Všechny buňky lidského těla do jisté míry vylučují do systémové cirkulace DNA označovanou jako cfDNA (cell-free DNA). Zvýšené množství cfDNA v plazmě bylo popsáno u řady patologických stavů, např. u renálního selhání, infarktu myokardu i u nádorových onemocnění. DNA pocházející z nádorových buněk je označována jako ctDNA (circulating tumor DNA). Od ostatní cfDNA se odlišuje přítomností specifických somatických mutací. Abundantní je u hematologických malignit, u solidních nádorů však tvoří jen velmi malou frakci cfDNA, často méně než 1 %, ale narůstá s rozsahem onemocnění. Při využití správných nástrojů ovšem může i malé množství ctDNA přinést mnoho důležitých informací.
ctDNA je do cirkulace vylučována různými mechanismy, kterým dosud v úplnosti nerozumíme. Může být secernována volná nebo uschovaná v exosomech, mohou ji vylučovat samotné nádorové buňky za svého života nebo při svém zániku apoptózou i nekrózou, případně může být vylučována fagocyty poté, co nádorovou buňku pozřou.
Protože ctDNA tvoří jen malý podíl celkové cfDNA, je k její analýze potřeba využít dostatečně citlivé techniky. Mezi nejpoužívanější patří sekvenování nové generace (NGS) a digitální polymerázová řetězová reakce (dPCR). Vyšetření založená na NGS mohou být zaměřena buď na konkrétní panel genů, nebo mohou popsat situaci v celém exomu či genomu podobně jako při vyšetřování tkáňové DNA. Techniky dPCR zase využívají různé metody separace replikovaných molekul, např. BEAMing dPCR nebo kapkovou dPCR, aby bylo možné identifikovat i velmi nízce zastoupené cíle.
Techniky PCR jsou spojené s vysokou senzitivitou a specificitou, na druhou stranu je ovšem možné v určitý čas analyzovat jen omezené množství mutací. Ke screeningu velkého množství mutací zároveň jsou vhodnější metody založené na NGS. Ve vývoji jsou potom metody analýzy ctDNA kombinující výhody obou technik. I díky tomu je ctDNA stále více v popředí zájmu klinického výzkumu.
Na kongresu Evropské společnosti pro klinickou onkologii (ESMO), který se konal na přelomu září a října v Barceloně, bylo prezentováno několik zajímavých studií tekuté biopsie u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC).
Japonští lékaři se na vzorku 270 pacientů s NSCLC z celého Japonska pokusili srovnat využitelnost NGS pro analýzu cfDNA s analýzou tkáňové DNA. Onkogenní driver mutace byla z některého vzorku identifikována u 58 % pacientů. Při porovnání cfDNA s kontrolním vzorkem tkáňové DNA byla celková míra shodného výsledku 75 % (např. pro EGFR, KRAS, BRAF), avšak specificky pro fúze genů to bylo jen 24 % (např. pro ALK, RET), a pro fúzi genu ROS1 dokonce 0 %. Ze 132 pacientů, u kterých se driver mutaci nepodařilo identifikovat z tkáně nádoru, se to v 17 případech podařilo z cfDNA.
Studie dále pokračuje a bude zajímavé, jak budou vypadat finální výsledky. Zatím autoři navrhují, aby byla analýza cfDNA použita v situaci, kdy tkáňová DNA nepřinesla žádoucí informaci o driver mutaci.
Analýzu cfDNA/ctDNA by bylo možné využít také k identifikaci mutací EGFR získaných během anti-EGFR léčby pomocí inhibitorů tyrosinkináz a k monitorování průběhu protinádorové léčby. Čínští lékaři ji provedli u 129 pacientů s NSCLC, u kterých byla z nádorové tkáně prokázána přítomnost mutace EGFR. Před nasazením anti-EGFR inhibitorů tyrosinkináz, v průběhu léčby a po jejím skončení byly odebrány vzorky krve a byla izolována cfDNA. Vyšetřován byl panel mutací EGFR pomocí PCR. Mutace v EGFR se potvrdila u 74 % vzorků na počátku studie. Mutace T790M spojená se sekundární rezistencí se v průběhu léčby objevila u 24 % pacientů. Molekulární progrese vyjádřená předem definovanou změnou mutační nálože EGFR byla popsána průměrně 42 dní před progresí klinickou a měla velmi dobrou pozitivní i negativní prediktivní hodnotu. Autoři tak doporučují validovat v dalších studiích opakovaná vyšetřování mutačního statusu EGFR za účelem monitorování onemocnění.
DNA je vylučována nejen do krve, ale i do jiných tělních tekutin. Na srovnání ctDNA v krevní plazmě a ve sputu se zaměřili vědci a lékaři z Rakouska. Pomocí kapkové dPCR hledali delece v exonu 19 (del19) a mutace L858R a T790M v genu EGFR u 23 pacientů s NSCLC. Výsledky z krve a sputa měly vysokou míru konkordance pro mutace L858R a T790M, u del19 byly výsledky horší. Také sputum by tedy mohlo být cenným nositelem informací o změnách genomu buněk karcinomu plic v průběhu cílené léčby.
Možnosti využití molekulárně biologických metod v klinické praxi rapidně přibývají. Co bylo před 5 lety běžné jen v univerzitních laboratořích nebo ve výzkumných institutech, se dnes přesouvá do laboratoří velkých nemocnic. Je tedy možné, že se relativně brzo dočkáme i využití tekuté biopsie v péči o onkologické pacienty s NSCLC, ať už v diagnostice nebo během monitorování jejich léčby.
(jam)
Zdroje:
