Faktory ovlivňující rezistenci k antibiotikům u Haemophilus influenzae

Souhrn

Žemličková H, Jakubů V, Mališová L, Vrbová I, Čechová M. Faktory ovlivňující rezistenci k antibiotikům u Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae je běžnou součástí mikroflóry horního respiračního traktu, zároveň je také jedním z hlavních původců širokého spektra onemocnění od nekomplikovaných infekcí dýchacích cest až po život ohrožující infekce. Tradičními léky pro terapii hemofilových infekcí jsou betalaktamová antibiotika. Rezistence k betalaktamům je u hemofilů způsobena produkcí betalaktamázy nebo vzniká na podkladě mutací v genu ftsI, kódujícím penicilin-binding protein 3. Tyto kmeny jsou označované jako rPBP3 (genotyp vykazující mutaci v transpeptidázové oblasti ftsI). Podle výsledků surveillance antibiotické rezistence vzrůstá v České republice podíl H. influenzae kmenů rPBP3 genotypu. Existuje předpoklad, že cefuroxim stimuluje vznik rPBP3 H. influenzae více v porovnání s aminopeniciliny. V České republice se zvýšil podíl rPBP3 kmenů v průběhu stejného období, kdy spotřeba cefuroximu vzrostla dvojnásobně.

Cílem projektu NU21-09-00028, Charakterizace kmenů Haemophilus influenzae s neenzymatickou rezistencí vůči betalaktamovým antibiotikům v České republice (2020–2024), bylo posouzení možných rizikových faktorů, které souvisí s vývojem neenzymatického typu rezistence u H. influenzae. Fylogenetická analýza neprokázala rozšíření specifického klonu. In vitro zkoumání vlivu ampicilinu a cefuroximu na selekci mutací genu ftsI odhalilo rozdíly v selekčním potenciálu obou antibiotik. Ukázalo se, že obě antibiotika mají potenciál pro vznik mutací v PBP3, ale expozice cefuroximu má v porovnání s ampicilinem tendenci generovat mutace častěji. Rovněž u kmenů H. influenzae pasážovaných ve vzestupných koncentracích cefuroximu došlo k vyššímu nárůstu minimální inhibiční koncentrace v porovnání s ampicilinem. Nárůst prevalence neenzymatické rezistence k betalaktamům v České republice tedy pravděpodobně spíše souvisel s narůstající spotřebou cefuroximu a zvýšeným selekčním tlakem.

Klíčová slova:

Haemophilus influenzae – antibiotická rezistence – cefuroxim

Úvod

Haemophilus influenzae patří mezi růstově náročné gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinky. H. influenzae je běžnou součástí mikroflóry horního respiračního traktu, zároveň je také jedním z hlavních původců širokého spektra onemocnění od nekomplikovaných infekcí dýchacích cest až po život ohrožující infekce (meningitida, epiglotitida). Kmeny H. influenzae mohou produkovat polysacharidové pouzdro nebo mohou být neopouzdřené. Invazivní infekce typu meningitidy či epiglotitidy jsou obvykle způsobeny H. in-
fluenzae typu b (Hib), neopouzdřené kmeny, označované jako tzv. netypovatelné, jsou spojené především s neinvazivními infekcemi horního respiračního traktu (akutní zánět středouší, sinusitida, konjunktivitida, akutní exacerbace chronické bronchitidy). Zavedení plošného očkování proti Hib minimalizovalo výskyt závažných hemofilových invazivních onemocnění a v současnosti je většina infekcí vyvolána neopouzdřenými (netypovatelnými) hemofily.⁽¹⁾

Lékem volby hemofilových respiračních infekcí jsou aminopeniciliny. Zatímco rezistence k cefotaximu (resp. k ceftriaxonu), které jsou rezervovány pro terapii závažných invazivních infekcí, je celosvětově velice vzácná, výskyt rezistence k aminopenicilinům je v některých státech poměrně frekventní.^(2–5) Na rezistenci k betalaktamům se u H. in-
fluenzae podílí 2 hlavní mechanismy: enzymatická degradace antibiotika pomocí betalaktamázy a tzv. neenzymatická rezistence vznikající na podkladě bodových mutací v genu ftsI, kódujícím protein PBP3 (penicillin-binding protein).^(6,7) V České republice se zvýšil podíl kmenů s neenzymatickou rezistencí vůči betalaktamům v průběhu stejného období, kdy spotřeba cefuroximu vzrostla dvojnásobně.⁽⁸⁾ Narůstající podíl kmenů mohl být zapříčiněn zvýšenou spotřebou cefuroximu, nelze také vyloučit klonální šíření genotypu, který má lepší schopnost vyvolat infekci.

