Zavedení DNA čipu do molekulární diagnostiky Wilsonovy choroby


Autoři: L. Gojová ;  E. Jansová ;  S. Pouchlá ;  L. Fajkusová
Působiště autorů: Masarykova univerzita Brno, Lékařská fakulta, Interní hematoonkologická klinika FN Brno, Centrum molekulární biologie a genové terapie
Vyšlo v časopise: Čas. Lék. čes. 2009; 148: 137-140
Kategorie: Vyšetřovací metody

Souhrn

Východisko.
Wilsonova choroba (WCH) je závažné, autozomálně recesivní onemocnění, jehož podstatou jsou mutace v ATP7B genu, který kóduje měď-specifickou ATPázu. U postižených jedinců dochází k poruše vylučování toxické mědi z organismu a k jejímu hromadění v tělesných orgánech. Molekulární diagnostika Wilsonovy choroby je důležitou součástí stanovení správné diagnózy. Cílem práce bylo navrhnout a zvalidovat genotypovací DNA čip, který umožňuje současně analyzovat 87 mutací a 17 polymorfismů v ATP7B genu.

Metody a výsledky.
V první fázi validace bylo testováno 97 WCH pacientů se známým genotypem a 46 vzorků uměle připravených mutagenezí. Všechny analyzované sekvenční varianty byly detekovány se 100% správností. Ve druhé fázi validace byly testovány reálné vzorky WCH suspektních pacientů. Dosud jsme zanalyzovali 58 nepříbuzných pacientů, z nichž u 10 byla čipovou analýzou potvrzena diagnóza WCH, u 13 byla nalezena jedna mutace a u 35 žádná. U pacientů s jednou nebo žádnou detekovanou mutací následovalo přímé sekvenování kódující oblasti genu ATP7B, přičemž nebyla nalezena žádná další kauzální mutace.

Závěry.
Wilsonův čip se jeví jako rychlá a spolehlivá vyhledávací metoda mutací v ATP7B genu.

Klíčová slova:
ATP7B gen, APEX metoda, DNA čip, molekulární diagnostika, Wilsonova choroba.

ÚVOD

Wilsonova choroba (WCH, MIM 277900) je závažná, autozomálně recesivní porucha metabolismu mědi, způsobená deficitem měď-specifické ATPázy (ATP7B). Průměrná incidence WCH se udává 1 na 35 000 živě narozených dětí. Fyziologickou úlohou ATP7B proteinu je transport mědi v organismu – inkorporace mědi do ceruloplazminu a její vylučování žlučí (1). ATP7B protein je exprimován zejména v játrech, v menší míře také v mozku, ledvinách a placentě. V případě nefunkčního proteinu dochází v tělesných orgánech k akumulaci toxické mědi, což může vést až k nevratnému poškození jater, neurologickému selhání a následné smrti, pokud není zahájena správná léčba (2, 3). Choroba se manifestuje nejčastěji ve druhé dekádě života, což znesnadňuje její včasné odhalení. Wilsonovu chorobu lze diagnostikovat na základě kombinace klinických příznaků, biochemických parametrů a molekulárně biologické analýzy ATP7B genu (4–6). Kaiser-Fleischerův prstenec v oku, který vzniká ukládáním mědi v rohovce a je typickým příznakem WCH, však nebývá častokrát zřetelný (7). Biochemická diagnostika WCH je založena na zvýšeném vylučování mědi močí po podání penicillaminu (> 5 μmol/24 hod.), nízké sérové hladině ceruloplazminu (< 0,2 g/L), volné mědi v séru (< 14 μmol/L) a zvýšeném obsahu mědi v jaterní sušině (> 250 μg/g). Nicméně, někteří postižení jedinci mohou být od zdravých heterozygotů – přenašečů biochemicky nerozeznatelní (8). Nejvíce specifickým přístupem ke stanovení diagnózy WCH se jeví molekulárně genetická analýza ATP7B genu. ATP7B gen je lokalizován na dlouhém raménku chromozomu 13 v oblasti 13q14.3 a obsahuje 21 exonů (9, 10). Kóduje protein o 1465 aminokyselinách s celkovou velikostí 157 kDa (11). Do současnosti bylo v tomto genu popsáno více než 400 mutací, z nichž většina je etnicky specifických (12). Převažující mutací v bělošské populaci je p.H1069Q (c.3207C>A), která vede ke ztrátě schopnosti proteinu vázat ATP (13). V současné době se molekulární analýza ATP7B genu opírá o klasickou metodu detekce nejčastějších mutací v jednotlivých populacích restrikčním štěpením a následné přímé sekvenování. Tento přístup je poměrně neefektivní, časově i finančně nákladný. S cílem zefektivnit molekulární diagnostiku WCH jsme navrhli genotypovací DNA čip pro detekci 87 vybraných mutací a 17 polymorfismů v ATP7B genu využívající technologie APEX (Arrayed Primer Extension).

