. Pri určovaní jej antimykobakteriálneho profilu sa ukázalo, že predstavuje efektívnejšie pôsobiacu zlúčeninu 10) proti netuberkulóznemu mykobakteriálnemu kmeňu M. kansasii My 235/80 (MIC = 16 μmol.l-1 po 14-dňovej inkubácii, resp. 32 μmol.l-1 po 21-dňovej inkubácii) v porovnaní s použitým štandardom, izoniazidom (INH; MIC = 50 μmol.l-1 po 14-dňovej ako aj po 21-dňovej inkubácii). Hodnoty MIC látky 8e proti M. avium My 330/88 však neboli experimentálne stanovené z dôvodu jej relatívnej nízkej rozpustnosti alebo pre minimálny rast mykobaktéria 10). Molekula 8e je zároveň menej účinná proti M. tuberculosis (MIC = 6, resp. 32 μmol.l-1) ako použitý INH11) (MIC = 0,5; resp. 1 μmol.l-1).

Pre zlúčeninu 8e možno predpokladať aj niekoľko ďalších farmakologických účinkov - okrem iného antagonistické ovplyvnenie α-adrenergných receptorov a vaskulárnu blokádu β1-adrenergných receptorov, čo navodzuje vazodilatáciu, ako je to v prípade pôsobenia karvedilolu12). Okrem toho antagonistické pôsobenie na α1-adrenergných receptoroch bude pravdepodobne zvýraznené prítomnosťou substituovaného N-fenylpiperazínového jadra v molekule, ktoré je prítomné aj v štruktúre naftopidilu 13). Schopnosť látky 8e ovplyvňovať funkcie kardiovaskulárneho systému však nebola doposiaľ experimentálne skúmaná.

POKUSNA ČASŤ

SPEKTRÁLNA ČASŤ

1H- a 13C-NMR spektrometria

Použité chemikálie: Deuterochloroform (rozpúšťadlo), ako vnútorný štandard bol použitý tetrametylsilán (Merck Chemicals Slovensko, Bratislava, SR). Pripravili sa roztoky hodnotenej substancie 8e s koncentráciou 2 mg/650 μl CH2Cl.

Prístroje a zariadenia: NMR spektrometer Varian Gemini 2000 (Varian, New Jersey, USA), magnet Oxford 300 MHz (Oxford, Veľká Británia).

Parametre pri meraní 1H-NMR spektier: Rozsah = 13 – -1 ppm, aktivačný čas = 3 s, počet akvizícií = 32, delay = 1 s, pracovná teplota = 20 °C.

Parametre pri meraní 13C-NMR spektier: Rozsah = 240 – -20 ppm, aktivačný čas = 1,815 s, počet akvizícií = 10 000, delay = 1 s, pracovná teplota = 20 °C.

1H-NMR spektrálna charakteristika látky 8e bola publikovaná v práci14): 1H-NMR (300 MHz) δ (ppm): 1,01 (t, 3H, OCH2CH2CH3); 2,60 (t, 4H, H-9, H-11); 2,80 (t, 4H, H-10, H-12); 3,01 (m, 2H, OCH2CH2CH3); 3,28 (t, 2H, OCH2CH2CH3); 4,10 (m, 1H, H-7); 4,33 (d, 2H, βJ8,9 = 2,90 Hz, H-8); 4,35 (d, 2H, βJ7,8 = 2,90 Hz, H-6); 6,80 (s, 1H, OH) vs. 7,00 (s, 1H, OH); 6,85 - 7,10 (m, 8H, ArH); 7,45 (s, 1H, NHCOO, H-5); 11,05 (s, 1H, NH+, H-17).

13C-NMR (75 MHz) δ (ppm): 10,35 (OCH2CH2CH3); 22,33 (OCH2CH2CH3); 48,81 (uhlík piperazínu); 53,15 (uhlík piperazínu); 60,01 (CH2CH(OH)CH2-piperazín); 65,62 (CH2CH(OH)CH2); 68,21 (OCH2CH2CH3); 67,21 (CH2CH(OH)CH2-piperazín); 108,55 (ArC); 110,21 (ArC); 112,10 (ArC); 113,01 (ArC); 115,24 (ArC); 119,37 (ArC); 124,75 (ArCCF3); 128,35 (ArC); 129,37 (ArC); (ArC); 130,51 (ArC); 136,20 (ArCNHCOO); 152,63 (ArC); 153,36 (NHCOO); 160,42 (ArCOCH2CH2CH3).

IR spektrometria

Prístroje a zariadenia: Spektrometer FT-IR Impact 400D (Nicolet), merané v tabletách KBr v koncentrácii 2 - 3 mg látky 8e/800 mg KBr.

IR cm-1: ν(N–H): 3248; ν(N+–H): 2605; νas(C–H): 2975; νs(C–H): 2870; ν(C=O): 1728; νas(C=C): 1596; δ(N–H): 1549; δ(CH2): 1450; νas(CAr–O–CAlk): 1232 (1077); γ(C–H): 763, 669.

Spektrofotometria v UV/VIS oblasti

Použité chemikálie: Destilovaná voda, metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR).

Príprava roztokov: Pripravili sa roztoky študovanej látky 8e s c = 5 × 10-5 mol.l-1 vo vode a v metanole.

Prístroje a zariadenia, pracovný postup: Sú charakterizované v práci14). Podľa Lambert-Beerovho zákona sa vypočítali hodnoty ε, resp. log ε pre všetky absorpčné maximá v obidvoch médiách.

Vodné prostredie - UV λmax nm (log ε): 206 (4,69), 238 (4,45), 278 (3,67). Metanolové prostredie - UV λmax nm (log ε): 212 (4,68), 244 (4,36), 282 (3,59).

Hmotnostná spektrometria

Hmotnostné spektrum (MS) molekuly 8e bolo zmerané na prístroji Agilent 1100 LC/MSD VL Trap (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Detailné informácie o podmienkach merania a pracovnom postupe sú publikované v práci14). Snímané rozpätie hmôt bolo v intervale 15–800 m/z.

ANALYTICKÁ ČASŤ

Stanovenie teploty topenia

Prístroje a zariadenia, pracovný postup: Sú charakterizované v práci15). Nekorigovaná hodnota teploty topenia látky 8e je uvedená v tabuľke 1.

Tab. 1. Základná charakteristika 4-(3-trifluórmetylfenyl)-1-[3-(3-propoxyfenylkarbamoyloxy)-2-hydroxypropyl]piperazíniumchloridu
Základná charakteristika 4-(3-trifluórmetylfenyl)-1-[3-(3-propoxyfenylkarbamoyloxy)-2-hydroxypropyl]piperazíniumchloridu
Vo vzorci je vyznačené číslovanie skeletu z hľadiska 1H-NMR spektrometrie.

Elementárna analýza

Prístrojové vybavenie a pracovný postup pri určení obsahu dusíka, uhlíka a vodíka (tab. 2) pre molekulu 8e je uvedený v publikácii15).

Tab. 2. Elementárna analýza látky <i>8e</i>
Elementárna analýza látky &lt;i&gt;8e&lt;/i&gt;

Stanovenie rozpustnosti

Použité chemikálie, prístroje a zariadenia, pracovný postup: Sú publikované v práci15). Rozpustnosť študovanej látky 8e bola stanovená podľa Európskeho liekopisu 6.0 16).

Stanovenie hodnoty Rf pomocou adsorpčnej chromatografie na tenkej vrstve

Použité chemikálie: Chloroform p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), dietylamín p.a. (Merck, Schudart, SRN), cyklohexán p.a. (Lach-Ner, Neratovice, ČR).

Materiál, prístroje a zariadenia: Silufol® UV254 s vrstvou silikagélu s rozmermi 200 × 200 mm (nastrihaný na vhodne veľké časti), sklenené komory s rozmermi 190 × 180 × 80 mm, mikrokapilára (Hamilton Bonaduz, Švajčiarsko), UV-lampa (KRUSS UV 240, 230V AC, Hamburg, SRN).

Pracovný postup: Na komerčne vyrábané fólie Silufol® UV254 s vrstvou silikagélu sa na vyznačený štart mikrokapilárou naniesli 2 μl 1% roztoku hodnotenej zlúčeniny 8e a medziproduktu jej syntézy, t.j. 2,3-epoxypropán-1-ylesteru kyseliny 3-propoxyfenylkarbámovej (s pracovným označením Epoxid-33), v metanole p.a. Po ukončení vyvíjania sa chromatogramy sušili pri laboratórnej teplote a detegovali sa pod UV-lampou pri vlnovej dĺžke 254 nm. Výsledné hodnoty sú priemerom zo šiestich paralelných stanovení (pozri časť Výsledky a diskusia). Ako vhodnou vyvíjacou sústavou pre TLC-hodnotenie sa ukázal systém S: chloroform : cyklohexán : dietylamín (ϕ = 6 : 3 : 1).

Stanovenie povrchového napätia a disociačnej konštanty

Použité chemikálie, prístroje a zariadenia, pracovný postup: Sú publikované v práci15). Hodnoty povrchového napätia (γ) a disociačnej konštanty (pKa) sú prezentované v tabuľke 3.

Tab. 3. Základné fyzikálno-chemické parametre hodnotenej zlúčeniny <i>8e</i>, ktoré boli publikované v prácach <sup>15, 17)</sup>
Základné fyzikálno-chemické parametre hodnotenej zlúčeniny &lt;i&gt;8e&lt;/i&gt;, ktoré boli publikované v prácach &lt;sup&gt;15, 17)&lt;/sup&gt;

Stanovenie logaritmu retenčného (kapacitného) faktora „k“ (log k’) z RP-HPLC a rozdeľovacieho koeficientu Pexp (log Pexp) v rôznych lipohydrofilných systémoch

Použité chemikálie, prístroje a zariadenia, pracovný postup, chromatografické podmienky (RP-HPLC), výber lipofiných prostedí pre shake-flask metódu stanovenia Pexp sú publikované v prácach15, 17). Hodnoty experimentálne stanovených parametrov lipofility sú uvedené v tabuľke 3.

Štúdium stability v UV/VIS oblasti

Prístroje a zariadenia: Pozri UV/VIS spektrofotometriu v rámci spektrálnej časti.

Pracovný postup: Pripravil sa vodný a metanolový roztok látky 8e s c = 5 × 10-5 mol.l-1. V priebehu 1 h sa v 5-min intervaloch sledovali (prípadné) posuny vo vlnových dĺžkach absorpčných maxím ako aj (prípadné) zmeny v absorbanciách pri jednotlivých absorpčných maximách v obidvoch zvolených prostrediach.

Stanovenie obsahu

Stanovenie obsahu látky 8e v UV/VIS oblasti spektra

Prístroje a zariadenia: Pozri UV/VIS spektrofotometriu v rámci spektrálnej časti.

Pracovný postup: Pripravil sa 0,002% zásobný(-é) roztok(-y) zlúčeniny 8e vo vode ako aj v metanole, ktorého(-ých) spektrum sa zaznamenalo v oblasti 190 až 400 nm proti čistému rozpúšťadlu. Z konkrétneho zásobného roztoku sa odpipetovalo postupne 2, 4, 6, 8 a 10 ml do piatich 10-ml odmerných baniek. Všetky odmerné banky sa doplnili po značku vodou, resp. metanolom a zaznamenala sa absorbancia takto pripravených roztokov 18). Z nameraných hodnôt A sa zostrojila kalibračná krivka; vo vodnom prostredí pri vlnovej dĺžke λmax = 238 nm, v metanole pri λmax = 244 nm. Hodnoty príslušných koncentrácií a absorbancií A sú uvedené v tabuľke 4.

Tab. 4. Parametre potrebné na zostrojenie kalibračnej krivky pre stanovenie obsahu látky <i>8e</i> vo vodnom (pri <i>λ</i><sub><i>2max</i></sub> = 238 nm) a v metanolovom (pri <i>λ</i><sub><i>2max</i></sub> = 244 nm) prostredí pomocou UV/VIS spektrofotometrie
Parametre potrebné na zostrojenie kalibračnej krivky pre stanovenie obsahu látky &lt;i&gt;8e&lt;/i&gt; vo vodnom (pri &lt;i&gt;λ&lt;/i&gt;&lt;sub&gt;&lt;i&gt;2max&lt;/i&gt;&lt;/sub&gt; = 238 nm) a v metanolovom (pri &lt;i&gt;λ&lt;/i&gt;&lt;sub&gt;&lt;i&gt;2max&lt;/i&gt;&lt;/sub&gt; = 244 nm) prostredí pomocou UV/VIS spektrofotometrie

Vyhodnotenie výsledkov: Obsah zlúčeniny 8e sa stanovil z funkcie priamky (y = a x + b). Po zostrojení kalibračnej krivky a štatistickom vyhodnotení v programe OriginPro ver. 8 SR0 (OriginLab Corporation, Northampton, USA) jednotlivé symboly znamenajú: y = A (absorbancia), b = a0 (úsek na osi y), a = a1 (smernica priamky), x = c. Z týchto vzťahov vyplýva, že koncentrácia sa vypočíta podľa vzťahu: c = (A – a0) / a1.

Stanovenie obsahu látky 8e pomocou RP-HPLC metódy vnútorného štandardu

Použité chemikálie: Metanol UV (Lachema, Brno, ČR), nátriumacetát tavený čistý (Spolana, Neratovice, ČR), vnútorný štandard - kyselina para-metoxyfenyloctová pre syntézu (Merck Chemicals Slovensko, Bratislava, SR).

Prístroje a zariadenia, chromatografické podmienky sú publikované v práci15).

Pracovný postup: Pripravil sa 0,05 % zásobný roztok látky 8e v metanole, z ktorého sa kvantitatívne prenieslo do 25-ml odmerných baniek postupne po 1, 2, 3, 4 a 6 ml, do každej 25-odmernej banky sa pridalo 1,5 ml vnútorného štandardu (0,10% metanolový roztok kyseliny para-metoxyfenyloctovej) a doplnilo sa metanolom po značku19). Pomocou dávkovacieho ventilu sa z takto pripravených roztokov nanášal na kolónu objem 20 μl.

Vyhodnotenie výsledkov: Z pamäti počítača bol vyvolaný záznam analýzy vzorky, integrovali a opísali sa plochy zodpovedajúce analyzovanej látke (P1) a jej vnútornému štandardu (P2). Výsledky analýz sa vypočítali z pomeru plôch píkov P1/P2 (tab. 5).

Tab. 5. Parametre potrebné na zostrojenie kalibračnej krivky pre stanovenie obsahu látky 8e pomocou RP-HPLC
Parametre potrebné na zostrojenie kalibračnej krivky pre stanovenie obsahu látky <i>8e</i> pomocou RP-HPLC
*objem pridaného základného roztoku 8e (0,05 %) **plocha príslušných píkov formovaných látkou 8e (P1) a vnútorným štandardom – kyselinou para-metoxyfenyloctovou (P2)

VÝSLEDKY A DISKUSIA

Syntéza študovanej látky bola publikovaná v práci14), molekula 8e bola pripravená reakciou 2,3-epoxypropán-1-ylesteru kyseliny 3-propoxyfenylkarbámovej (pracovne označený ako Epoxid-33) a bázickej zložky, 1-(3-trifluórmetyl)fenylpiperazínu. Chemická štruktúra analyzovanej zlúčeniny 8e bola potvrdená 1H- ako aj 13C-NMR spektrometriou. V 1H- a 13C-NMR spektrách boli dokázané atómy vodíka a uhlíka meta-propoxysubstituenta, 2-hydroxypropán-1,3-diylového zoskupenia, karbamátovej funkčnej skupiny, piperazín-1,4-diylu, prítomných aromatických jadier spolu s atómom uhlíka trifluórmetylovej skupiny viazanej na N-fenylpiperazínové jadro. V IR spektre hodnotenej molekuly boli identifikované vlnočty zodpovedajúce meta-propoxyskupine, aromatickým kruhom v lipofilnej ako aj v solitvornej časti molekuly, NH-skupine karbamátového zoskupenia, arylalkyléteru ako aj karbonylu. Pás IR spektra valenčnej vibrácie (C=O)-skupiny pri 1728 cm-1 sa môže pri látke 8e využiť pre kvantitatívne hodnotenie.

