PICSI – selekce zralých spermií pro oplození lidských oocytů metodou ICSI


– mature sperm selection for human oocyte fertilization by ICSI method

Aim of the study:
PICSI (preselected intracytoplasmic sperm injection) utilizes the ability of mature sperm to bind to hyaluronan to select mature sperm for oocyte fertilisation by ICSI (intracytoplasmic sperm injection). It is only the mature sperm head that has a receptor for this specific attachment. The aim of this study was to determine whether PICSI increases treatment success.

Material and methods:
Special PICSI dishes (PICSI® Sperm Selec­tion Device MidAtlantic Diagnostics, Inc.) with three microdrops of hyaluronan at the bottom were used for sperm selection. During incubation, mature spermatozoa bound to the hyaluronan layer. Micromanipulation pipettes were used to collect bound sperms and these sperms were used for ICSI.

Results:
PICSI was used for mature sperm selection in 40 couples. Fertilization rate was 93.4% compared to our centre‘s standard (no sperm selection) ICSI long-term results of 89.2%. Thirty eight embryotransfers resulted in 21 clinical pregnancies (pregnancy rate 55.3%) compared to our centre’s standard ICSI long-term results of 38.2%.

Conclusion:
PICSI appears to be a useful method for improving ICSI results.

Key words:
PICSI – ICSI – spermatozoon – infertility – hyaluronan


Autoři: J. Žáková ;  E. Lousová ;  I. Crha ;  P. Ventruba ;  M. Pohanka ;  P. Nentwichová ;  H. Pochopová
Působiště autorů: Gynekologicko–porodnická klinika LF MU a FN Brno
Vyšlo v časopise: Prakt Gyn 2010; 14(4): 180-182
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Cíl práce:
PICSI (Preselected Intracytoplasmic Sperm Injection) využívá možnosti vybrat k oplozování oocytů metodou ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) zralou spermii na základě její schopnosti vázat se na hyaluronan. Receptor, který umožňuje tuto specifickou vazbu, je vytvořen na hlavičce zralé spermie. Cílem práce bylo zjistit, zda použití selektovaných spermií zlepší úspěšnost léčby.

Materiál a metodika:
Selekce spermií se provádí na speciální misce se třemi mikrokapkami hyaluronanu, na které se naváží zralé spermie. Po inkubaci jsou pomocí mikromanipulační pipety tyto spermie vybrány a použity k oplozování vajíček metodou ICSI.

Výsledky:
Oplozování oocytů pomocí PICSI bylo provedeno u 40 pacientek, procento oplození bylo 93,4 % oproti dlouhodobému průměru 89,2 % při ICSI bez selekce spermií. Z 38 transferů bylo dosaženo 21 klinických těhotenství, pregnancy rate (PR) 55,3 % oproti standardní metodě ICSI s dlouhodobým průměrem PR 38,2 %.

Závěr:
PICSI je perspektivní metodou pro zlepšení výsledků ICSI.

Klíčová slova:
ICSI – PICSI – spermie – neplodnost – hyaluronan

Úvod

Provedení analýzy spermatu před zpracováním pro oplození oocytů spočívající ve stanovení koncentrace, pohyblivosti a morfologie spermií neposkytuje informaci o schopnosti spermií oplodnit oocyt. Nezískáme informaci o dalších aspektech, jako je zralost jádra, integrita chromatinu, schopnost vazby spermie na oocyt. Relativně dobrý spermiogram nezaručuje oplození oocytu a zdárný vývoj embrya. Nehledě k faktu, že při in vitro fertilizaci je třeba oplozovat oocyty takovým spermatem, který je k dispozici a který velmi často nesplňuje ani hranici normy. Při obvyklých postupech ICSI jsou spermie pro injekci selektovány vizuálně na základě jejich morfologie a pohyblivosti. Metodou PICSI je v každém případě vybrána kvalitnější spermie, než by byla vybrána náhodně.

