Ovládání (úpravy) genomu na dosah anebo již v našich rukou?

Control (editing) of the genome within reach, or already in our hands?

Although different genome editing tools have been around for decades, the recent emergence of cheap, quick, and accessible CRISPR/Cas9 technology has led to a revolution in this field. The technique has the potential to transform medicine from curative into preventive using a gene therapy. An application of genome editing has proven to be effective for both genetic and non-genetic (e.g. infectious) diseases. However, cancer and rare diseases treatment is at the forefront of interest. Concurrently, the legal and ethical frameworks should be discussed, especially as the technology moves towards a modification of the germ cells or embryos. In addition to a precise molecular genetic diagnosis and choosing the best gene therapy approach for a particular individual, an attention should also be paid to the impacts on the entire human population and the next generations. In this review, we summarize the most important applications of CRISPR/Cas9 technology in the field of medicine. Some interesting results from recent years are presented in the context of used approaches and importance for the future developments in medicine. Finally, ethical and legal conditions in relation to different gene editing applications are discussed.

Keywords:
genome editing, gene drive, gene therapy, CRISPR/Cas9

Autoři: Radim Brdička ¹; Radoslav Omelka ²
Působiště autorů: GHC Genetics, s. r. o., Praha ¹; Katedra botaniky a genetiky, Fakulta prírodných vied, Univerzita Konštantína Filozofa v Nitre, SR ²
Vyšlo v časopise: Čas. Lék. čes. 2018; 157: 79-83
Kategorie: Přehledový článek

Souhrn

V posledních letech se zřejmě odehrává revoluce v možnostech úprav nejrůznějších genomů, včetně lidského, a jako nejúspěšnější se ukazuje metoda označovaná CRISPR/Cas9. Její použití odhalilo mnoho dříve neznámých způsobů chování informací vyjádřených v nukleových kyselinách, a to nejen v jejich změnách, ale i způsobech jejich šíření. Současně ukázalo i způsoby ovládání těchto procesů, což nabízí nebývalé možnosti jejich využití v lékařství. Pochopitelně upozornilo na případné zneužívání a na nezbytnost vytvoření potřebného etického, ale především právního rámce.

Klíčová slova:
editace genomu, genový drive, genová terapie, CRISPR/Cas9

ROZMACH GENOVÉHO INŽENÝRSTVÍ

V posledních několika letech se genová terapie konečně dočkala slibných výsledků, opět s pomocí výsledků výzkumu bakterií a fágů. Podobně jako před mnoha lety, kdy DNA diagnostika začala používat bakteriální enzymy štěpící cílovou DNA na základě specifických sekvencí spadajících do polymorfismů typu RFLP (restriction fragment length polymorphism), se i současný pokrok opírá o procesy používané bakteriemi v ochraně před fágy. Štěpné fragmenty DNA vznikající působením bakteriálních restriktáz umožnily sledovat přenos vybraných úseků DNA z generace na generaci, a tak došlo k prvnímu široce používanému úspěšnému kroku molekulární DNA diagnostiky. V případě blízkosti takového polymorfismu některé z patogenních mutací bylo možné sledovat i její přenos a použití této metody způsobilo rozvoj a vznik průmyslu vyrábějícího stále nové „restriktázy“. Bohužel ne vždy byla konstelace podmínek pro stanovení diagnózy příznivá (nenašel se vhodný polymorfimus ani odpovídající restriktáza), někdy dokonce proto, že některý z příbuzných se odmítl nechat vyšetřit.

Mnohem úspěšnější v DNA diagnostice byla později polymerázová řetězová reakce (PCR), která ani dnes neztratila svůj význam a účinnost. I ta využívá bakteriální enzymy, tentokrát k syntéze; snad nejznámějším je termostabilní polymeráza izolovaná původně z kmene Thermus aquaticus. V případě PCR je k výběru cílového místa v sekvenci analyzované DNA použit krátký „fragment“, obvykle synteticky připravený, o přibližně 20 nukleotidech, schopný specificky hybridizovat (připojit se) k cílovému úseku DNA a stát se „očkem“ od kterého svou činnost začne příslušná polymeráza.

Metoda CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) opět vychází z nálezů u bakterií a opět využívá analogie s jejich obranným systémem proti fágové infekci. Má také své méně výkonné a pracnější předchůdce TALENs (transcription activator-like effector nucleases) a ZFNs (zinc-finger nucleases) (1). Zatímco nejstarší z uvedených metod ZFNs potřebovala dobu cca 1 roku, aby dosáhla cíle, v případě TALENs to byly týdny až měsíce a metodě CRISPR stačí pár dnů.

Metoda CRISPR je založená na rozštěpení dvojřetězcové molekuly DNA a následné opravě spojením volných konců po vynětí nebo vložení krátkého úseku DNA do vzniklé mezery (obr. 1). Pokud se tak stane v rámci funkční sekvence DNA, dojde k ztrátě funkce. Tento proces může být použit i k výměně příslušného úseku za nový, který se od původního liší třeba jen jedním nukleotidem; pak dojde k analogii přirozené rekombinace. Na cílové místo je tento proces nasměrován guide RNA (gRNA), která je k němu komplementární. Jedinou nevýhodou „klasického“ systému CRISPR/Cas9 je, že vkládá, ztrácí nebo vyměňuje vždy úsek DNA, nikoliv jednotlivé nukleotidy. Tuto nevýhodu se však již podařilo odstranit systémem ABEs (7. generace – ABE7.10) (2). „Klasickou“ metodu CRISPR se stále daří vylepšovat, především její specificitu snížením tzv. off-target (mimocílového) působení (3).

U člověka, který není vystaven nadměrnému působení mutagenů, se předpokládá spontánní vznik mutací s frekvencí 10⁻⁶ na buňku a generaci. Předpokládaný počet genů kódujících bílkoviny u člověka je zhruba 20 tisíc, ty ale představují jen něco kolem 1,5 % genomu. Z celého zbytku lidského genomu je transkribováno zhruba 75 %, obsahujících téměř 16 tisíc genů pro lncRNA a 7500 pro sncRNA, kódujících většinou regulační RNA.

Při tom je třeba si uvědomit, že prakticky každý mnohobuněčný eukaryot je vysoce chimérický organismus, tj. skládající se z buněk, které mohou obsahovat i mutace, k nimž došlo během jeho individuálního vývoje. Mutace, které se nacházejí v tělních buňkách, nemohou být předány dalším generacím (to samozřejmě platí pouze u organismů, jež nemají schopnost nepohlavního rozmnožování). Nicméně tyto mutace mohou mít pro život jedince zásadní význam. Tomuto problému se věnuje Consortium GTEx (Genotype-Tissue Expression), které porovnávalo genovou expresi ve 44 lidských tkáních v závislosti na genotypu a potvrdilo u většiny testovaných genů zjevnou variabilitu (4).

Směrů výzkumu, jimiž se editace genomu ubírá, je velice mnoho a jejich přehled by se hodil spíše do časopisu s obecně biologickým zaměřením. V tomto sdělení se soustředíme na lékařskou problematiku a můžeme uvést tři hlavní směry (obr. 2).

**Obr. 1. Mechanismus úpravy genomu pomocí CRISPR/Cas9:**

a) Cílový úsek genomové DNA určený k editaci je rozpoznaný pomocí gRNA, především její koncovou 20 nukleotidovou sekvencí. Tato gRNA se v buněčném jádru spojí s cílovou DNA a proteinem Cas9, který štěpí oba dva řetězce cílové DNA.

b) Rozštěpené místo se buňka snaží opravit pomocí opravných mechanismů, při němž vznikají náhodné mutace typu krátkých inzercí a delecí (tzv. INDELs). Při tomto typu mutací dochází většinou k porušení funkce genu, jenž se nachází v místě cílové sekvence DNA. Uvedený mechanismus se proto využívá při výzkumu funkcí genů a tvorbě tzv. knock-outovaných buněk.

c) Pokud se při štěpení cílové genomové DNA nachází v její v blízkosti jiná, do buňky záměrně vložená exogenní DNA (například ve formě plazmidu), která je po okrajích ohraničená homologickými sekvencemi k štěpené cílové DNA, buňka ji využije na opravu rozštěpeného místa. Exogenní DNA se vsune do vyštěpeného místa. Tento postup se úspěšně využívá pro vkládání genů na předem určené místo v genomu (tzv. knockin) nebo nahrazení nefunkční verze funkční verzí genu v rámci genové terapie.