Schopnosť zlúčeniny absorbovať žiarenie v ultrafialovej a viditeľnej časti spektra závisí predovšetkým od jej elektrónovej štruktúry. Analyzovaná molekula 8e vykazovala v UV/VIS oblasti vo vodnom ako aj v metanolovom prostredí tri absorpčné pásy. Podobne je to aj v prípade nesubstituovaného benzénu, ktorého absorpčné maximá sú pri 184 nm (ε1max = 60 000 m2.mol-1, log ε1max = 4,79), 204 nm (ε2max = 7900 m2.mol-1, log ε2max = 3,90) a 256 nm (ε3max = 200 m2.mol-1, log ε3max = 2,30). Substitúcia auxochrómnymi skupinani na benzénovom kruhu znamená posun jednotlivých maxím smerom k vyšším vlnovým dĺžkam20). Druhý lokálne excitačný pás látky 8e bol vo vodnom prostredí pozorovaný pri 206 nm (λmax; pri 212 nm v metanole), charge-transfer pás (C-T) pri 238 nm (λ2max; pri 244 nm v etanole) a prvý lokálne excitačný pás pri 278 nm (ε3max; pri 282 nm v metanole).

Hmotnostné spektrum je charakteristické pre každú látku a môže byť použité ako „odtlačok palca“ (fingerprint) na jej identifikáciu buď porovnaním s už známym spektrom alebo priamo jeho interpretáciou 21). Analýza MS študovanej zlúčeniny 8e poukázala na existenciu zodpovedajúceho molekulového iónu [M + H+]+, ktorého hodnota m/z = 482,2.

Vypočítaný a experimentálne stanovený percentuálny obsah uhlíka, vodíka a dusíka sa pre látku 8e nelíšil o viac ako ± 0,40 (tab. 2). Z nameraných údajov súčasne nepriamo vyplynulo, že látka 8e bola pripravená ako monochlorid.

Hodnotená zlúčenina 8e je vysokolipofilnou štruktúrou, ktorá je veľmi ťažko rozpustná v destilovanej vode, dobre rozpustná v metanole, mierne rozpustná v liehu 96% a prakticky nerozpustná v chloroforme. Na orientačné hodnotenie jej čistoty bola okrem RP-HPLC použitá adsorpčná chromatografia na tenkej vrstve - delenie látok na adsorpčnom princípe sa uskutočnilo na platniach Silufolu®, vyvíjanie prebiehalo do vzdialenosti 10 cm. Súčasne so slúčeninou 8e bol chromatograficky hodnotený aj medziprodukt syntézy - Epoxid-33. Vo vyvíjacej sústave S (pozri experimentálnu časť) nastalo jednoznačné oddelenie ohraničených škvŕn prislúchajúcich štruktúre 8e (Rf = 0,38) a Epoxidu-33 (Rf = 0,59), pričom na príslušnom „stĺpci“ látky 8e neboli pozorované iné škvrny.

Študovaná molekula 8e má schopnosť výrazným spôsobom znižovať povrchové napätie 15), je teda povrchovoaktívnou látkou (tab. 3).

Hodnotená zlúčenina 8e má mierne kyslý charakter 15), v jej štruktúre je protonizovaný len jeden atóm dusíka piperazín-1,4-diylového skeletu, ktorému prislúcha pKa = 5,21. Tento údaj je vyšší ako sú prvé dve hodnoty disociačných konštánt izoniazid 22) (pKa1 = 2,0; pKa2 = 3,5 a pKa3 = 10,8). Nižšie hodnoty pKa majú aj niektoré iné v praxi používané antimykobakteriálne účinné látky 22) pyrazínamid (pKa = 0,50), kyselina para-aminosalicylová (pKa1 = 1,78; pKa2 = 3,63) alebo etiónamid (pKa = 4,37). Streptomycínu prislúchajú naopak vyššie hodnoty disociačných konštánt22) ako má látka 8e (pKa1 = 7,84; pKa2 = 11,54).

Skelet bunkovej steny jednotlivých mykobaktérií pozostáva, okrem iného, z troch hlavných, navzájom kovalentne pospájaných podjednotiek, ktorými sú arabinogalaktán (AG), peptidoglykán (PGN) a mykolové kyseliny. Kyselina murámová, ako časť PGN, je N-glykolylátovaná (konjugovaná) na kyselinu N-glykolylmurámovú. Najtypickejšou črtou stavby konkrétnej mykobakteriálnej bunkovej steny je však to, že až 60 % jej hmotnosti tvoria lipidy a kyselina mykolová23). Makrolidové, tetracyklínové, fluórchinolónové štruktúry alebo rifamycíny sú vysokolipofilné molekuly, ktoré pravdepodobne využívajú lipidovú dvojvrstvu cez prechod bunkovou stenou mykobaktérií23).

Preto je z hľadiska možného mechanizmu antimykobakteriálneho pôsobenia študovanej látky 8e poznanie miery jej lipofility jedným z kľúčových faktorov. Ako vyplýva z údajov sumarizovaných v tabuľke 3 (log k’, log Pexp), substancia 8e je vysokolipofilnou štruktúrou, ktorej hodnota log Pexp stanovená v systéme oktán-1-ol/TFR je vyššia ako rozdeľovací koeficient izoniazidu24) (-0,64), pyrazínamidu 25) (-1,89), kyseliny para-aminosalicylovej26) (1,01), etiónamidu27) (0,71) alebo vysokohydrofilného streptomycínu 28) ( -8,01).

Pri hodnotení vplyvu UV/VIS žiarenia na vodný a metanolový roztok zlúčeniny 8e bolo zistené, že v priebehu 1 h nedošlo k zmene hodnôt absorbancií pri jednotlivých absorpčných maximách a rovnakom časovom intervale ani k ich posunu.

Pre (prípadné) stanovenie obsahu zlúčeniny 8e v konkrétnej liekovej forme alebo v telových tekutinách možno využiť UV/VIS spektrofotometriu alebo RP-HPLC. Obsah látky 8e bol stanovený spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke druhého absorpčného maxima, teda pri λ2max = 238 nm (pre vodné prostredie), resp. pri λ2max = 244 nm (pre prostredie metanolu).

Na základe získaných údajov bola zostrojená kalibračná krivka, výsledkom stanovenia obsahu látky 8e vo vodnom prostredí (tab. 4) bolo formulovanie regresnej rovnice v tvare: y = 26724(± 372)x + 0,0229 (± 0,0095); R2 = 0,999, F = 5172, n = 5, resp. pre stanovenie obsahu v prostredí metanolu platilo: y = 28526 (± 216)x + 0,0281(± 0,0055); R2 = 0,9998, F = 7412, n = 5.

V uvedených koreláciách parameter y predstavuje absorbanciu, x vyjadruje koncentráciu stanovovanej látky v mol.l-1, F je hodnota F-testu na testovanie štatistických hypotéz (štatistická indukcia), n je počet prípadov.

Pri stanovení obsahu látky 8e pomocou RP-HPLC sa vhodnou mobilnou fázou pre jej delenie ukázal metanol 94 %. Formulovaná regresná rovnica mala nasledujúci tvar: y = 111951(± 519)x – 0,0767(± 0,0728); R2 = 0,994, F = 530, n = 5. Parameter y predstavuje pomer plôch píkov študovanej látky 8e a vnútorného štandardu (kyselina para-metoxyfenyloctová), x vyjadruje koncentráciu stanovovanej látky v mol.l-1.

Experimentálne údaje sumarizované v tejto práci budú v budúcnosti slúžiť ako príspevok pre ďalšie komplexné hodnotenie vzťahov medzi chemickou štruktúrou a biologickou (antimykobakteriálnou) aktivitou (QSAR) v skupine bázických esterov alkoxyfenylkarbámovej kyseliny.

Adresa pro korespondenci:

PharmDr. Ivan Malík, PhD.

Katedra farmaceutickej chémie FaF UK

Odbojárov 10, 832 32 Bratislava, Slovenská republika

e-mail: malik@fpharm.uniba.sk


Zdroje

1. Chou, Y.-H., Hsu, M.-S., Sheng, W.-H., Chang, S.-Ch.: Disseminated Mycobacterium kansasii infection associated with hemophagocytic syndrome. Int. J. Infect. Dis. 2010; 14, 262–264.