PICSI využívá možnosti selekce zralých spermií na základě jejich schopnosti vázat se k hyaluronanovému hydrogelu, neboť pouze hlavička zralé spermie nese receptor, který tuto vazbu umožňuje [1]. Kyselina hyaluronová je hlavní komponentou cumulus oophorus – vrstvy buněk obklopující oocyt. Chemicky se jedná o polypeptid tvořený z opakujících se jednotek N-acetylglukozaminu a kyseliny glukuronové (obr. 1). Při oplození je z akrozomu spermie uvolňován mimo jiné enzym hyaluronidáza, který rozrušuje spoje buněk corona radiata a umožňuje vazbu spermie k zona pellucida. Bylo prokázáno, že spermie selektované touto technikou jsou viabilní, bez retence cytoplazmy, mají nižší fragmentaci DNA a nižší markery apoptózy [2]. Protože zralé spermie mají výrazně nižší výskyt chromozomálních aberací, je tato metoda považována za efektivnější ve smyslu úspěšnosti oplodnění. Cílem této práce bylo zjistit, zda takto selektované spermie zvýší procento oplozených oocytů, kvalitních embryí a dosažených klinických těhotenství. 

Vzorec hyaluronanu.
Obr. 1. Vzorec hyaluronanu.

Materiál a metodika

Metoda PICSI byla provedena u pacientek našeho Centra asistované reprodukce, kterým byla doporučena buď na základě dřívějších neúspěšných cyklů po transferu embryí, nebo z důvodu velmi nízké kvality spermatu.

Spermie jsou po zhodnocení spermiogramu dle WHO [3] připravovány pro oplození. Zpracování probíhá buď standardní metodou centrifugace a swimm-up (Sperm Preparation Medium, Origio), nebo použitím SupraSperm média (Origio) pro izolaci živých spermií metodou hustotního gradientu. Po vycestování spermií z peletky na dně zkumavky do 200 µl navrstveného média (Universal IVF Medium, Origio) jsou spermie připraveny pro použití (obr. 2). Miska pro PICSI (PICSI® Sperm Selection Device MidAtlantic Diagnostics, Inc.) je polystyrenová kultivační miska se třemi mikrokapkami hyaluronanu přichycenými na vnitřní stranu dna misky. Kapky jsou pro zviditelnění označeny liniemi na vnější straně dna misky (obr. 3). Hyaluronové mikrokapky je třeba před přidáním spermií nejdříve hydratovat médiem, což způsobí nabobtnání gelu a umožní vazbu spermií. Nabobtnání a vazba spermií začne v normálním případě do 5 min. nebo dříve, starší mikrokapky potřebují pro dosažení plné vazebné kapacity hydratovat 30 min i déle. Správnou hydrataci poznáme tak, že hydrogel nabobtná a dojde k vazbě spermií. Hodnotíme po 5 min, a pokud je málo vázaných spermií, necháme inkubovat déle. Zralé spermie rozpoznají strukturu hyaluronanu a navážou se na něj. Poznáme je tak, že nevykazují progresivní pohyb ani při intenzivním pohybu bičíku. Pomocí mikromanipulační pipety jsou následně tyto spermie nasáty, přeneseny do samostatné kapky média v dostatečném počtu dle počtu připravených oocytů a použity k injekčnímu vpravení do cytoplazmy metodou ICSI (obr. 4). 

Spermie připravené k oplozování.
Obr. 2. Spermie připravené k oplozování.

Miska pro PICSI (PICSI<sup>®</sup> Sperm Selection Device MidAtlantic Diagnostics, Inc.).
Obr. 3. Miska pro PICSI (PICSI<sup>®</sup> Sperm Selection Device MidAtlantic Diagnostics, Inc.).

Selekce spermií pomocí mikromanipulační pipety.
Obr. 4. Selekce spermií pomocí mikromanipulační pipety.

Výsledky

Od července do konce října 2010 podstoupilo na našem pracovišti oplození oocytů pomocí PICSI 40 pacientek. Oplozováno bylo 152 MII oocytů, průměr na jednu pacientku 3,8 oocytů (1–12). Ve 34 případech (85,0%) byl spermiogram pod hranicí normy buď ve všech, nebo alespoň jednom parametru – koncentrace spermií (mil/ml), procento pohyblivých spermií, morfologie. U devíti párů se jednalo o první cyklus léčby, v případě jedné pacientky to byl již 7. léčebný cyklus. Oplození bylo dosaženo u 142 oocytů (FR 93,4%) oproti dlouhodobému průměru 89,2% při ICSI bez selekce. Transfer embryí byl proveden u 38 pacientek, přičemž u 21 z nich bylo dosaženo těhotenství (PR 55,3%). U standardní metody ICSI je dlouhodobě dosahováno PR 38,2% (graf 1).

Srovnání výsledků mezi metodou ICSI a PICSI.
Graf 1. Srovnání výsledků mezi metodou ICSI a PICSI.

Diskuze

Použití hyaluronanu k selekci spermií je bezpečná metoda, neboť hyaluronan se normálně nachází v ženském repro­dukčním traktu a v cumulus oophorus. Je tedy pravděpodobné, že se hyaluronan dostává do oocytu se spermií dokonce i při in vivo koncepci. Při výběru spermie navázané na hyaluronan mikromanipulační pipetou je možné, že několik molekul hyaluronanu zůstane přichycených ke spermii, nebo že několik čtverečných mikrometrů membrány spermie zůstane přichyceno k hyaluronanu. V každém případě se fertilizace takto selektovanou spermií neliší od přirozené fertilizace [2]. Dle našich zkušeností nemá metoda na fertilizaci žádný negativní vliv.

Očekávaná výhoda PICSI spočívá v tom, že u spermií selektovaných pomocí hyaluronanu je frekvence chromozomálních disomií a diploidií v normálním rozmezí, a to nezávisle na frekvenci aneuploidií v počátečním spermatu. V tomto ohledu jsou tedy vlastnosti hyaluronanu podobné vlastnostem zona pellucida. Bylo prokázáno, že takto selektované spermie jsou životaschopnější, zbavené histonů a bez apoptózy [4,5]. Paternální přínos těchto „kvalitnějších“ spermií by měl vést ke snížení výskytu potratů.

Vazba zralých spermií může také souviset s poškozením jejich membrán v souvislosti s oxidačním stresem [6,7]. Studie mohou v tomto směru přinést zajímavé výsledky.

Přesto, že se jedná o malý soubor, výsledky procenta oplozených oocytů i dosažených klinických gravidit nás vedou k závěru, že selekcí spermií metodou PICSI lze dosáhnout lepších výsledků v oplození oocytů, vývoji embryí a vyššího pregnancy rate. Při ICSI je obejita normální interakce spermie – oocyt, kde cumulus oopho­- rus a zona pellucida tvoří přirozenou bariéru pro nezralé spermie. Proto lze PICSI doporučit vždy při nízkých hodnotách spermiogramu, kde je indikována ICSI.

Závěr

PICSI je perspektivní metodou pro zlepšení výsledků ICSI. Lze ji doporučit v případě nízkého počtu oplozených oocytů, nedostatečného vývoje embryí v předchozích výkonech a v případě opakovaných těhotenských ztrát.

Studie byla podpořena grantem IGA MZ ČR NS/9661-4. 

Doručeno do redakce: 11. 11. 2010

Přijato po recenzi: 18. 11. 2010

RNDr. Jana Žáková, Ph.D.

Ing. Eva Lousová

doc. MUDr. Igor Crha, CSc.

prof. MUDr. Pavel Ventruba, DrSc.

doc. MUDr. Michal Pohanka, Ph.D.

Petra Nentwichová

Hana Pochopová

Gynekologicko–porodnická klinika LF MU a FN Brno

jzakova@fnbrno.cz


Zdroje

1. Huszar G, Ozenci CC, Cayli S et al.Hyaluronic acid binding by hunman sperm indicates cellular maturity, viability, and unreacted acrosomal status. Fertil Steril 2003; 79(3): 1616–1624.

2. Jakab A, Sakkas D, Delpiano E et al. Intracytoplasmic sperm injection: a novel selection method for sperm with normal frequency of chromosomal aneuploides. Fertil Steril 2005; 84(6): 1665–1673.

3. World Health Organization. Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. 4th edn. Cambridge University Press, 1999.

4. Cayli S, Sakkas D, Vigue L et al. Cellular maturity and apoptosis in human sperm: creatine kinase, caspase-3 and Bclx expresion in mature and diminished maturity spermatozoa. Mol Hum Reprod 2004; 10: 365–372.

5. Huszar G, Vigue L. Incomplete development of human spermatozoa is associated with incerased creatine pjosphokinase concentration and abnormal head morphology. Mol Reprod Dev 1993; 34: 292–298.

6. Crha I, Kralikova M, Melounova J. et al. Seminal plasma homocysteine, folate and cobalamin in men with obstructive and non-obstructive azoospermia. J Assist Reprod Genet, 2010; 27: 533–538.

7. Oborna I, Wojewodka G, De Sanctis JB et al. Increased lipid peroxidation and abnormal fatty acid profiles in seminal and blood plasma of normozoospermic males from infertile couples. Hum Reprod 2010; 25: 308–316.

Štítky
Dětská gynekologie Gynekologie a porodnictví Reprodukční medicína
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se