**Obr. 2. Možnosti aplikace technologie CRISPR/Cas9 a využívané metodické postupy:**

a) K uskutečnění technologie CRISPR/Cas9 je potřebné k editované cílové DNA doručit protein Cas9 a gRNA (postačují k vyřazení funkce cílového genu) a v případě opravy genu je nutné do buňky dodat také exogenní DNA. Cas9 a gRNA se do buňky aplikují buď přímo ve formě proteinu s RNA, nebo ve formě vektorové molekuly (genového konstruktu, například plazmidu), který obsahuje jen genetickou informaci pro syntézu Cas9 a gRNA. V tomto případe se samotný protein Cas9 s gRNA syntetizují až v cílové buňce.

b) Vhodný způsob vnesení Cas9, gRNA, či exogenní DNA do cílových buněk je důležitým faktorem úspěšnosti metody CRISPR/Cas9. Protein Cas9 společně s gRNA se nejčastěji do buněk transportují s využitím elektrického proudu – elektroporací, pomocí membránových měchýřků – vezikul, či injektáží (např. do zygoty). Vektorové molekuly s geny pro Cas9 a gRNA se vkládají do virů a jejich prostřednictvím se dostávají do buněk, nebo se rovněž aplikují elektroporací či tzv. hydrodynamickou injektáží.

c) Opravu mutace genu na úrovni celého nového organismu lze uskutečnit ve stadiu zygoty nebo oocytu během technik in vitro oplození (ICSI – intracytoplasmic sperm injection). Znázorněná je situace, kdy mutovanou alelu přenáší otcovská spermie (označená červenou). Protein Cas9 s gRNA a exogenní DNA se injektují do buňky, přičemž vznikají mozaiková embrya obsahující i „opravené“ blastomery (označené zelenou). Realizace tohoto postupu během ICSI se jeví jako úspěšnější.

d) Mutace u jedinců v postnatálním období je možné „opravit“ v podmínkách in vitro – úpravou izolovaných buněk jedince pomocí všech komponent CRISPR/Cas9, které jsou do buněk aplikované například elektroporací. V následující fázi (zatím ještě v rámci klinických zkoušek) by upravené buňky s funkčním cílovým genem měly být implantovány zpět do organismu.

e) V rámci „opravy“ genů v podmínkách in vivo se složky CRISPR/ Cas9 dostanou na místo určení pomocí virů, vezikul nebo injektáží a k opravě cílového genu dochází v konkrétní tkáni organismu.

f) Při použití vhodně navrhnuté genové konstrukce, která obsahuje genetickou informaci pro Cas9 a gRNA, přímo ohraničenou homologickými sekvencemi k cílové genomové DNA, se tento konstrukt za určitých podmínek pomocí z něho syntetizovaných Cas9 a hybridizací gRNA vloží do cílové DNA a následně se „zkopíruje“ do homologického chromosomu. Uvedený mechanismus se může uplatňovat i v dalších generacích a rozšiřovat tuto změnu genetické informace v celé populaci procesem, jenž se označuje jako mutagenní řetězová reakce.

ODSTRANĚNÍ GAMETICKÝCH PATOGENNÍCH MUTACÍ, LÉČENÍ VZÁCNÝCH DĚDIČNÝCH CHOROB (I JEJICH PREVENCE)

Jednoduše dědičné choroby, např. vrozené omyly metabolismu (5), jsou poměrně vzácné. Jejich výskyt lze významně ovlivnit metodami genového inženýrství, konkrétněji genovou terapií. Na rozdíl od kdysi teoreticky uvažované selekce, bránící přenosu odpovědných genů z mateřské generace na generaci dceřinou (což se vlastně děje přirozenou cestou u mutací letálních), nás výpočty populačních genetiků přesvědčily, že k vymizení patologických mutací by došlo (pokud by nevznikaly žádné nové) až po značně velkém počtu generací – jinými slovy jakákoliv selekce by u člověka byla velmi málo účinná.

Výzkum v rámci genové terapie přinášel až do začátku posledního desetiletí jen nepatrný pokrok a hlavním nástrojem přenosu žádoucích genetických informací byly viry. I to však slavilo své úspěchy. Významného úspěchu bylo dosaženo s použitím virového vektoru u letálního kožního onemocnění – junkční epidermolysis bullosa – vytvořením transgenních kmenových buněk (6). Příjemcem byl nositel homozygotního genotypu sestřihové mutace v intronu genu LAMB3.

Genová editace (jako nejúspěšnější se ukázala metoda označovaná CRISPR/Cas9) vyvolala díky počátečním úspěchům ohromné nadšení. To poněkud opadlo, když se zjistilo, že i ona má své slabiny. Současně se věnuje hlavní pozornost jejich odstraňování a hledání dalších způsobů genové editace. Jednou z aplikací důležitých pro současnou medicínu je možnost genové editace při úpravách genomu embryonálních buněk. V tomto směru nejvíce pokročila Velká Británie (7) následovaná Čínou a USA. Ve všech jmenovaných státech již byl povolen výzkum na lidských embryích. Tyto výzkumy jsou užitečné zvláště pro fertilizaci in vitro (IVF), která vyžaduje nejen kvalitní diagnostiku (7, 8), ale i bezpečnou genovou terapii. Zatímco Rada Evropy v Konvenci o lidských právech a biomedicíně zakázala modifikace genomů buněk zárodečné linie, skupina expertů v USA vypracovala a v rámci Národní akademie věd (NAS) (9, 10) vydala řadu požadavků na návrhy projektů zabývajících se genovou editací zárodečných genomů lidských buněk a žádajících o povolení k realizaci. Předpokladem schválení je především chybění rozumné alternativy a dále splnění následujících kritérií:

Prevence závažné choroby nebo stavu.
Editace genů, u nichž bylo přesvědčivě dokázáno, že významně předurčují vznik choroby nebo stavu.
Přeměna genů do podoby, která je v populaci převládající a o níž je známo, že souvisí s normálním zdravotním stavem a má minimální nebo žádné vedlejší účinky.
Dostupnost preklinických či klinických dat o rizicích a pravděpodobně vhodném vlivu na zdraví.
Průběžný a rigorózní dohled nad klinickými studiemi z hlediska vlivu použité techniky na zdraví a bezpečí účastníků výzkumu.
Srozumitelné plány na dlouhodobé, vícegenerační sledování při nenarušení osobní autonomie.
Maximální otevřenost při zachování pacientova soukromí.
Soustavné ověřování zdravotního i sociálního přínosu a rizik včetně současné účasti a příspěvku veřejnosti.
Hodnověrné (spolehlivé) mechanismy dohledu, které by bránily rozšíření mimo závažné choroby a stavy.

Pokud by navrhovaný výzkum splňoval uvedená kritéria, mohl by být povolen. V některých státech již povolené experimenty na embryonálních buňkách přinesly pozitivní výsledky (7) a systém CRISPR je nabízen komerčně, např. v podobě kompletních souprav k okamžitému použití včetně gRNA pro všechny známé lidské geny.

V tomto směru nabývá výuka lékařské genetiky na dalším významu a přináší zadostiučinění všem našim zakladatelům výuky genetiky na českých (československých) lékařských fakultách – prof. Vladislavu Růžičkovi a na Slovensku prof. Viliamu Izakovičovi (11).

Náprava defektních genů v rámci genové terapie na úrovni zygoty či embrya otvírá dveře pro efektivní léčení dědičných (genetických) chorob, avšak reálné využití této technologie významně závisí na vývoji legislativy, etických pravidel a postojů společnosti. Pozměněná embrya lze zatím zkoumat jen několik dní, následně se experiment musí ukončit bez možnosti dalšího vývinu embrya v děloze matky. Metoda CRISPR/Cas9 však poskytuje též možnosti editace genů a jejich opravy jen v konkrétních tkáních organismu, jež jsou dědičným onemocněním postižené, tj. není potřebné změnit DNA jedince ve všech jeho buňkách.

Zajímavé výsledky byly v tomto směru dosaženy u nemocí, které ovlivňují tkáně vznikající z buněčných linií se zachovanou dělivou schopností. Jde například o kmenové linie včetně indukovaných iPSC (induced pluripotent stem cells) – jejich využití v genové terapii se též intenzívně zkoumá při nádorových chorobách (viz dále). Velmi perspektivní se zdají být možnosti opravy genů v buňkách krvetvorby, například genu pro beta-globin (HBB) v iPSC a produkce „opraveného“ proteinu ve vznikajících erytrocytech (12). Metoda by tak mohla pomoci v léčbě beta-talasemie nebo srpkovité anemie. Ještě dříve existovaly snahy o aplikaci metody CRISPR/Cas9 v souvislosti s metabolickými dědičnými chorobami typu enzymopatií. Lee et al. (5) prokázali možnost opravy genu pro arginázu v iPSC. V podobném experimentu, jen na jiném typu buněk, se podařilo inaktivovat mutovanou alelu, zodpovědnou za vznik Huntingtonovy choroby (13).

Kultivační techniky buněk získaných z postiženého jedince, jako je změna sekvence DNA v podobě opravy poškozeného genu, jsou ve stadiu technického zvládnutí při mnoha dalších onemocněních. Zatím před námi zůstává další fáze terapie včetně vnášení opravených buněk do organismu a jejich úspěšná implementace s následným „vyléčením“ pacienta. K prvnímu takému kroku se odhodlali v roce 2016 v Číně, těsně následovaní USA (14). Nešlo však o typické monogenní onemocnění, spíš o podporu imunitního systému v boji proti nádorům, o které se zmiňujeme dále.

Další způsob genové terapie s využitím technologie CRISPR/Cas9 nevyužívá izolované buňky pacienta a jejich úpravu v podmínkách in vitro, ale naopak dodává všechny složky na místo určení v těle organismu a realizace vlastní úpravy genů probíhá in vivo v cílové tkáni. Většina takovýchto experimentů se úspěšně uskutečnila na myších. V jedné z prvních úspěšných prací z roku 2014 se tímto způsobem podařilo „opravit“ gen pro fumarylacetoacetát hydrolázu (FAH), důležitý enzym v metabolismu tyrosinu, jehož mutace jsou příčinou metabolického defektu – tyrosinemie typu I. Všechny komponenty CRISPR/Cas9 byly do jater myší dopravené pomocí tzv. hydrodynamické injektáže, a tak se podařilo obnovit produkci enzymu v asi třetině jaterních buněk (15).

Jiné postupy využily k transportu složek CRISPR/Cas9 tzv. adeno-asociované viry, čímž došlo k úpravě genu pro dystrofin s potenciálem využití v genové terapii některých forem svalové dystrofie (16). Zatím posledním úspěchem této metody je úprava geneticky podmíněné ztráty sluchu zaměřená na potlačení mutace genu TMC1. Ten kóduje transmembránový protein potřebný pro funkci buněk ve vnitřním uchu. Gao et al. v tomto případě dopravili komponenty CRISPR/Cas9 do vnitřního ucha myší pomocí lipidových vezikul. Výsledkem bylo zlepšení sluchu myší (hodnocené za měsíc po zákroku) v průměru o 15 decibelů (17).

ODSTRANĚNÍ SOMATICKÝCH MUTACÍ (LÉČBA A PREVENCE NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ, POSÍLENÍ PROTINÁDOROVÉ IMUNITY)

Protože nádorové buňky, nebo alespoň některé z nich, svým způsobem odpovídají kmenovým buňkám, můžeme pomocí metody genové editace lépe poznat jejich genetickou výbavu. Bakhshinyan et al. naznačili způsob využití metody CRISPR pro screening jejich vlastností tak, aby byla využitelná pro cílenou terapii pokrývající co nejširší spektrum cílů důležitých pro jejich růst a množení (18). V konkrétním případě např. Yik et al. (19) vypracovali techniku pro využití genové editace pro pokusy na imortalizovaných buněčných liniích erytroleukemie. Podobně byly vypracovány návody jak vyhledávat v genomu ztrátové mutace a sestaveny strategie jak odhalit genetické závislosti nádorových buněk využitelné v protinádorové léčbě (20).

Zásadního pokroku bylo dosaženo u nádorů prostaty, kdy se s pomocí metody CRISPR podařilo najít některé nové mezigenové vztahy důležité zvláště pro rekurenci nádoru (21). Velmi důležitý je výzkum dosud málo známé (a přitom větší) části genomu (22). S nádorovými buňkami bojuje imunitní systém, k jehož podpoře lze genovou editaci také použít (23), např. vyřazení CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) pomocí metody CRISPR a tím pádem potlačení jeho tlumivé funkce na aktivaci T buněk a současně podporu produkce TNF-α a IFN-γ. Podobný cíl měly již zmiňované studie z Číny a USA, kde inaktivovali gen kódující protein PD-1 (programmed cell death 1) – receptor též zapojený do regulace T buněk imunitního systému. V uvedeném experimentu byly pacientům poprvé v historii injekčně podány buňky s geny upravenými pomocí techniky CRISPR/Cas9 v rámci klinické studie, jež by měla být ukončena v roce 2018.

Protinádorové léčbě dosud dominovala a stále dominuje chemoterapie. K jejímu zásadnímu pokroku již také začaly přispívat metody genové editace (24) tím, že kromě jiného umožňují přesněji definovat vztah mezi terapeutikem a jeho místem zásahu.

Poněkud mimo uvedené směry se nachází užití editace genomu v boji s virovými infekcemi typu HIV, které primárně postihují somatické buňky infikované osoby, ale z nemocných matek mohou být přenášeny na jejich děti, a chovat se tak jako vrozené (dědičné) onemocnění. Možnostmi použití metody CRISPR jakožto antivirové léčby se ve velké šířce i s použitím vektorů typu AAV (adeno-associated viral vector) zabývají Soppe a Lebbink (25). Hlavním problémem však zatím zůstává, vzhledem k sekvenční variabilitě, dostupnost adekvátní gRNA (26). Stranou zájmu nezůstaly ani bakterie (27), kde se genová editace uplatňuje ve smyslu otevření nové cesty k potlačování rezistence, se kterou jsme si dosud nevěděli příliš rady.

**MOŽNOSTI ODSTRANĚNÍ PŘENAŠEČŮ PARAZITÁRNÍCH NEMOCÍ (GENOVÝ DRIVE)**

Metoda CRISPR je z hlediska genetiky výjimečná v tom, že se v jednom směru vymyká pravidlům klasické Mendlovy nauky o dědičnosti, a to v přenosu znaků z generace rodičovské na potomstvo. Název může připomínat genetický drift známý z populační (evoluční) genetiky, který vysvětluje, jak v malých populacích, zvláště takových, jež procházejí fází, kterou připodobňujeme k průchodu hrdlem lahve, může převládnout i méně výhodná alela a vymizet výhodnější (28). Procesem CRISPR lze docílit podobného jevu velice rychle a vlastně bez ohledu na velikost populace, v níž tento proces proběhne.

Genový drive, který byl zpočátku považován za geniální řešení (29), má i svá úskalí, jak se naštěstí včas ukázalo na pokusech s octomilkou (drozofilou). V posledních letech, po počátečním nadšení z možnosti rychle se zbavit přenašečů tak zhoubných chorob, jako je malárie, se objevily rozpaky nad důsledky vyhubení některých druhů hmyzu pro přírodu jako celku, neboť např. pro některé ptáky představují jejich larvy důležitou součást potravy, a hlavně i proto, že po rychlém převládnutí vnesené alely se mohou v postižené populaci objevit rezistentní jedinci (30). Podobné vědomé i nevědomé pokusy totiž lidé provedli už mnohokrát, např. tím že přenášeli některé zvířecí nebo rostlinné druhy z jednoho místa (kontinentu) na druhé a často tak způsobili mnoho původně neočekávaných škod, mezi jiným i vymizení domácích druhů, a kýženého výsledku stejně nedosáhli.

Vedle léčení nabízejí metody upravující lidský genom mnoho dalších způsobů využití např. z estetického hlediska, ale i v dalších oblastech, především ve sportu, u něhož ovšem hrozí tzv. genový doping; nikoliv snad proto, že bychom o něm neuvažovali již dříve, ale pro snadnost, s jakou by dnes bylo možné jej používat. Většina těchto „nemedicínských“ oblastí je vystavena kritice z hlediska etiky, která by neměla být opomíjena ani u využití medicínského, zvláště tam, kde chceme zasahovat do genomu způsobem, jehož následky by byly přenositelné do dalších generací.

Konečně, jeden neslavně známý příklad pokusu o genový doping pochází z doby před deseti lety, kdy byla medializovaná snaha německého trenéra atletů o získání preparátu Repoxygen. Uvedený preparát byl původně vyvinutý k léčbě anemie. Umožňoval přenos genů pro stimulaci syntézy erytropoetinu pomocí virového vektoru. Přestože tento preparát byl zakázaný, hrozbu genového dopingu si perspektivně uvědomuje i samotná Světová antidopingová agentura (WADA), která v rámci svých pravidel vysloveně zakazuje ovlivňování sportovní výkonnosti pomocí přenosu nukleových kyselin nebo jejich analogů a použití normálních či geneticky modifikovaných buněk (31).

Co se týká patentové ochrany techniky genové editace, pochází největší počet návrhů z Massachusettského technologickému institutu (MIT), na druhém místě je Broad Institute, na třetím Harvardova univerzita a na čtvrtém Kalifornská univerzita (všechny instituce z USA). Na pátém místě je pak Čínská akademie věd (CAS). (Viz též: www.ipstudies.ch/crispr-patent-analytics).

ZÁVĚR

Mnoho odborníků předpokládá, že současný stav je teprve začátkem narůstajícího zájmu o cílené úpravy nejen lidského genomu a že v brzké době se stane jedním z nejrozšířenějších postupů laboratoří zabývajících se molekulární genetikou. Mimo jiné o tom svědčí výše uvedené šetření o počtech patentů (návrhů i uznaných) a licencí uveřejněných na webu IPS. Někteří odborníci dokonce předpovídají, že prakticky každá biologická laboratoř bude tyto metody používat.

Pokud si položíme pro nás zatím jen teoretickou otázku, zda genovou editaci zvládáme a chceme ji v klinické praxi využívat, a odpovíme na ni ANO, pak je s tím spojeno nemalé množství dalších otázek, které bude třeba vyřešit, nejen technických, ale i etických (32). Jestliže se ukáže, že se skutečně lidstvu podařilo vynalézt způsob jak ovlivňovat svou biologickou evoluci, a to nejen zásahy do svého vlastního genomu, ale i genomů ostatních forem života, bude třeba nejvyššího stupně ostražitosti. Zkušenosti s nejrůznějším lidskými vynálezy nás varují, že, byť byly pod kontrolou celosvětově platné dohody, prakticky nikdy se tato pravidla nepodařilo dodržet a zabránit zneužití.

