Molekulární diagnostika hemofilie A a B (HA a HB) dnes umožňuje např. testování žen příbuzných hemofiliků na přenašečství onemocnění, prenatální a preimplantační diagnostiku i detekci zvýšeného rizika vzniku inhibitoru u pacientů s některými typy mutací. Molekulární testování v diagnostice hemofilie A také pomáhá odlišit toto onemocnění od von Willebrandovy choroby (VWD).
Hemofilie A je způsobena mutacemi v genu pro FVIII (gen F8), který se nachází na q raménku chromozomu X (oblast Xq28), a dosud bylo objeveno přibližně 2 tisíce mutací v kódujících a netranslatovaných oblastech F8. Molekulární diagnostika HA obvykle začíná testováním na přítomnost inverze intronu 22, která je u HA nejčastější mutací (vyskytuje se u cca 30 % všech pacientů a přibližně 50 % těžkých případů), a inverze intronu 1, jež se vyskytuje u přibližně 1 % případů. Tento screening se provádí pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), a pokud je negativní, obvykle bývá následován přímým sekvenováním kódující oblasti genu F8.
Hemofilii B způsobují mutace v genu pro FIX (gen F9), nacházejícím se v oblasti Xq27. 80 % pacientů s HB má bodové mutace (missense/nonsense) a dosud je známo přibližně tisíc různých mutací v genu F9. Sekvenování DNA je zlatým standardem i v diagnostice HB.
Přímá detekce mutací v DNA se obvykle provádí pomocí PCR amplifikace následované Sangerovým sekvenováním, což je pracný přístup, který v 10 % případů stejně nevede k úspěchu (zejména u lehčích případů HA). Sekvenování nové generace (NGS − next generation sequencing) naproti tomu umožňuje souběžné zkoumání několika kompletních genů, jež se mohou nacházet ve zcela odlišných oblastech genomu.
NGS již bylo použito pro sekvenování genů F8 a F9 a momentálně se zavádí do rutinní diagnostiky hemofilie. Cílem studie publikované v časopisu Thrombosis and Haemostasis bylo zhodnotit přínos molekulárnědiagnostického algoritmu, který využívá NGS pro sekvenování genů F8, F9 a VWF v celé jejich délce.
Pacienti s těžkou HA jsou nejprve otestováni na přítomnost inverze intronu 22, a pokud není inverze detekována, pokračuje se testováním intronu 1. Tento přístup by měl identifikovat mutaci způsobující onemocnění přibližně u 45−50 % pacientů s těžkou HA.
U pacientů s negativním výsledkem a dále u nemocných se středně těžkou nebo mírnou HA nebo s jakkoliv závažnou HB se provede NGS celých genů F8, F9 a VWF (celkově se sekvenuje přibližně 395 kb). Pokud není detekována patogenní varianta genu, provede se dále analýza MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) genu F8 pro detekci velkých delecí a duplikací.
Algoritmus byl studován na vzorcích krve od celkem 102 pacientů (78 pacientů s HA, 19 s HB, 3 ženy přenašečky a 2 ženy s příznaky deficience FVIII). Závažnost onemocnění jednotlivých pacientů byla stanovena na základě obvyklých klinických doporučení.
Screening inverze intronu 22 určil diagnózu u 11 z 20 pacientů s těžkou HA a u 1 přenašečky, analýza intronu 1 neodhalila žádné další varianty. NGS poskytlo pozitivní výsledky u 88 případů, z čehož v 8 případech umožnilo rozlišit mírnou/středně těžkou HA od VWD. MLPA u zbývajících 2 pacientů v jednom případě potvrdila velkou exonovou deleci, pouze u jednoho pacienta nebyla nalezena žádná patogenní varianta.
Navržený molekulárnědiagnostický algoritmus umožnil identifikaci genetické varianty u 99 % testovaných pacientů s nízkou hladinou FVIII nebo FIX. Simultánní analýza genů F8 a VWF v celé jejich délce správně zařadila pacienty s VWD, kteří byli považováni za přenašeče, nebo pacienty s HA. Navržený algoritmus by tedy byl použitelný pro diagnostiku všech pacientů s hemofilií v rutinní klinické praxi.
(este)
Zdroj: Bastida J. M., González-Porras J. R., Jiménez C. et al. Application of a molecular diagnostic algorithm for haemophilia A and B using next-generation sequencing of entire F8, F9 and VWF genes. Thromb Haemost 2017; 117 : 66–74, doi: 10.1160/TH16-05-0375.
