Ultrastruktural diagnosis of hypertrophic kardiomyopathy with β-aktin mutation in sudden death – case report
Introduction: Light microscopy and electron microscopy rank among methods to diagnose of cardiomyopathy in forensic medicine, and, recently, the methods of molecular biology.
Methods: Investigation of 27 year old man who collapsed on his way to work. The Rescuers did not succeed resuscitation of vital function. Samples were H-E stained and processed for the electron microscopy. RNA was isolated from the tissue for the alpha, beta, gama actine primer investigation.
Results: By H-E staining we proved irregular hypertrophic cardiomyocytes (disarray) with the links and loci patches of thin fibrosis. Ultrastructurally we diagnosed a disarray of Z-bands, accumulation of mitochondria, rectangular nuclei of cardiomyocytes. We have detected rare plasmocytes and leucocytes with specific granules in cytoplasma. In the electronogrames we can see myofibriles oriented longitudinally and transversally. A genetic examination demonstrated beta actin mutation.
Conclusion: Cardiomyopathy can be a cause of sudden and unexpected death in young individuals and its diagnostics requires an interdisciplinary collaboration.
Keywords: Sudden and unexpected death – hypertrophic cardiomyopathy – ultrastructure of cardiomyocyte – gene mutation.
Autoři: Vajtr David 1; Staněk Libor 2; Dogoši Marek 1; Benada Oldřich 3; Strejc Přemysl 1; Dundr Pavel 2 Působiště autorů: Ústav soudního lékařství a toxikologie 1. LFUK a VFN 1; Ústav patologie 1. LFUK a VFN 2; AVČR, Laboratoř elektronové mikroskopie 3 Vyšlo v časopise: Soud Lék., 59, 2014, No. 2, p. 17-19 Kategorie: Původní práce
Úvod: Do diagnostiky kardiomyopatií ve forenzní medicíně patří metody světelné i elektronové mikroskopie a v současné době i metody molekulární biologie.
Případ: Vyšetření myokardu u 27-letého muž, který zkolaboval při cestě do práce, přivolané RZS se nepodařilo obnovit vitální funkce.
Výsledky: Světelnou a elektronovou mikroskopií byly prokázány změny svědčící pro kardiomyopatii (nepravidelně probíhající hypertrofické kardiomyocyty, ultrastrukturálně neuspořádanost Z proužků, zmnožení mitochondrií, myofibrily probíhající longitudinálně i transverzálně). Genetické vyšetření prokázalo mutaci beta-aktinu.
Závěr: Kardiomyopatie může být příčinou náhlého úmrtí u mladých jedinců a její diagnostika vyžaduje interdisciplinární spolupráci.
Klíčová slova: náhlé úmrtí – hypertrofická kardiomyopatie – ultrastruktura kardiomyocytu – genové mutace
Hypertrofická kardiomyopatie (HKM) je často příčinou náhlé smrti v mladém věku (rizikovým faktorem je věk 10-35 roků). Náhlá smrt probíhá pod obrazem arytmie (fibrilace komor, komorové tachykardie). K úmrtí dochází v 60 % případů při lehké námaze nebo v klidu, ve 40% při sportu a výrazné námaze (1,2). Maron BJ a spolupracovníci popsali náhlá úmrtí sportovců (basketbalistů, hráčů amerického fotbalu) zapříčiněné selháním oběhu u HKM (3). Při autoptickém vyšetření (1) se popisuje asysmetrická subvalvulární hypertrofie komorového septa, lokalizována v bazální (subaortální) části, jizvení myokardu a bělavé ztluštění (fibrosa) endokardu (asi ve 30% případů). Při obstrukční kardiomyopatii (tvoří 25-30% případů) zbytnělá svalovina zužuje výtokovou část levé komory. V 70-75% případů jsou hypertrofické kardiomyopatie (HKM) neobstrukční (4,5).
Hypertrofická HKM je genetické onemocnění na podkladě více než 400 mutací ve 14 genech. Mezi nejčastější patří mutace genu MYH7 těžkého řetězce beta-myosinu v 20-25%, myosinového vazebného proteinu C MYBPC3 v 15-20% a srdečního troponinu T a I a alfa-aktinu v 1% (6,7)
Vzorky tkáně myokardu pravé i levé komory srdeční (u 27 letého muže, který zkolaboval při cestě do práce a přivolané RZS se nepodařilo obnovit vitální funkce) byly při pitvě odebrány a fixovány ve formaldehydu, následně barveny hematoxilinem-eosinem. Z vybraných parafinových bločků byly odebrány části tkáně pro elektronmikroskopické vyšetření. Tkáně byly přefixovány v 3% glutaraldehydu v cacodylatovém pufru a postfixovány v 2% osmium tetroxidu. Ultratenké řezy byly vyšetřeny na přístroji Philips CM100 (FEI, formerly Philips EO, the Netherlands), elektronogramy byly zhotoveny digitálně MegaViewII skanovací kamerou a zpracovány v programu Analysis 3.2 Pro software.
Ze vzorku tkáně myokardu byla izolována RNA (RNeasy® Mini Kit; Qiagene), následně byla provedena PCR reverzní transkripce (RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit; Fermentas). Zamražená cDNA byla následně amplifikována pomocí PCR za použití primerů (tab. 1) pro β–aktin, γ-aktin, a primeru pro aktin hladkých svalových vláken α-SMA (Proligo; Sigma), s detekcí na agarozovém gelu (Bio Basic Inc.) po proběhlé elektroforéze. Jako kontrola byla použita izolovaná ribonukleová kyselina z dělohy.
Tab. 1. Použité primery pro β–aktin, γ-aktin, a primer pro aktin hladkých svalových vláken α-SMA.
Zevní prohlídkou těla zemřelého muže byly zjištěny drobné úrazové změny obličeje a pravé ruky (oděrky a krevní výrony mající známky vitální reakce). Při pitvě byl dominantní patomorfologický nález excentrické hypertrofie myokardu, hmotnost srdce 670 g. V levé komoře srdeční ve výtokovém traktu byla zjištěna fibrosa endokardu. Světelnou mikroskopií barvením H-E jsme prokázali nepravidelně probíhající hypertrofické kardiomyocyty (disarray) se spojkami a ložiska řídké dispersní myofibrozy v levé komoře srdeční (obr.1). Metodou elektronové mikroskopie jsme na ultrastrukturální úrovni diagnostikovali neuspořádanost Z proužků, zmnožení mitochondrií, byla pozorovaná obdélníkovitá jádra kardiomyocytů. Na elektronogramech byly patrné myofibrily probíhající longitudinálně i transverzálně (obr.2 -3). Nacházeli jsme i ojedinělé plazmocyty a polymorfonukleární leukocyty se specifickými granuly v cytoplazmě perivaskulárně.
Obr. 1. Hypertofie a disarray kardiomyocytů v levé komoře srdeční, v centrální části jsou patrná ložiska intersticiální myofibrosy, barvení H-E, zvětšení 400x.
Obr. 2. Transverzálně probíhající myofibrily (T), různě denzí oblasti sarkomery s myosinovými filamenty a světlejší oblasti aktinových filament v longitudinálně probíhajících myofibrilách (L). V okolí myofibril nacházíme mitochondrie (M) s kristami (elektronogram, zvětšení 10 000x).
Obr. 3. Neuspořádané Z-proužky, sarkomera bez příčného pruhování, setřelá ultrastruktura Z-disků (šipka), I-proužků. (elektronogram, zvětšení 15 000x).
Genetické vyšetření na detekci bodových mutací β–aktinu, γ-aktinu a α-SMA při použití kontrolního vzorku izolované RNA z dělohy (obr. 4). Ve vzorku pacienta s HKM (obr.5) jsme identifikovali přestavbu DNA (bodovou mutaci) genu pro β-aktin (u kontroly nemutovaný homozygot tvoří velice silný bend na polyklonální pozadí 332 bp). U γ-aktinu (možnost heterozygotnosti) a α-SMA nebyla prokázána genetická abnormalita.
Obr. 4. Genetické vyšetření změn s výstupem na gelu po elektroforéze. U kontrolního vzorku izolované RNA z dělohy byly diagnostikovány PCR produkty genu pro alpha, beta (šipka v oblasti PCR produktu 332 bp beta aktinu) a gama-aktin.