DODATEK

Dodatek, který snad potěší, ale možná vzbudí i závist našich otorinolaryngologů a za který musím poděkovat kolegovi Suchardovi, neboť mne na něj upozornil, se týká úspěšného léčení dominantně dědičné hluchoty, zatím jen v experimentu na myších (33). Snad se podobného úspěchu dočká genová editace u amyotrofické laterální sklerózy (ALS), kde je odpovědným gen SOD1 (34), a stane se použitelnou i v lidské terapii. A jako poslední připojím dva „povzdechy“, které se objevily mezi komentáři v čísle 7697 letošního ročníku Nature. Oba se zabývají problematikou genové editace, a to potřebou diskuse o jejích možnostech a případné regulaci (35, 36). Hlubší vhled do obou článků musím ponechat na čtenářích, které to bude zajímat, protože jinak by se mohl dodatek svým rozsahem stát nejdelší částí tohoto textu.

Adresa pro korespondenci:

prof. RNDr. Radoslav Omelka, Ph.D.

Katedra botaniky a genetiky

Fakulta prírodných vied Univerzity Konštantína Filozofa v Nitre

Trieda A. Hlinku 1

949 74 Nitra, Slovensko

e-mail: romelka@ukf.sk; romelka@pobox.sk

Zdroje

1. Yin H, Kauffman KJ, Anderson DG. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov 2017; 16(6): 387–399

2. Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 2017; 551(7681): 464–471.

3. Chen JS, Dagdas YS, Kleinstiver BP et al. Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy. Nature 2017; 550(7676): 407–410.

4. GTEx Consortium. Genetic effects on gene expression across human tissues. Nature 2017; 550: 204–213.

5. Lee PC, Truong B, Vega-Crespo A et al. Restoring ureagenesis in hepatocytes by CRISPR/Cas9-mediated genomic addition to arginase-deficient induced pluripotent stem cells. Mol Ther Nucleic Acids 2016; 5(11): e394.

6. Hirsch T, Rothoeft T, Teig N et al. Generation of the entire human epidermis using transgenic stem cells Nature 2017; 551: 327–332.

7. Locke T. Embryo gene editing gets the go-ahead in UK. Medscape 2016 Feb 01.

8. Mounts EL. Preimplantation genetic diagnosis in the era of genomic medicine. Medscape 2017 Oct 27.

9. Ault A. NAS panel backs human germline editing, with many caveats. Medscape 2017 Feb 14.

10. Lewis R. Gene editing approach may reduce risks, experts say. Medscape 2017 Aug 04.

11. Bonthron DT, Foulkes WD. Genetics meets pathology – an increasingly important relationship. J Pathol 2017; 241(2): 119–122

12. Cai L, Bai H, Mahairaki V et al. A universal approach to correct various HBB gene mutations in human stem cells for gene therapy of beta-thalassemia and sickle cell disease. Stem Cells Transl Med 2018; 7(1): 87–97.

13. Shin JW, Kim KH, Chao MJ et al. Permanent inactivation of Huntington’s disease mutation by personalized allele-specific CRISPR/Cas9. Hum Mol Genet 2016; 25(20): 4566–4576.

14. Jordan B. [First use of CRISPR for gene therapy]. Med Sci (Paris) 2016; 32(11): 1035–1037.

15. Yin H, Xue W, Chen S et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol 2014; 32(6): 551–553.

16. Nelson CE, Hakim CH, Ousterout DG et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science 2016; 351(6271): 403–407.

17. Gao X, Tao Y, Lamas V et al. Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents. Nature 2018; 553(7687): 217–221.

18. Bakhshinyan D, Adile AA, Qazi MA et al. Introduction to cancer stem cells: past, present, and future. Methods Mol Biol 2018; 1692: 1–16

19. Yik JJ, Crossley M, Quinlan KGR. Genome editing of erythroid cell culture model systems. Methods Mol Biol 2018; 1698: 245–257.

20. Jaiswal A, Peddinti G, Akimov Y et al. Seed-effect modeling improves the consistency of genome-wide loss-of-function screens and identifies synthetic lethal vulnerabilities in cancer cells. Genome Med 2017; 9(1): 51.

21. Romanel A, Garritano S, Stringa B et al. Inherited determinants of early recurrent somatic mutations in prostate cancer. Nat Commun 2017; 8(1): 48.

22. Hu X, Sood AK, Dang CV, Zhang L. The role of long noncoding RNAs in cancer: the dark matter matters. Curr Opin Genet Dev 2018; 48: 8–15.

