Metodické možnosti stanovení počtu CTG/CAGopakování v trinukleotidových repeticích lidskéhogenomu


Methodological Possibilities for the Determination of the Number of CTG/CAGRepeats in Triplet Repeat Units of the Human Genome

Background.
Human genome dynamic mutations are a new class of gene mutations represented by an unstablenumber of trinucleotide repeats and causing severe human hereditary neuromuscular and neurodegenerative diseases.The identification of pathological expanded alleles on the molecular level is important for clinical diagnostics.Methods and Results. For the molecular diagnostics of expanded tandem repeat trinucleotide sequences we haveintroduced a fast and efficient TP-PCR fluorescent method according toWarner et al. (1996).We have modified thisTP-PCR method for a rapid detection of expanded CTG alleles of the DMPK gene (myotonic dystrophy, MD) intoa two-level protocol; first, the heterozygote sample DNAs were selected using P1/P2 primers flanking repeat tractsand, second, the TP-PCR protocol used was focused above all on the identification of a pathological allele.A fluorescent-labelled specific primer in TP-PCR was used for the exact determination of the number of CAG repeatsof the gene IT-15 (Huntington’s disease – HD) in the diagnostically important region of the grey zone (35 to 39CAG). The reproducibility of the PCR results was demonstrated on control DNA samples with the known genotypeand, in the case of MD, also by Southern blot analysis. We have especially shown the possibility of a cheaperPCR-P1/P2 and TP-PCR protocol, which can be used, with silver staining of separated PCR products on polyacrylamidegels.Conclusions. Our experience with introducing the above-mentioned PCR methods into laboratory practice clearlydocuments the possibilities of their general applicability in the molecular diagnostics of hereditary diseasescharacterised by instability of the trinucleotide repeat tracts.

Key words:
Neurodegenerative disease, myotonic dystrophy, Huntington's disease, DMPK gene, IT-15gene, trinucleotide repeats, expanded trinucleotide, Triplet Primed PCR.


Autoři: M. Falk;  U. Froster 1;  M. Vojtíšková
Působiště autorů: Biofyzikální ústav AV ČR, Brno 1Institut für Humangenetik, Universität Leipzig, SRN
Vyšlo v časopise: Čas. Lék. čes. 2003; : 609-614
Kategorie: Články

Souhrn

Východisko.
Dynamické mutace lidského genomu jsou novou třídou genových mutací, reprezentovaných nestabilnímpočtem trinukleotidových opakování, způsobující závažná dědičná neuromuskulární a neurodegenerativníonemocnění u lidí. Identifikace patologických expandovaných alel na molekulární úrovni je důležitá pro klinickoudiagnózu.Metody a výsledky. Pro molekulární diagnostiku expandovaných tandemových repeticí trinukleotidových sekvencíjsme zavedli efektivní TP-PCR metodu podleWarnera et al. (13). Pro rychlou detekci expandovaných CTG alel genuDMPK (myotonická dystrofie –MD) jsme tutometodu modifikovali do dvoufázového protokolu; nejprve byly pomocíPCR selektovány vzorky DNA heterozygotů s využitím primerů P1 a P2, ohraničujících trakt s repeticemi, druhévyšetření metodou TP-PCR bylo zaměřeno především na identifikaci patologické alely. Fluorescenčně značenýspecifický primer v TP-PCR byl použit pro přesné určení počtu CAGopakování v genu IT-15 (Huntingtonova choroba– HD) v diagnosticky důležité oblasti šedé zóny (rozmezí 35–39 CAG). Reprodukovatelnost výsledků PCR bylaověřena na kontrolních vzorcích DNA o známém genotypu a v případě MD také Southernovou hybridizací. Zejménajsme ukázalimožnost levnějšího PCR-P1/P2 a TP-PCR protokolu, který využívá barvení PCRproduktů separovanýchna polyakrylamidových gelech stříbrem.Závěr. Naše zkušenosti se zavedenímvýše uvedených PCRmetod do laboratorní praxe dokumentují obecnémožnostijejich významného uplatnění pro molekulární diagnostiku dědičných chorob charakterizovaných nestabilitou v trinukleotidovýchtraktech.

Klíčová slova:
neurodegenerativní onemocnění, myotonická dystrofie,Huntingtonova chorea, genDMPK, genIT-15,trinukleotidové repetice, expenze trinukleotidů, Triplet Primed PCR.

Plné znění tohoto článku není v digitalizované podobě.
V případě zájmu kontaktujte NTO ČLS JEP, které vám může poskytnout sken časopisu.

Štítky
Adiktologie Alergologie a imunologie Angiologie Audiologie a foniatrie Biochemie Dermatologie Dětská gastroenterologie Dětská chirurgie Dětská kardiologie Dětská neurologie Dětská otorinolaryngologie Dětská psychiatrie Dětská revmatologie Diabetologie Farmacie Chirurgie cévní Algeziologie Dentální hygienistka

Článek vyšel v časopise

Časopis lékařů českých


Nejčtenější v tomto čísle
Kurzy Podcasty Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu, se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se