2. McGrath, E. E., Anderson, P. B.: The therapeutic approach to non-tuberculous mycobacterial infection of the lung. Pulm. Pharmacol. Ther. 2010; 23, 389–396.

3. McGrath, E. E., Anderson, P. B.: Increased prevalence of non-tuberculous mycobacteria infection. Lancet 2007; 370, 28.

4. Taillard, C., Greub, G., Weber, R., Pfyffer, G. E., Bodmer, T., Zimmerli, S., Frei, R., Bassetti, S., Rohner, P., Piffaretti, J. C., Bernasconi, E., Bille, J., Telenti, A., Prod’hom, G.: Clinical implications of Mycobacterium kansasii species heterogeneity: Swiss National Survey. J. Clin. Microbiol. 2003; 41, 1240–1244.

5. Griffith, D. E., Aksamit, T., Brown-Elliott, B. A., Catanzaro, A., Daley, Ch., Gordin, F., Holland, S. M., Horsburgh, R., Huitt, G., Iademarco, M. F., Iseman, M., Olivier, K., Ruoss, S., von Reyn, C. F., Wallace, Jr., R. J., Winthrop, K.: An official ATS/IDSA statement: Diagnosis and treatment and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2007; 175, 367–416.

6. Campo, R. E., Campo, C. E.: Mycobacterium kansasii disease in patients infected with human immunodefiency virus. Clin. Infect. Dis. 1997; 24, 1233–1238.

7. Arend, S. M., Cerdá de Palou, E., de Haas, P., Janssen, R., Hoeve M. A., Verhard, E. M., Ottenhoff, T. H., van Soolingen, D., van Dissel, J. T.: Pneumonia caused by Mycobacterium kansasii in a series of patients without recognised immune defect. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10, 738–748.

8. Tateishi, Y., Hirayama, Y., Ozeki, Y., Nishiuchi, Y., Yoshimura, M., Kang, J., Shibata, A., Hirata, K., Kitada, S., Maekura, R., Ogura, H., Kobayashi, K., Matsumoto, S.: Virulence of Mycobacterium avium complex strains isolated from immunocompetent patients. Microbial Pathogenesis 2009; 46, 6–12.

9. Shen, M.-Ch., Shin-Jung Lee, S., Huang, T.-S., Liu, Y.-Ch.: Clinical significance of isolation of Mycobacterium avium complex from respiratory specimens. J. Formos. Med. Assoc. 2010; 109, 517–523.

10. Waisser, K., Doležal, R., Čižmárik, J., Malík, I., Kaustová, J.: The antimycobacterial derivatives against potential pathogenic strains: 2-Hydroxy-3-(4-phenylpiperazin-1-yl)-propylphenylcarbamates. Sci. Pharm. 2007; 75, 55–61.

11. Waisser, K., Doležal, R., Čižmárik, J., Malík, I., Kaustová, J.: The potential antituberculotics of the series of 2-hydroxy-2-(4-phenylpiperazin-1-yl)-propylphenyl-carbamates. Folia Pharm. Univ. Carol. 2007; 35–36, 45–48.

12. Ruffolo, R. R., Feuerstein, G. Z.: Pharmacology of carvedilol: rationale for use in ypertension, coronary artery disease, and congestive heart failure. Cardiovasc. Drugs Ther. 1997; 11(Suppl. 1), 247–256.

13. Farthing, M. J. G., Alstead, E. M., Abrams, S. M. L., Haug, G., Johnston, A., Hermann, R., Niebch, G., Ruus, P., Molz, K. H., Turner, P.: Pharmacokinetics of naftopidil, a ovel antihypertensive drug, in patients with hepatic dysfunction. Postgrad. Med. J. 1994; 70, 363–366.

14. Malík, I., Sedlárová, E., Csöllei, J., Andriamainty, F., Kurfürst, P., Vančo, J.: Synthesis, spectral description, and lipophilicity parameters determination of henylcarbamic acid derivatives with integrated N‑phenylpiperazine moiety in the structure. Chem. pap. 2006; 60, 42–47.

15. Malík, I., Sedlárová, E., Čižmárik, J., Andriamainty, F., Csöllei, J.: Štúdium fyzikálno-chemických vlastností derivátov kyseliny 2-, 3-, 4-alkoxyfenylkarbámovej s ázickou časťou tvorenou substituovaným N-fenylpiperazínom. Čes. slov. Farm. 2005; 54, 235–239.

16. European Pharmacopoeia, 6th Ed. European Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare (EDQM), Council of Europe, Strasbourg: Druckerei C.H. Beck 2007; s. 5.

17. Sedlárová, E., Malík, I., Andriamainty, F., Kečkéšová, S., Csöllei, J.: Štúdium lipofility derivátov kyseliny fenylkarbámovej s bázickou časťou tvorenou substituovaným N-fenylpiperazínom. Farm. Obzor 2007; 74, 86–90.

18. Malík, I., Andriamainty, F., Sedlárová, E., Čižmárik, J., Gališinová, J., Mokrý, P., Csöllei, J., Karlovská, J., Lukáč, M.: Analytické hodnotenie mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2-hydroxypro- pyl}-izopropylamónium]fumarátu. Čes. slov. Farm. 2011; 60, 84–93.

19. Sedlárová, E., Malík, I., Csöllei, J., Andriamainty, F.: Analytické hodnotenie 1-(4-fluórfenyl)-4-[3-(3-propoxyfenylkarbamoyloxy)-2-hydroxypropyl]piperazíniumchloridu (látka 6f). Čes. slov. Farm. 2005; 54, 270–274.

20. Silverstein, R. M., Webster, F. X., Kiemle, D. J.: Spectrometric Identification of Organic Compounds. 7th Ed. New York, London, Sydney, Toronto: John Wiley and Sons 2005; 512 s.

21. Herbert, Ch. G., Johnstone, R. A. W.: Mass Spectrometry Basics. Boca Raton, London, New York, Washington: CRC Press 2003; 474 s.

22. Lemke, T. L., Williams, D. A., Roche, V. F., Zito, S. W.: Foye’s Principles of Medicinal Chemistry. 6th Ed. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins, a Wolters Kluwer business 2008; 1377 s.

23. Liu, J., Barry, C. E., Nikaido, H.: Cell wall: physical structure and permeability. In: Ratledge, C., Dale, J. eds. Mycobacteria, molecular biology and virulence. Oxford: Blackwell Science 1992.

24. TB Alliance: Isoniazid. Tuberculosis 2008; 88, 112–116.

25. TB Alliance: Pyrazinamide. Tuberculosis 2008; 88, 141–144.

26. TB Alliance: Para-aminosalicylic acid. Tuberculosis 2008; 88, 137–138.

27. TB Alliance: Ethionamide. Tuberculosis 2008; 88, 106–108.

28. TB Alliance.: Streptomycin. Tuberculosis 2008; 88, 162–163.

Štítky
Farmacie Farmakologie

Článek vyšel v časopise

Česká a slovenská farmacie

Číslo 6

2011 Číslo 6

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Příběh jedlé sody
nový kurz
Autoři: MUDr. Ladislav Korábek, CSc., MBA

Krvácení v důsledku portální hypertenze při jaterní cirhóze – od pohledu záchranné služby až po závěrečný hepato-gastroenterologický pohled
Autoři: PhDr. Petr Jaššo, MBA, MUDr. Hynek Fiala, Ph.D., prof. MUDr. Radan Brůha, CSc., MUDr. Tomáš Fejfar, Ph.D., MUDr. David Astapenko, Ph.D., prof. MUDr. Vladimír Černý, Ph.D.

Rozšíření možností lokální terapie atopické dermatitidy v ordinaci praktického lékaře či alergologa
Autoři: MUDr. Nina Benáková, Ph.D.

Léčba bolesti v ordinaci praktického lékaře
Autoři: MUDr. PhDr. Zdeňka Nováková, Ph.D.

Revmatoidní artritida: včas a k cíli
Autoři: MUDr. Heřman Mann

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se