Když se v roce 2003 podařilo kompletně přečíst lidský genom, otevřela se cesta k rychlému pokroku na poli personalizované medicíny. Výzkumné úsilí onkologů se napřelo k sekvenování genomů nádorových buněk, abychom lépe pochopili genetickou podstatu vzniku tumorů a byli schopni řídit protinádorovou léčbu. Technologie nové generace sekvenování významně zjednodušily, zrychlily a zlevnily a profilování nádorové DNA se stalo standardem ve výzkumu a stále více proniká též do klinické onkologické praxe.
Maligní nádory jsou genetická onemocnění − zhoubné bujení je způsobeno mutacemi v onkogenech, jejichž aktivace je zodpovědná za nádorovou transformaci, a v nádorových supresorech, jejichž inaktivace umožňuje nekontrolovanou proliferaci buněk. Postupné objevování specifických tzv. řídicích změn v genomu umožnilo vývoj cílené léčby, která je účinnější a méně toxická ve srovnání s klasickou chemoterapií.
Genetické testování se v onkologické léčbě brzy stalo standardem. Ačkoliv onkologové po roce 2000 své pacienty již běžně stratifikovali k podání léčby podle mutačního profilu, testování bylo v té době cíleno pouze na několik málo mutací, o kterých se vědělo, že je lze farmakologicky ovlivnit.
Aby bylo možné lépe porozumět relevanci jednotlivých mutací pro různé typy nádorů a snadněji identifikovat nové potenciální terapeutické cíle, bylo potřeba pro srovnání získat referenční „normální“ lidský genom. To se podařilo v roce 2003, po téměř 15 letech mezinárodní spolupráce, a tak bylo konečně možné potvrdit patologické změny a objevovat nové genetické varianty spojené s různými onemocněními.
Brzy poté se podařilo vyvinout nové technologie sekvenování genů, které umožnily v krátkém čase a levně sekvenovat všechny kódující oblasti genomu (WES – whole exome sequencing), nebo dokonce celé genomy (WGS – whole genome sequencing). Tím věda získala obrovské množství dat, jejichž analýza a interpretace zůstávají výzvou do příštích let.
Kromě toho, že sekvenování nové generace (NGS – next generation sequencing) přineslo nové poznatky o vzniku a rozvoji nádorového onemocnění, umožnilo také nový způsob léčby pacientů. Precizní medicína se snaží přesně zacílit terapii na daného pacienta podle individuálních změn v genomu právě jeho nádorových buněk.
Precizní medicína v onkologii se snaží o identifikaci takových mutací v nádorových genomech, které predikují odpověď nebo rezistenci k dané terapii. Panely NGS umožňují jednoduše sekvenovat široké spektrum genů v rámci jednoho podrobného testu, a to s minimem vstupního materiálu. Pokud není možné provést klasickou biopsii, jsme schopni získat velké množství informací o nádorovém genomu i z odběru krve.
Prvním možným využitím NGS je genomika, tedy sekvenování celého genomu, kódujících (exony) i nekódujících (introny) sekvencí. Sekvenování je schopno odhalit varianty v sekvenci DNA, a to od úrovně chromosomové – změny v počtu kopií genu (CNA – copy number alterations), strukturní změny (SV – structural variations) a inzerce nebo delece (indels) – až po změny jednotlivých nukleotidů (bodové mutace; SNVs – single nucleotide variations).
Technika WGS generuje obrovské množství dat o každém vzorku, obvykle však s nízkým pokrytím. Každý úsek genomu je typicky sekvenován cca 30× a vzhledem k tomu, že sekvenované „kousky“ DNA pocházejí z různých buněk, zajišťuje toto pokrytí sice dostatečnou specificitu pro detekci většiny zárodečných mutací (tedy těch, které jsou neseny každou buňkou organismu) daného jedince, ale není schopno odhalit vzácné somatické mutace (vzniklé během života) přítomné v nádorovém genomu.
Technika WES je naproti tomu specificky navržena pro sekvenování pouze kódujících úseků DNA. Exony tvoří přibližně 2 % genomu a při sekvenování je možno dosáhnout cca 100násobného pokrytí každého úseku. Pro analýzu nádorového genomu je tedy WES vhodnější, na druhou stranu má ovšem daleko nižší schopnost odhalit strukturální změny a odchylky v počtu kopií genu.
Přečtení celého genomu či exomu člověka je finančně a časově nákladné a analyticky komplikované pro rutinní využití v klinické praxi. Pokud je sekvenování prováděno se specifickým záměrem, např. charakterizovat konkrétní typ nádoru, jsou v současnosti dostupné sady pro analýzu vybraného panelu genů důležitých pro vznik a vývoj daného onemocnění. Specifické úseky DNA, které je třeba otestovat, jsou před sekvenováním ve vzorku obohaceny pomocí techniky hybridizačního záchytu (hybrid capture) a následné amplifikace prostřednictvím polymerázové řetězové reakce (PCR). Při využití této technologie je hloubka sekvenování až 500× v celé šíři sekvenovaných genů.
Např. FoundationOne CDx, což je první služba companion diagnostics zacíleného testování onkologických aberací u solidních nádorů schválená americkým Úřadem pro kontrolu léčiv a potravin (FDA) pro 17 cílených léčiv, umožňuje detekovat změny (včetně mikrosatelitové nestability a mutační nálože tumoru) ve 324 genech souvisejících se vznikem a růstem solidních nádorů.
Pokud chceme získat informace o tom, co se děje v konkrétních buňkách v daném čase, je možné zkoumat tzv. transkriptom. Jde o soubor všech transkriptů (tedy molekul RNA, do kterých se přepisuje informace uložená v DNA) v buňce.
Relativně novou aplikací NGS je sekvenování na úrovni RNA (RNA-seq). To je možné použít jak pro kvantifikaci genové exprese (tedy jak moc se který gen přepisuje do RNA, potažmo vyjadřuje do proteinu), tak pro detekci nových transkriptů, genových fúzí, bodových mutací a inzercí/delecí.
Kromě výzkumu genové exprese je možné RNA-seq využít i pro analýzu malých nekódujících RNA (ncRNA, krátké úseky RNA, které se nepřepisují do proteinů). Jejich úloha v buňce je zejména regulační a v poslední době jsou předmětem intenzivního studia.
Techniky NGS umožňují získat informace o genomu pacienta relativně levně a v krátkém čase. WES a WGS představují důležité nástroje pro diagnostiku genetických a dědičných onemocnění. V případě onkologických onemocnění jsou pro přesnou diagnostiku a návrh léčby obvykle užitečnější menší, přesněji zacílené panely genů, které už jsou dnes v některých zemích běžně dostupné a používané v klinických hodnoceních i v rutinní praxi.
(este)
Zdroje:
