Možnosti a význam testování ALK u nemalobuněčného karcinomu plic

Gen ALK a jeho produkt

Gen pro kinázu anaplastického lymfomu (ALK) se nachází na krátkém raménku chromozomu 2. Kináza ALK patří do skupiny receptorových tyrosinkináz. O její fyziologické funkci je toho zatím známo málo. Předpokládá se, že ligandem receptoru, jehož je intracelulární podjednotkou, mohou být růstové faktory nervové tkáně a že fyziologická role ALK spočívá v neurogenezi a vývoji nervové tkáně.

Po aktivaci ALK je popsáno šíření signálu intracelulárně, a to prostřednictvím aktivace drah PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPK i JAK/STAT. Tyto aktivity jsou velmi podobné dějům, které nastávají pro aktivaci receptoru pro epidermální růstový faktor (EGFR) a mohou mít onkogenní potenciál.

Abnormality ALK u nemalobuněčného karcinomu plic

Nejčastější abnormalita genu ALK je následkem translokace, která vzniká na podkladě inverze krátkého raménka chromozomu 2. Touto translokací se k sobě přiblíží geny ALK a EML4 za vzniku fúzního genu, jehož produktem je trvale aktivovaná ALK bez nutnosti vazby ligandu. Četnost abnormalit ALK je u pacientů s NSCLC velmi variabilní, pozitivita je nacházena spíše u mladších nemocných a nesouvisí s kouřením. Z hlediska histologického je typičtější pro adenokarcinomy, u dlaždicobuněčných karcinomů je vzácná. Objevuje se přibližně u 2−7 % nedlaždicobuněčných NSCLC.

ALK jako prediktivní biomarker

Klinické studie shodně popisují 60−70% míru odpovědi na léčbu anti-ALK inhibitory tyrosinkináz hodnocenou dle kritérií RECIST u pacientů s NSCLC a potvrzenou přítomností fúzního genu ALK.

Testování ALK u NSCLC

Většina guidelines doporučuje vyšetřit status ALK u všech pacientů s adenokarcinomem (včetně kuřáků) a u dlaždicobuněčných karcinomů pacientů nekuřáků nebo dřívějších kuřáků, kteří přestali kouřit před dlouhou dobou. Vzorkem k vyšetření může být materiál získaný biopsií, cytologický materiál nebo chirurgicky resekovaný tumor.

Anti-ALK inhibitor tyrosinkináz krizotinib je aktuálně doporučován v 1. linii léčby a také u již předléčených nemocných s NSCLC a pozitivitou abnormality ALK nebo ROS1. Genetické vyšetření by mělo být provedeno před zahájením léčby laboratoří se zavedenou dobře validovanou a robustní metodikou, aby se předešlo výskytu falešně negativních/pozitivních výsledků.

Metodologie testování ALK

FISH a CISH

Metodou považovanou stále za zlatý standard je fluorescenční in situ hybridizace (FISH) s využitím dvoubarevných sond. Jde o postup finančně nákladný a relativně zdlouhavý, který vyžaduje zkušené pracovníky a fluorescenční mikroskop. Často je také problematické vlastní vyhodnocení výsledku. Metoda ovšem vyžaduje relativně malé množství nádorových buněk. Chromogenní in situ hybridizace (CISH) je pro ALK rovněž k dispozici. Výhodou je použití klasického světelného mikroskopu, ale jinak je s tímto postupem zatím jen málo zkušeností.

PCR

Pomocí PCR je možné detekovat mRNA fúzního genu. Senzitivita a specificita této metody významně záleží na návrhu primerů a také na kvalitě dostupné RNA. Obvyklým zdrojem jsou parafínové bločky vzorků fixovaných formaldehydem, ve kterých dochází k degradaci dlouhých RNA. Popisuje se, že až 30 % vzorků je nevyhovujících pro PCR detekci. Metoda je však široce dostupná a pouze průměrně nákladná.  

Sekvenování nové generace (NGS)

Pomocí NGS je možno detekovat a identifikovat fúzní geny na úrovni DNA. Metoda je již nyní celkem běžná ve výzkumu, v klinických podmínkách ovšem tak rozšířená není. Důležitým aspektem je kvalita a kvantita DNA získané ze vzorku.

Imunohistochemické barvení (IHC)

Abnormality genu ALK jsou spojeny s mírným zvýšením proteinu ALK v nádorových buňkách, a proto může dobře posloužit i imunohistochemie s využitím anti-ALK protilátky. Jde o rychlou, běžnou a méně nákladnou metodu, kterou již laboratoře využívají k předvýběru vzorků s podezřením na pozitivitu přeuspořádání ALK. Postupně dochází k tomu, že v Evropě a Asii začínají regulační autority považovat IHC za dostatečnou, zatímco ve Spojených státech amerických je stále vyžadováno potvrzení FISH. Velmi důležité je správné nastavení vyhodnocení výsledků IHC, aby byla zaznamenána i mírná zvýšení ALK. Postačuje však i malé množství nádorových buněk.

Diskuse se vede nad diskrepancí ve výsledcích. Většina takovýchto výsledků je způsobena technickými faktory, méně než 5 % pak má biologickou příčinu. U plicních neuroendokrinních tumorů se vyskytuje FISH-pozitivní IHC-negativní fenotyp. Byly také již popsány případy, kdy nádor IHC-pozitivní FISH-negativní reagoval na léčbu anti-ALK terapií a naopak FISH-pozitivní IHC-negativní nádor reagoval méně. Vzhledem k existenci řady posttranskripčních regulací exprese genu a také vzhledem k tomu, že onkogenní funkci vykazuje právě až výsledný protein, dávají tyto výsledky smysl a poukazují na velký význam testování pomocí IHC.

Závěr

Testování ALK má u NSCLC značný význam vzhledem k volbě vhodné terapie. Je však třeba dalších informací k výběru nejvhodnější metody testování, která bude mít optimální senzitivitu a specificitu, únosné náklady a přijatelné nároky na čas a personál.

(jam)

Zdroje:

1. Kerr K. ALK in lung cancer: ESMO biomarker factsheet. OncologyPRO 2015 Aug. Dostupné na: http://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/ALK-in-Lung-Cancer
2. SPC Xalkori. Dostupné na: www.sukl.cz