Nádorové mikroprostředí spinocelulárních karcinomů hlavy a krku

Souhrn

Charakter nádorového mikroprostředí může být velmi dobrým prognostickým i prediktivním faktorem u mnoha typů malignit. Pro výběr vhodných imunoterapeutických protokolů je zásadní především složení, denzita a funkční kapacita imunitních buněk infiltrujících nádorovou tkáň. Spinocelulární karcinomy hlavy a krku jsou typické vysokým infiltrátem efektorových i regulačních T lymfocytů a obecně se tak řadí mezi imunologicky horké nádory. Vyšší počty T lymfocytů infiltrujících nádory a zároveň lepší prognóza pacientů byly popsány u spinocelulárních karcinomů hlavy a krku asociovaných s infekcí lidským papilomavirem. Imunitní profil nádorů asociovaných s kouřením byl variabilnější, s větším zastoupením supresivních myeloidních buněk a velkými rozdíly v počtech cytotoxických T lymfocytů mezi pacienty. V souladu s poznatky současné imunoonkologie byl však u pacientů se spinocelulárními karcinomy hlavy a krku počet cytotoxických T lymfocytů infiltrujících nádorovou tkáň dokonce lepším prognostickým faktorem než samotný HPV status. Prognostické znaky vycházející z imunitního profilu by tak mohly přispět k lepší stratifikaci pacientů nejen pro imunoterapeutické, ale i pro deeskalační léčebné protokoly.

Klíčová slova:

HPV – nádorové mikroprostředí – spinocelulární karcinom hlavy a krku – HNSCC

Spinocelulární karcinomy hlavy a krku (head and neck squamous cell carcinomas, HNSCC) jsou heterogenní skupinou onemocnění s dobře definovanými etiologickými agens, mezi které patří kouření, konzumace alkoholu, žvýkání karcinogenních semen areky obecné (tzv. betelových ořechů) a chronické infekce onkogenními viry –⁠ virem Epstein-Barrové (EBV) a lidským papilomavirem (HPV). Podle nejnovějších statistik GLOBOCAN bylo v roce 2022 diagnostikováno 945 000 nových případů HNSCC, a to včetně karcinomů nosohltanu (1). V témže roce bylo nahlášeno 450 000 úmrtí v souvislosti s HNSCC. Incidence a mortalita spinocelulárního karcinomu hlavy a krku se však značně liší podle geografických oblastí a demografických charakteristik. Celosvětově se HNSCC vyskytuje převážně u dospělých starších 50 let, dvakrát častěji u mužů než u žen. Míra výskytu HNSCC je nejvyšší v jižní a jihovýchodní Asii (kde je rozšířeno žvýkání arekových semen), následuje střední a východní Evropa a Jižní Amerika (2). Zatímco pro karcinom nosohltanu je zásadním rizikovým faktorem infekce EBV, HPV je asociovaný s více než 70 % všech případů spinocelulárního karcinomu orofaryngu (OPSCC) ve vyspělých zemích, zatímco v rozvojových zemích je to přibližně 13 % případů. Doposud bylo identifikováno 15 vysoce rizikových sérotypů HPV, které byly charakterizovány jako onkogenní, nicméně naprostá většina OPSCC asociovaných s HPV (85–96 %) je způsobena infekcí HPV 16 (3). Ačkoli nádory asociované s HPV časně metastazují do krčních lymfatických uzlin, klinická data ukazují, že HPV-pozitivní pacienti lépe odpovídají na léčbu. Jedním z důležitých faktorů, které se podílejí na lepší prognóze pacientů s nádory asociovanými s HPV, je charakter nádorového mikroprostředí.

Interakce mezi nádorovými buňkami a imunitním systémem

Maligní nádory obvykle vznikají díky postupným genetickým změnám, které umožňují nekontrolovaný růst buněk nepodléhající klasickým regulačním mechanismům. Zejména v časných stadiích nemoci může ale progresi nádoru regulovat imunitní systém (tzv. eliminační fáze). Imunitní systém rozpoznává maligní buňky na základě exprese nádorových antigenů a je schopen je eliminovat. Postupně jsou pod tlakem imunitního systému selektovány nové varianty nádorových buněk, protinádorová imunitní odpověď je postupně potlačována (fáze rovnováhy, ekvilibrium) a při klinicky manifestovaném onemocnění jsou často imunitní buňky a další složky imunitního systému dokonce využity ve prospěch nádorových buněk (fáze úniku, escape). Mezi nejčastější únikové mechanismy maligních nádorů patří snížení exprese molekul prezentujících antigeny na povrchu nádorových buněk, rezistence k apoptóze (programované buněčné smrti) a exprese molekul indukujících apoptózu (např. Fas ligand) nebo vyčerpání (např. PD-L1) u T lymfocytů infiltrujících nádory (4). Imunitní buňky se musí v nádorovém mikroprostředí navíc vyrovnat s mechanickými bariérami, které reprezentuje abnormální vaskularizace a denzní mezibuněčná hmota. Prostředí nádoru je navíc často chudé na nutrienty esenciální pro T lymfocyty, jako je glukóza, tryptofan a arginin, což společně s vysokou aciditou a hypoxií vede k navození imunosuprese (5).

V souladu s výše uvedenými mechanismy úniku před imunitním systémem bylo u HNSCC popsáno snížení exprese lidského leukocytárního antigenu I. třídy (HLA I, molekula prezentující buněčné antigeny) na povrchu nádorových buněk a s ním spojený únik těchto buněk před rozpoznáním cytotoxickými T lymfocyty. U pacientů s HNSCC byly také popsány funkční defekty u T lymfocytů jak v nádorovém mikroprostředí, tak i v periferní krvi (4). Chronická expozice antigenům, ke které dochází v nádorovém mikroprostředí, navíc vede u T lymfocytů k vyčerpání. Vyčerpané (exhausted) T lymfocyty postupně ztrácejí schopnost proliferovat, produkovat prozánětlivé cytokiny TNFα a IFNγ a zabíjet nádorové buňky (6).

Kromě T lymfocytů byly dysfunkce popsány také u dalších imunitních buněk v nádorovém mikroprostředí HNSCC. U myeloidních dendritických buněk (mDC) a makrofágů asociovaných s nádory (TAM) byla prokázána snížená kapacita zahájit specifickou imunitní odpověď. V nádorové tkáni byly detekovány především nezralé CD1+ mDC (7) a makrofágy typu M2, produkující supresivní cytokiny IL-10 a TGFβ, jejichž přítomnost pozitivně korelovala s progresí onemocnění (8). Posun směrem k supresivnímu fenotypu byl prokázán také u NK buněk (4) a plasmacytoidních dendritických buněk (pDC) (9), pravděpodobně z velké části díky vysoké produkci IL-10, TGFβ a prostaglandinu E2 (PGE2) nádorovými buňkami (10). Vyčerpání a suprese efektorových buněk jsou dále podporovány migrací regulačních T lymfocytů (Treg) a myeloidních supresorových buněk (MDSC) do nádorové tkáně. Výsledkem je účinné potlačení efektivní nádorově specifické imunitní odpovědi.