23. Shi L, Meng T, Zhao Z. CRISPR knock out CTLA-4 enhances the anti-tumor activity of cytotoxic T lymphocytes. Gene 2017; 636: 36–41.

24. Guichard SM. CRISPR-Cas9 for drug discovery in oncology. Annu Rep Med Chem 2017; 50: 61–85.

25. Soppe JA, Lebbink RJ. Antiviral goes viral: harnessing CRISPR/Cas9 to combat viruses in humans. Trends Microbiol 2017; 25: 833–850.

26. Dampier W, Sullivan NT, Chung CH et al. Designing broad-spectrum anti-HIV-1 gRNAs to target patient-derived variants. Sci Rep 2017; 7(1): 14413.

27. Wong WF, Santiago M. Microbial approaches for targeting antibiotic-resistant bacteria. Microb Biotechnol 2017; 10: 1047–1053.

28. Kimura M. Evolutionary rate at the molecular level. Nature 1968; 217(5129): 624–626.

29. Hammond A, Galizi R, Kyrou K et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nat Biotechnol 2016; 34: 78–83.

30. Champer J, Reeves R, Oh SY et al. Novel CRISPR/Cas9 gene drive constructs reveal insights into mechanisms of resistance allele formation and drive efficiency in genetically diverse populations. PLoS Genet 2017; 13(7): e1006796.

31. World Anti-Doping Agency. What is prohibited. WADA, 2017. Dostupné na: www.wada-ama.org/en/prohibited-list/prohibited-at-all-times/gene-doping

32. Petr J. Jsme připravení na „krisprovou“ revoluci? Vesmír 2015; 94(7): 394–395.

33. Chien WW. A CRISPR way to restore hearing. N Engl J Med 2018; 378(13): 1255–1256.

34. Al‑Chalabi A, Brown RH. Finding a treatment for ALS – will gene editing cut it? N Engl J Med 2018; 378(15): 1454–1456.

35. Jasanoff S, Hurlbut JB. A global observatory for gene editing. Nature 2018; 555(7697): 435–437.

36. Burall S. Don’t wait for an outcry about gene editing. Nature 2018; 555(7697): 438–439.

Štítky

Adiktologie Alergologie a imunologie Anesteziologie a resuscitace Angiologie Audiologie a foniatrie Biochemie Dermatologie Dětská dermatologie Dětská gastroenterologie Dětská gynekologie Dětská chirurgie Dětská kardiologie Dětská nefrologie Dětská neurologie Dětská onkologie Dětská otorinolaryngologie Dětská pneumologie Dětská psychiatrie Dětská radiologie Dětská revmatologie Dětská urologie Diabetologie Endokrinologie Farmacie Farmakologie Fyzioterapie Gastroenterologie a hepatologie Genetika Geriatrie a gerontologie Gynekologie a porodnictví Hematologie a transfuzní lékařství Hygiena a epidemiologie Hyperbarická medicína Chirurgie cévní Chirurgie hrudní Chirurgie plastická Chirurgie všeobecná Infekční lékařství Intenzivní medicína Kardiochirurgie Kardiologie Logopedie Mikrobiologie Nefrologie Neonatologie Neurochirurgie Neurologie Nukleární medicína Nutriční terapeut Obezitologie Oftalmologie Onkologie Ortodoncie Ortopedie Otorinolaryngologie Patologie Pediatrie Pneumologie a ftizeologie Popáleninová medicína Posudkové lékařství Praktické lékařství pro děti a dorost Protetika Psychologie Radiodiagnostika Radioterapie Rehabilitační a fyzikální medicína Reprodukční medicína Revmatologie Sestra Sexuologie Soudní lékařství Stomatologie Tělovýchovné lékařství Toxikologie Traumatologie Urgentní medicína Urologie Laboratoř Domácí péče Foniatrie Algeziologie Zdravotnictví Dentální hygienistka Student medicíny

Článek Neopioidní analgetika

Článek Přednáškové večery Spolku českých lékařů v Praze (květen – červen 2018)

Článek Niels Kaj Jerne (1911–1994)

Článek Profesor Jan Pfeiffer očima studentky a spolupracovnice(k 90. narozeninám prof. MUDr. Jana Pfeiffera, DrSc.)

Článek Životní jubileum prof. MUDr. Sixta Hynieho, DrSc

Článek 85 let prof. Marie Brodanové

Článek Blahopřání Ing. Ludmile Kazdové, CSc.

Článek Úvodem

Článek Editorial

Článek Patofyziologie bolesti a její klinické aplikace

Článek Léčba bolestí zad

Článek Opioidy a nové trendy v léčbě bolesti