Projekt NU21-09-00028 (2020–2024): Charakterizace kmenů Haemophilus influenzae s neenzymatickou rezistencí vůči betalaktamovým antibiotikům v České republice, podpořený Agenturou pro zdravotnický výzkum České republiky (AZV ČR), byl zaměřený na posouzení možných rizikových faktorů, které souvisí s vývojem neenzymatického typu rezistence u H. influenzae. Cílem tohoto projektu bylo zjistit, zda se nárůst rezistence vůči betalaktamům v České republice, vzniklý na podkladě méně obvyklého mechanismu rezistence, odehrál v důsledku klonální expanze rPBP3 H. influenzae, nebo je reakcí populace hemofilů na narůstající spotřebu cefuroximu. Souhrnné sdělení popisuje výsledky projektu.

Rezistence k betalaktamům u H. influenzae

Rezistence k aminopenicilinům je u hemofilů tradičně spojena především s produkcí betalaktamázy, která je inhibována kyselinou klavulanovou nebo sulbaktamem. Kmeny se označují jako BLPAR (betalaktamáza pozitivní ampicilin rezistentní). U H. influenzae byl popsán výskyt dvou různých typů betalaktamáz, TEM-1 a ROB-1.⁽⁴⁾ Oba tyto enzymy jsou přenášené plazmidy a jsou produkovány konstitutivně ve velkém množství.

Rezistence na ampicilin způsobená neezymatickým mechanismem byla popsána v osmdesátých letech.⁽⁷⁾ Neenzymatická rezistence vzniká v důsledku snížené afinity PBP3 k betalaktamům. PBP3 jsou kódovány genem ftsI. Jeho produktem je transpeptidáza FtsI, která se podílí na syntéze peptidoglykanů. Proteiny Fts obecně hrají roli při tvorbě divizomu (strukturální kruh v buňce připojený k cytoplazmatické membráně) a také při tvorbě septa během buněčného dělení. Mutace v genu ftsI vedou k substitucím aminokyselin (AK) v transpeptidázové oblasti proteinu PBP3. Důsledkem těchto substitucí je snížení afinity aminopenicilinů a cefalosporinů k vazbě na tyto proteiny. Izoláty vykazující tento typ rezistence jsou historicky známé jako betalaktamáza negativní ampicilin rezistentní (BLNAR). Termín BLNAR je však podle European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) nevhodný, protože termín BLNAR zahrnuje nejen takto původně označované kmeny s rezistencí k aminopenicilinům a neprodukující betalaktamázu, ale i kmeny, které mají specifický typ mutace ovlivňující zejména citlivost k cefalosporinům 2. či 3. generace.⁽⁸⁾ Nověji jsou kmeny označované jako rPBP3 (genotyp vykazující mutaci v transpeptidázové oblasti ftsI) a na rozdíl od kmenů produkujících betalaktamázu není jejich snížená citlivost na aminopeniciliny ovlivněna inhibitory betalaktamázy.

Fenotypová detekce rPBP3 H. influenzae

Fenomén neenzymatické rezistence u H. influenzae je rovněž komplikován jeho nesnadným fenotypovým průkazem. rPBP3 izoláty se mohou fenotypově jevit k betalaktamům rezistentní i citlivé, identifikace mutace je možná pouze za použití molekulárně biologických metod (PCR průkaz mutace/mutací genu ftsI, případně jeho sekvenace).

K fenotypovému testování citlivosti vůči antibiotikům se obvykle používá standardizovaná disková difuzní metoda (DDM). Principiálně využívá difuze antibiotika z papírového disku na agarové půdě a případné zábrany růstu bakterií kolem disku v závislosti na vnímavosti k testovanému antibiotiku. Dle standardů EUCAST je pro screening rPBP3 H. influenzae doporučeno testování pomocí disku s penicilinem (1 J), avšak v Národní referenční laboratoři pro antibiotika (NRL pro ATB) byly opakovaně zachyceny klinické izoláty hemofilů, u kterých testování penicilinu rPBP3 fenotyp neodhalilo.⁽⁹⁾ Při testování různých betalaktamových antibiotik (penicilin, ampicilin, cefuroxim a amoxicilin/klavulanát) a jejich schopnosti detekovat rPBP3 H. influenzae byly u výše zmíněných antibiotik správně identifikovány rPBP3 u 91,5 %, 94,4 %, 89,5 % a 70,6 % izolátů.⁽¹⁰⁾ Screening za použití ampicilinového disku byl spolehlivější v porovnání s diskem penicilinu, který je doporučován standardy EUCAST. U specificky vybrané populace kmenů byla hodnocena interpretační shoda mezi stanovenou hodnotou minimální inhibiční koncentrace (MIC) a velikostí inhibiční zóny na agarech od různých výrobců a zároveň schopnost jednotlivých agarů detekovat přítomnost mutovaného PBP3 u problematických kmenů.⁽¹¹⁾ Kategorická shoda (tedy klinická intepretace výsledku testování citlivosti v kategorii 1. citlivý, 2. citlivý, zvýšená expozice nebo 3. rezistentní) při porovnání DDM a vyšetření MIC bujónovou mikrodiluční metodou u ampicilinu a cefuroximu byla pouze 71,1 %, resp. 83,8 %. Výsledky celkově odhalují, bez ohledu na agar/výrobce, nízkou úroveň interpretační shody mezi použitými metodami u námi testované rPBP3 populace H. influenzae.