Nádorové mikroprostředí jako klíč ke stratifikaci pacientů

Přestože imunitní systém není sám o sobě schopný eradikovat pokročilý nádor, který již unikl imunitnímu dohledu, přítomnost imunitních buněk v nádorové tkáni může být velmi silným prognostickým i prediktivním biomarkerem. V mnoha studiích bylo potvrzeno, že odpověď pacientů na standardní léčbu i na imunoterapii je v mnoha případech spojena se specifickým typem nádorového mikroprostředí (11, 12). Nádorové mikroprostředí je velmi komplexní a dynamické. Primárně je tvořené nádorovými buňkami v kontextu nádorového stromatu, tvořeného extracelulární matrix, fibroblasty, endoteliemi a tukovými buňkami. Podle přítomnosti a prostorové distribuce imunitních buněk v nádorové tkáni můžeme rozdělit nádory na imunologicky studené (bez imunitního infiltrátu), vyloučené (s imunitním infiltrátem pouze v invazivním okraji nádoru) a imunologicky horké (s výrazným imunitním infiltrátem v nádorovém epitelu i stromatu) (13, 14). Podle rozsáhlé in silico analýzy sekvenačních dat patří HNSCC mezi nádory s nejvyšším imunitním infiltrátem –⁠ tedy tzv. imunologicky horké nádory (Obr.1) (15). Imunologicky horké nádory obvykle velmi dobře odpovídají na imunoterapii, především inhibitory kontrolních bodů imunitních reakcí (checkpoint inhibitory). V současné době jsou pro léčbu HNSCC schváleny dva inhibitory molekuly PD-1, pembrolizumab (Keytruda) a nivolumab (Opdivo). Oba přípravky jsou indikovány k léčbě recidivujícího nebo metastazujícího HNSCC u pacientů, u nichž došlo k progresi onemocnění během nebo po skončení chemoterapie obsahující platinu (16). Pembrolizumab navíc může být indikován v monoterapii nebo v kombinaci s platinou a fluorouracilem (5-FU) v první linii léčby metastazujícího nebo chirurgicky neresekovatelného recidivujícího HNSCC (17). Podmínkou léčby HNSCC pembrolizumabem je imunohistochemická exprese PD-L1 vyjádřená jako tzv. Combined Positive Score (CPS) ≥ 1. I přes jednoznačný klinický úspěch odpovídá na léčbu inhibitory PD-1 pouze 20 –⁠ 30 % pacientů (18, 19). Validace specifických biomarkerů by tak mohla přispět k přesnější stratifikaci pacientů a k personalizaci terapeutických přístupů.

Imunitní profil u HNSCC

Vzhledem k výrazně lepší prognóze pacientů s HNSCC asociovanými s HPV a nízké prediktivní hodnotě standardní klasifikace u těchto nádorů definovala v roce 2017 Americké komise pro nádorová onemocnění (AJCC) HPV-pozitivní a HPV-negativní HNSCC jako rozdílná onemocnění s odlišnými molekulárními profily a s odlišnou TNM klasifikací (20). Ve srovnání s klasickými mutageny, obsaženými v tabáku, arekových semenech a alkoholu, které způsobují postupnou mutagenezi v rozsáhlých oblastech dlaždicového epitelu horního traktu dýchacího, HPV indukuje karcinogenezi v retikulárním epitelu tonzilárních krypt (21).

Nádorové mikroprostředí karcinomů indukovaných HPV se velmi výrazně liší od nádorů jiné etiologie. Přítomnost virových onkogenů, mutační nálož nádorových buněk a s  ní spojené množství neoantigenů, hypoxie, denzita mezibuněčné hmoty, vaskularizace, aktivita fibroblastů asociovaných s nádory a další faktory výrazně ovlivňují množství, složení a funkční kapacitu imunitních buněk infiltrujících nádory. Imunitní profil je tak dobrým odrazem celkového nastavení nádorového mikroprostředí.