Obr. 5. Genetické vyšetření změn s výstupem na gelu po elektroforéze. U pacienta byly ve vzorku izolované RNA diagnostikovány PCR produkty genu pro alpha a gama-aktin. PCR produkt genu pro beta aktin není přítomen (šipka v oblasti PCR produktu 332 bp beta aktinu), hvězdičkou označena absence bendu beta aktinu, je diagnostikována přestavba (bodová mutace) genu pro β-aktin.
Forenzní význam HKM vyplývá z konsekvencí a okolností náhlé srdeční smrti. Ke smrti maligní arytmií může dojít v různých situacích, kupř.při sportovních aktivitách, u účastníka silničního provozu nebo v zaměstnání s dalšími následky (pracovní úraz, dopravní nehoda apod.). Etiologii úrazových změn na těle, zejména u osob do 40-ti let věku je nutné vyloučit kraniotrauma při nálezu oděrek a krevních výronů na hlavě, pak lze vysvětlit pádem umírajícího při maligní arytmii. Autoptický nález zbytnění srdce (hmotnost 500-800 g) je společná patognostická markanta u HKM mladých osob. Bělavé ztluštění (fibrosa) endokardu, subvalvulární hypertrofie svaloviny levé komory a mikroskopický průkaz proplétajících se snopců svalových vláken (disarray) jsou základními znaky diagnostiky hypertrofické kardiomyopatie (1).
V naší kazuistice jsme použili pro průkaz kardiomyopatie metodu disekce vzorku tkáně z myokardu již zalitého do parafinových bločků a následného zpracování pro elektronovou mikroskopii. Kvalita elektronogramů byla ovlivněna již primárně počínající autolýzou myokardu nastupující od úmrtí do pitvy zemřelého a sekundárně fixací paraformaldehydem. Naše data jsme srovnávali s elektronogramy ostatních autorů (1,2,5). Identifikovali jsme základní markanty HKM (longitudinální i transversální myofibrily, neuspořádanost Z-proužků i zmnožení mitochondrií). Podařilo se nám získat data o ultrastruktuře kardiomyocytů, jejichž vypovídací hodnota byla pro potřeby forenzní diagnostiky dostačující. Metodou molekulární genetiky jsme prokázali mutaci β-aktinu. Bodová mutace v oblasti nasednutí primerů na cDNA je příčinou absence PCR produktu genu pro beta-aktin ve srovnání s kontrolním vzorkem. Důsledkem této bodové mutaci může dojít k nedostatečné tvorbě kontraktilní síly, následně ke snížení aktivity aktin-myozinové ATPázy a následnému rozvolnění aktinu a myozinu. V současnosti je zvažované genetické vyšetření u náhlých úmrtí mladých osob kde jako možná etiologie náhlé srdeční smrti přichází v úvahu syndrom long-QT (8).
Adresa pro korespondenci:
As. MUDr. David Vajtr, Ph.D.
Ústav soudního lékařství a toxikologie, 1. LF UK a VFN v Praze
Studničkova 4, 128 00 Praha 2
tel.: 224968603
e-mail: Vajtr777@seznam.cz
1. Šteiner I. Patologie hypertrofické kardiomyopatie. Kardiofórum 2008; 6(2): 9-16.
2. Maron BJ, Fananapazir L. Sudden cardiac death in hypertrophic cardiomyopathy. Circulation 1992; 85(1 Suppl): 157-163.
3. Maron BJ, Roberts WC, McAllister HA, Rosing DR, Epstein SE. Sudden death in young athletes. Circulation 1980; 62(2): 218-229.
4. Elliott P, McKenna WJ. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet 2004; 363 : 1881-1891.
5. Hughes SE. The pathology of hypertrophic cardiomyopathy. Histopathology 2004; 44(5): 412 - 427.
6. Tomašov P. Genetika hypertrofické kardiomyopatie. Kardiofórum 2008; 6 : 5-8.
7. Veselka J, et al. Hypertrofická kardiomyopatie a příbuzná témata. Galén, 2006. ISBN: 80-7262-443-1.
8. Zeman M, Sepši M, Vojtíšek T, Šindler M. Suddenly deceased young individuals autopsied at the Department of forensic medicine, Brno – analysis. Soud Lek 2012; 57(3): 44-47.
Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova
Nemáte účet? Registrujte se
Zadejte e-mailovou adresu, se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.