Je zřejmé, že identifikace rPBP3 kmenů je nesnadná, a proto lze předpokládat, že skutečný výskyt tohoto typu rezistence může být vyšší. Další problematickou oblastí je samotná klinická interpretace nálezu. Z dosavadních pozorování totiž vyplývá, že nalezená mutace nemusí být vždy nutně fenotypově vyjádřena a rutinní testování citlivosti k aminopenicilinům spolehlivě neodliší rPBP3 kmeny od citlivé populace. I z těchto důvodů je u H. influenzae při perorální antibiotické léčbě doporučeno použití vyšších terapeutických dávek příslušných antibiotik (amoxicilin, amoxicilin/klavulanát, případně cefuroxim).⁽⁹⁾

Epidemiologie rezistence vůči betalaktamům u H. influenzae

Oba mechanismy rezistence, tedy enzymatický i neenzymatický, se mohou vzájemně kombinovat a izoláty s mutací PBP3 a současně produkující betalaktamázu byly zachyceny i v NRL pro ATB. Frekvence výskytu neenzymatické rezistence k aminopenicilinům celosvětově narůstá. Výsledky pravidelného sledování antibiotické rezistence u H. influenzae způsobujícího infekce dýchacích cest (sinusitida, akutní zánět středního ucha, komunitní pneumonie), které každoročně provádí NRL pro ATB, ukazují rostoucí trend výskytu ampicilinové rezistence u kmenů H. influenzae.⁽¹²⁾ Od roku 2010 došlo k celkovému nárůstu rezistence H. influenzae na ampicilin z 8,6 % v roce 2010 na 20,4 % v roce 2018. Ve stejném období se podíl kmenů rPBP3 zvýšil z 0,8 % na 7,9 % (obr. 1). Poslední údaje z roku 2024 potvrzují rezistenci k ampicilinu u 24,6 % kmenů, rezistence k amoxicilin/klavulanátu dosáhla 8,5 %. Zatímco míra výskytu BLPAR je tedy téměř konstantní, podíl kmenů rPBP3 se od roku 2010 zvýšil desetinásobně. Od roku 2015 jsou v NRL pro ATB potvrzeny i kmeny rezistentní na cefotaxim i na karbapenemy.⁽¹³⁾

Vznik a šíření neenzymatické rezistence u H. influenzae

Bylo prokázáno, že expozice cefuroximu má stimulační účinek na nárůst kmenů rPBP3 H. influenzae ve srovnání s amoxicilinem/kyselinou klavulanovou.⁽¹⁴⁾ V České republice se zvýšil podíl rPBP3 kmenů v průběhu stejného období, kdy spotřeba cefuroximu vzrostla dvojnásobně (z 1,2 definovaných denních dávek [DDD] na 1000 obyvatel v roce 2010 na 2,3 DDD na 1000 obyvatel v roce 2017).⁽¹⁵⁾ Narůstající podíl rPBP3 kmenů mohl být zapříčiněn zvýšenou spotřebou cefuroximu, nelze také vyloučit klonální šíření genotypu rPBP3 H. influenzae s vyšším klinickým významem.

Sekvenační analýza a následná fylogenetická analýza neprokázaly souvislost mezi dominantním šířením specifického rezistentního klonu a vzestupem podílu neenzymatické rezistence u H. influenzae v České republice.⁽¹⁶⁾ Celkem 228 rPBP3 H. influenzae izolátů shromážděných v NRL pro ATB v letech 2010–2018 bylo sekvenováno pomocí MLST (multi-locus sequence typing). Kmeny patřily do 74 různých sekvenačních typů (ST). Pouze ve čtyřech ST dosáhl počet kmenů 10 nebo více izolátů: ST1034 (n = 49, 21,5 %), ST103 (n = 17, 7,5 %), ST14 (n = 13, 5,7 %) a ST1218 (n = 13, 5,7 %). ST1034 je nejčetnější od roku 2014 (31,6 %), s oscilací výskytu v následujících letech mezi 15–28 %.