T lymfocyty

Přítomnost T lymfocytů v nádorové tkáni, a to především cytotoxických CD8+ T lymfocytů schopných zabíjet nádorové buňky, je spojována s dobrou prognózou u širokého spektra malignit, včetně HNSCC (22-24). Kromě cytotoxických CD8+ T lymfocytů rozeznáváme ještě pomocné CD4+ T lymfocyty, které poskytují pomocné signály jak CD8+ T lymfocytům, tak B lymfocytům, a regulační T lymfocyty (Treg), které tlumí imunitní odpověď a pomáhají udržovat periferní toleranci. Obecně lze říct, že nádory asociované s HPV jsou výrazně více infiltrovány T lymfocyty v porovnání s HPV-negativními nádory (23, 25). V souladu s předpokladem, že CD8+ T lymfocyty hrají klíčovou úlohu v protinádorové imunitě, predikoval podle Wansoma a kol. počet CD8+ T lymfocytů infiltrujících nádor dokonce lépe odpověď na léčbu než samotný HPV status, jež byl doposud považován za nejsilnější prediktivní znak u HNSCC (26). Komplexní analýza nativních tkání HNSCC provedená v naší laboratoři potvrdila významné rozdíly mezi nádory asociovanými s HPV a nádory jiné etiologie. HPV-pozitivní nádory byly infiltrovány výrazně vyšším množstvím CD8+ T lymfocytů, které měly navíc schopnost produkovat významně vyšší hladiny prozánětlivých cytokinů, jako je IFNγ a IL-17. V souladu s těmito výsledky charakterizovala HPV-pozitivní vzorky také vysoká produkce prozánětlivých chemokinů CXCL9 a CXCL10, které atrahují lymfocyty a NK buňky do nádorové tkáně (27). Výsledky studií zaměřených na analýzu CD4+ T lymfocytů nejsou tak jednoznačné, většina studií ale popisuje vyšší počty Treg lymfocytů ve vzorcích nádorů asociovaných s HPV ve srovnání s HPV-negativními nádory (23, 25, 28). Samotné počty Treg lymfocytů bez vztahu k efektorovým imunitním buňkám pravděpodobně nejsou spolehlivým prognostickým znakem. Jak HPV-pozitivní, tak HPV-negativní nádory patří k malignitám s nejvyššími počty Treg (15). Míru imunosuprese a celkové nastavení nádorového mikroprostředí ale lépe odráží poměr efektorových buněk, především CD8+ T lymfocytů, a Treg lymfocytů (29, 30).

B lymfocyty

Ve srovnání s T lymfocyty byla úloha B lymfocytů v nádorovém mikroprostředí dlouho opomíjená. B lymfocyty ovšem mají potenciál přispívat k protinádorové imunitě řadou způsobů, včetně prezentace nádorových antigenů T lymfocytům. Zároveň mohou B lymfocyty posílit protinádorovou imunitu produkcí nádorově specifických protilátek, které mohou aktivovat imunitními buňkami zprostředkovanou buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC). Vysoké titry protilátek specifických k HPV jsou u pacientů s HPV-pozitivním HNSCC asociovány s lepší prognózou a nižším rizikem relapsu onemocnění (31). Podobně jako v případě T lymfocytů byly pozorovány vyšší počty B lymfocytů u pacientů s HPV-pozitivními nádory ve srovnání s HPV-negativními HNSCC (22, 32) a vysoká denzita B lymfocytů infiltrujících nádory byla asociována s lepší prognózou pacientů (22, 33, 34). B lymfocyty jsou navíc zcela klíčovou populací v terciárních lymfoidních strukturách, které byly popsány u širokého spektra solidních nádorů a které jsou u většiny malignit asociovány s dobrou odpovědí jak na standardní léčbu, tak na imunoterapii (35).

Terciární lymfoidní struktury

Terciární lymfoidní struktury (TLS) jsou ektopické lymfoidní orgány, které vznikají v nelymfatické tkáni v reakci na chronický zánět. V nádorovém mikroprostředí se vyskytují v různých stupních organizace –⁠ od jednoduchých agregátů B a T lymfocytů po dobře vyvinuté struktury s germinálním centrem a zřetelně oddělenou zónou T lymfocytů (Obr. 2) (35, 36). Předpokládá se, že TLS, především ty zralé, s vyvinutými B lymfocytárními folikuly, jsou hlavními centry aktivace B i T lymfocytů v nádorovém mikroprostředí. Podobně jako u jiných malignit byla přítomnost TLS v nádorovém mikroprostředí HNSCC asociována s lepší prognózou pacientů (34, 36) a s přítomností T lymfocytů specifických k nádorovým antigenům (36).

NK buňky

Na rozdíl od T lymfocytů specifických k antigenům vystaveným na povrchu cílových buněk spoléhají NK buňky na vyvážený systém inhibičních (např. KIR, NKG2A, ILT2) a aktivačních (např. NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, CD16) receptorů. Díky tomu dokážou NK buňky rozpoznat a zabít nádorové buňky s abnormální expresí HLA molekul. Existují dvě základní skupiny NK buněk –⁠ cytotoxické NK buňky s nízkou expresí molekuly CD56 a vysokou expresí granzymu B a perforinu a regulační NK buňky s vysokou expresí CD56, které produkují cytokiny (37, 38). Vysoké počty NK buněk infiltrujících nádory byly u HNSCC asociovány s lepší prognózou pacientů (39, 40).

Myeloidní buňky

Mezi myeloidní buňky infiltrující nádory patří dendritické buňky, makrofágy, neutrofily a myeloidní supresorové buňky. Dendritické buňky jsou profesionální buňky prezentující antigeny T lymfocytům, zahajují adaptivní imunitní odpověď a jsou také součástí terciárních lymfoidních struktur. V případě HNSCC korelovala přítomnost dendritických buněk v nádorovém mikroprostředí s lepší prognózou pacientů (41, 42).

Na rozdíl od dendritických buněk jsou ostatní myeloidní buňky v nádorovém prostředí většinou supresivní a předpokládá se, že převážně podporují růst nádorů. Makrofágy infiltrující nádory mají velmi plastický fenotyp. Tradiční dělení na protinádorové prozánětlivé M1 makrofágy, které produkují oxid dusnatý, TNFα a IL-12, a supresivní M2 makrofágy, které produkují imunosupresivní cytokiny a podporují růst nádoru, se již považuje za překonané. V nádorech existuje celé spektrum makrofágů a velká část z nich vykazuje znaky jak M1, tak M2 fenotypu (43). Většina publikací nicméně používá pro zjednodušení zavedenou klasifikaci makrofágů. U HNSCC vykazovala většina makrofágů infiltrujících nádory znaky M2 fenotypu a přítomnost vysokého počtu makrofágů v nádorovém mikroprostředí korelovala s horší prognózou pacientů (44, 45). Zajímavé je, že zastoupení supresivních M2 makrofágů bylo výrazně vyšší u HNSCC asociovaných s kouřením ve srovnání s HNSCC asociovanými s infekcí HPV (25).

Neutrofily tvoří 60–70 % imunitních buněk v periferní krvi a jsou tak nejpočetnějšími cirkulujícími imunitními buňkami. V nádorovém mikroprostředí mají neutrofily většinou supresivní funkci a podporují růst nádoru (46). Podobně jako u jiných malignit byly u pacientů s HNSCC pozorovány zvýšené hladiny neutrofilů v periferní krvi (47), přičemž počty neutrofilů byly výrazně nižší u pacientů s HPV-asociovanými nádory (48). Vysoký poměr neutrofilů vůči lymfocytům v periferní krvi pacientů (neutrophil to lymphocyte ratio, NLR) byl významným negativním prognostickým faktorem pro pacienty s HNSCC bez ohledu na HPV status (47).

Podobně jako neutrofily migrují do místa zánětu, a tedy i do nádorové tkáně, také eozinofily. Na rozdíl od neutrofilů tvoří eozinofily pouze 1–3 % cirkulujících imunitních buněk a důležitou úlohu hrají hlavně v imunitních reakcích proti helmintům a při alergických reakcích. V nádorovém mikroprostředí podporují přežívání eozinofilů lokálně produkované cytokiny, především IL-5 a IL-33 (49). Eozinofilie asociovaná s nádorem (tumor-associated tissue eosinofilia, TATE) byla pozorována u mnoha typů nádorů včetně HNSCC (49, 50). Výsledky studií zabývajících se prognostickým významem TATE u HNSCC jsou rozporuplné. Některé studie popisují přítomnost eozinofilů v nádorovém mikroprostředí jako pozitivní prognostický faktor (51), jiné jako negativní (52, 53). U spinocelulárních karcinomů ústní dutiny byla nicméně TATE konzistentním indikátorem invazivního nádoru (50).