U rPBP3 izolátů byla sekvenována oblast 977-1597 bp (base pair) genu ftsI (621bp fragment) za účelem ověření přítomnosti mutací v transpeptidázové oblasti PBP3 podle protokolu z PubMLST.org. Nukleotidová sekvence byla převedena na sekvenci AK v programu Bionumerics 7.6.2 (Applied Maths, Ghent, East Flanders, Belgie) a porovnána s AK sekvencí (pozice 326–532) nemutovaného referenčního kmene H. influenzae ATCC 51907 (GenBank přístupové číslo L42023). U těchto kmenů bylo zjištěno 23 různých (AK) substitucí: V329I, D350N, S357N, A368T, M377I, S385T, A388V, L389F, P393L, A437S, I449V, G490E, I491V, R501L, A502S, A502T, A502V, V511A, R517H, I519L, N526K, A530S a T532S. Nejčetnější kombinace záměn u rPBP3 betalaktamáza negativních kmenů byly AK substituce D350N, M377I, A502V, N526K. U kmenů s touto nejčastější kombinací mutací (n = 80) bylo identifikováno 11 různých ST, z nichž dominovalo ST1034 (n = 47; 58,8 %).

Použití antibiotik může významně přispívat ke vzniku a udržení rezistence. Rezistentní bakterie mohou být selektovány jak při vysokých koncentracích antibiotik používaných terapeuticky, tak i při mnohem nižších (tzv. subinhibičních) koncentracích antibiotik. Pro porovnání potenciálu betalaktamů na indukci rezistence u H. influenzae jsme vystavili klinické kmeny genotypů sPBP3 (citlivá populace bez mutací v transpeptidázové oblasti ftsI) a rPBP3 (iniciální mutace N526K) subinhibičním koncentracím ampicilinu a cefuroximu. Celkem 10 kmenů (5 sPBP3 a 5 rPBP3) bylo sériově pasážováno po dobu 30 dnů s jednonásobným zvýšením koncentrace antibiotika každých 5 dnů.⁽¹⁷⁾

Zkoumání vlivu ampicilinu a cefuroximu na selekci aminokyselinových záměn genu ftsI odhalilo rozdíly v selekčním potenciálu obou antibiotik. U kmenů H. influenzae pasážovaných ve vzestupných koncentracích cefuroximu došlo k vyššímu nárůstu MIC v porovnání s ampicilinem. U pasážovaných kmenů se také in vitro objevily nové mutace, které dosud nebyly u klinických izolátů popsány. Cefuroxim indukoval širší spektrum AK záměn v oblastech pokrývajících téměř polovinu PBP3, zatímco ampicilinem indukované záměny se vyskytly pouze v poslední šestině primární sekvence PBP3. Ukázalo se tedy, že obě antibiotika mají potenciál pro vznik mutací v PBP3, ale expozice cefuroximu má v porovnání s ampicilinem tendenci generovat mutace častěji, zejména u kmenů s již existující základní mutací N526K.

Morfologické změny rPBP3 H. influenzae kmenů pasážovaných v antibioticích

U kmenů kultivovaných v obou antibioticích byly pod optickým mikroskopem nalezeny změny v morfologii buněk. Zaměřili jsme se na korelaci mezi detaily změněné morfologie (výstup z elektronového mikroskopu) a změnami v genech podílejících se na septaci a tvorbě buněčné stěny.⁽¹⁸⁾
Ve srovnání s kontrolním kmenem H. influenzae ATCC 49766, byl u kmenů po 30 dnech kultivace s betalaktamy pozorován světelným mikroskopem vláknitý tvar hemofilů, a to po expozici ampicilinu i cefuroximu (obr. 2). Kvantitativní analýza velikosti buněk transmisním elektronovým mikroskopem ukázala, že ošetřené buňky se prodloužily podél obou os, délka krátké osy se zvětšila přibližně o 28 % (z 0,767 μm na 1,06 μm), délka dlouhé osy se zvětšila o 54 % (z 1 μm na 2,175 μm). V porovnání s kontrolním kmenem se hemofily v přítomnosti těchto antibiotik nedokázaly od sebe oddělit (obr. 3). Na konci kultivace potvrdila analýza sekvenování celého genomu testovaných izolátů de novo mutace v genech zodpovědných za morfologii buněk. Různé sady mutací byly nalezeny v genu ftsI (peptidoglykan D, D-transpeptidáza FtsI, PBP3), mreB (protein určující tvar buňky MreB), mreC (protein určující tvar buňky MreC) a mrdA (peptidoglykanová D,D-transpeptidáza MrdA). Jednotlivé mutace byly zjištěny také v genech mrdB (peptidoglykanová glykosyltransferáza MrdB) a rodA (peptidoglykanová glykosyltransferáza RodA). Ampicilin vyvolal mutace především v genech ftsI, mreB, mreC a mrdA, zatímco cefuroxim způsobil mutace také v genech mrdB, mltC a rodA. Vzestup MIC betalaktamů lze tedy korelovat i s mutacemi, které primárně probíhají mimo dominantní transpeptidázovou oblast ftsI.