Myeloidní supresorové buňky (MDSC) představují heterogenní populaci nezralých myeloidních buněk, které u zdravých lidí reprezentují méně než 1 % imunitních buněk v periferní krvi (54). Dělí se na granulocytární MDSC podobné neutrofilům a monocytické MDSC podobné monocytům/makrofágům. Akumulace MDSC ve tkáních je spojena s chronickým zánětem a progresí nádorových onemocnění. V nádorovém mikroprostředí výrazně převažují granulocytární MDSC (54). MDSC produkují imunosupresivní cytokiny, jako je IL-10 a TGFβ, podporují angiogenezi, produkují reaktivní formy kyslíku a dusíku a depletují z nádorového mikroprostředí arginin a tryptofan, aminokyseliny esenciální pro T lymfocyty (54, 55). U pacientů s HNSCC koreloval vysoký počet cirkulujících granulocytárních MDSC s kratším celkovým přežitím (56). U MDSC infiltrujících HNSCC byl prokázán vysoký supresivní potenciál, konkrétně jejich kapacita inhibovat T lymfocyty a NK buňky (57, 58).

Fibroblasty asociované s nádory

Ačkoli fibroblasty nepatří mezi imunitní buňky, jsou schopné produkovat řadu chemokinů a cytokinů, které významně imunitní odpověď ovlivňují. Fibroblasty asociované s nádory (CAFs) tvoří v nádorovém mikroprostředí velmi početnou populaci fenotypově i funkčně heterogenních buněk různého původu. Obecně se jedná o konstantně aktivované fibroblasty, které díky produkci růstových faktorů, cytokinů a komponent extracelulární matrix podporují růst nádoru (59-61). Kromě růstu primárního tumoru podporují CAFs díky produkci širokého spektra proteáz také remodelaci extracelulární matrix a zvyšují metastatický potenciál nádorových buněk (61). U HNSCC pozitivně korelovala vysoká denzita CAFs v nádorovém mikroprostředí s pokročilým stádiem nemoci, pozitivitou lymfatických uzlin, vaskulární a perineurální invazí nádoru a vyšším rizikem relapsu (59). Navíc bylo prokázáno, že CAFs u pacientů s HNSCC podporují polarizaci makrofágů směrem k M2 fenotypu, inhibují proliferaci T lymfocytů a celkově přispívají ke vzniku imunosupresivního nádorového mikroprostředí (62).

SHRNUTÍ

Charakter nádorového mikroprostředí velmi výrazně koreluje s prognózou pacientů. Imunologicky horké nádory s vysokými počty imunitních buněk jak v nádorovém epitelu, tak ve stromatu jsou obecně asociovány s delším přežitím pacientů a s dobrou odpovědí na standardní léčbu i imunoterapii. HNSCC patří mezi nádory nejvíce infiltrované imunitními buňkami, zároveň jsou to ale nádory s vysokými počty imunosupresivních buněk, hlavně regulačních T lymfocytů. Především pro HNSCC asociované s HPV je typický výrazný infiltrát T a B lymfocytů a velké množství terciárních lymfoidních struktur. U HNSCC asociovaných s kouřením je pozorována větší variabilita jak v kvantitě, tak v kvalitě imunitních buněk. V souladu s poznatky současné imunoonkologie korelují počty lymfocytů v nádoru s prognózou pacientů bez ohledu na HPV status. Prognostické znaky vycházející z imunitního profilu by tak mohly přispět k lepší stratifikaci pacientů a k vytvoření deeskalačních protokolů, které by mohly významně snížit morbiditu u pacientů s předpokladem vynikající prognózy.