Závěr

Fylogenetická analýza rPBP3 kmenů neprokázala rozšíření specifického dominantního klonu, naopak rPBP3 populace byla značně heterogenní. Nárůst prevalence neenzymatické rezistence k betalaktamům v České republice tedy pravděpodobně spíše souvisel s narůstající spotřebou širokospektrých betalaktamových antibiotik (zejména cefuroximu) a zvýšeným selekčním tlakem.

Antibiotická rezistence je značně dynamický fenomén a její vznik může být ovlivněn mnoha různými faktory. Účelné předepisování antibiotik je jedním ze zásadních nástrojů boje s rezistencí vůči antibiotikům. Důležitá je nejen celková spotřeba antibiotik, ale i volba konkrétních skupin, protože potenciál antibiotik stimulovat rozvoj rezistence se liší. Tento fakt zohledňuje i Světová zdravotnická organizace (WHO), která zavedla klasifikaci antibiotik AWaRe.⁽¹⁹⁾ Jedná se o akronym složený z názvů tří skupin antibiotik: Access, Watch a Reserve. Cílem kategorizace antibiotik WHO AWaRe je poskytnout nástroj pro bezpečné a efektivní užívání antibiotik. Zatímco antibiotika ze skupiny Access jsou antibiotika základní, s relativně úzkým spektrem účinku (např. penicilin V, amoxicilin, doxycyklin), do skupiny Watch (např. cefuroxim, makrolidy, fluorochinolony) a Reserve (např. linezolid, kolistin, tigecyklin) jsou řazena antibiotika, která obvykle nepředstavují první volbu a jejich preskripce by měla být vymezena pouze pro situace, kdy antibiotika ze skupiny Access, resp. Watch u skupiny Reserve, nelze použít.

V roce 2023 přijala Rada Evropské unie doporučení Rady o zintenzivnění opatření EU v boji proti antimikrobiální rezistenci v rámci přístupu jednoho zdraví (2023/C 220/01).⁽²⁰⁾
Doporučení obsahuje i pět konkrétních a měřitelných cílů, jsou tedy dobrým nástrojem sledování pokroku souvisejícího s prevencí a snižováním antibiotické rezistence do roku 2030. Dva z těchto cílů se soustředí na optimalizaci používání antibiotik, pokles celkové spotřeby antibiotik by měl být zároveň provázen kvalitativní změnou spektra používaných antibiotik. Česká republika by měla v souladu s doporučením do roku 2030 snížit celkovou spotřebu antibiotik u lidí (v definované denní dávce na 1000 obyvatel na den) o 9 % ve srovnání s referenčním rokem 2019 a zabezpečit, aby do roku 2030 alespoň 65 % celkové spotřeby u lidí představovala antibiotika náležející do skupiny antibiotik skupiny Access. Tyto cíle se zatím nedaří plnit. Jak vyplývá z posledních dostupných údajů spotřeby antibiotik z roku 2023, v České republice ve srovnání s rokem 2019 v roce 2023 stoupla celková spotřeba o 9 %, podíl skupiny Access tvoří 60,6 %.⁽²¹⁾ Ačkoliv celková spotřeba antibiotik se v České republice stále drží pod evropským průměrem, špatnou zprávou je narůstající trend spotřeby antibiotik a preference širokospektrých antibiotik, i když pro jejich používání není při léčbě zejména komunitních infekcí racionální zdůvodnění.

Jak potvrzují i naše výsledky, nevhodná spotřeba antibiotik má reálné negativní dopady. K praktickým výstupům grantového projektu proto patří snaha o rozšíření povědomí o možných rizicích souvisejících s nadužíváním cefuroximu.