Soubor nemocných a použité metody

Soubor pacientů

Pomocí Wilsonova čipu byla provedena analýza 97 nepříbuzných WCH pacientů, jejichž genotyp byl předem stanoven jinou, molekulárně-biologickou metodou a 58 nepříbuzných pacientů suspektních na WCH. Všichni pacienti pocházeli z České republiky a Slovenské rapubliky a byli zasláni k molekulární analýze WCH z různých klinických pracovišť. Od všech pacientů byl obdržen informovaný souhlas s molekulárně-biologickou analýzou ATP7B genu. DNA byla izolována z periferní krve vysolovací metodou.

DNA čip

Wilsonův čip umožňuje simultánní detekci 87 mutací a 17 polymorfismů v ATP7B genu, které kdy byly detekovány u WCH pacientů v naší laboratoři a které jsou frekventní v blízkých populacích. Na čipu, jehož povrch je speciálně upraven 3-aminopropyl-trimethoxysilanem + 1,4-fenylendiisothiokyanátem, jsou za vzniku kovalentní vazby natištěny specificky navržené krátké oligonukleotidové sondy modifikované amino-skupinou pro detekci všech vybraných sekvenčních variant genu. Každá mutace/polymorfismus je determinována dvěma různými sondami (sense/antisense), kromě nejčastější mutace p.H1069Q, pro jejíž detekci jsou na čip umístěny sondy čtyři. Sondy jsou navrženy dle standardní „wild type“ sekvence ATP7B genu tak, aby se jejich 3‘OH konec nacházel vedle místa sekvenční změny, kterou chceme na čipu analyzovat. Teplota tání, délka a tvorba sekundárních struktur jsou dalšími důležitými parametry sond. Principem analýzy mutací na Wilsonově čipu je APEX (Arrayed Primer Extension) reakce, při níž dochází k prodlužování sond vždy přesně o 1 fluorescenčně značený nukleotidový terminátor (místo mutace/polymorfismu) dle sekvence komplementárně nahybridizovaného úseku analyzovaného DNA vzorku. Touto metodou lze na čipu analyzovat konkrétní substituce, malé inzerce a delece v ATP7B genu.

Výsledky

Validace čipu

Pro možnost využití Wilsonova čipu jako screeningové metody v rutinní diagnostice WCH bylo nutné provést jeho validaci, která spočívala v prvé řadě v otestování funkčnosti jednotlivých sond a schopnosti správně detekovat mutační status. Další podstatnou součástí validace bylo testování neznámých vzorků.

V první fázi validace čipu byla testována schopnost navržených oligonukleotidových sond správně detekovat jednotlivé mutace a polymorfismy ATP7B genu. Byl vybrán soubor 97 WCH pacientů se stanoveným genotypem. Celkem bylo na DNA čipu u vybraného souboru detekováno 43 různých mutací a 15 polymorfismů v homo/heterozygotní formě se 100% správností. Tímto krokem byla otestována funkčnost 118 oligonukleotidových sond (56 %) přítomných na čipu. 13 sond (11 %) vykazovalo slabý nebo žádný signál. Každou testovanou mutaci/polymorfismus bylo ale možné spolehlivě určit alespoň jedním oligonukleotidem (sense nebo antisense) (14). Pro otestování zbylých sond bylo připraveno 46 DNA vzorků s vnesenou mutací či polymorfismem do ATP7B genu. Z celkového počtu 92 oligonukleotidových sond navržených pro detekci frekventních mutací v jiných populacích, 10 sond (11 %) vykazovalo slabý nebo žádný signál. Nicméně, všechny tyto vnesené sekvenční změny byly na čipu detekovány se 100% správností.

Ve druhé fázi validace bylo pomocí Wilsonova čipu otestováno 58 DNA vzorků nepříbuzných, WCH suspektních pacientů. Z celkového počtu 116 analyzovaných alel bylo nalezeno 33 mutantních. Zbytek alel byl sekvenován bez nálezu dalších mutací. Wilsonova choroba byla potvrzena u 10 pacientů, 13 pacientů byli heterozygotní přenašeči jedné mutace a u 35 pacientů nebyla nalezena žádná mutace v ATP7B genu (tab. 1, obr. 1).

Tab. 1. Genotypy nalezené čipovou analýzou u WCH suspektních pacientů
Genotypy nalezené čipovou analýzou u WCH suspektních pacientů

Výstup z programu Genorama: Výsledek čipové analýzy – pacient 9 s genotypem p.E1064K/p.V1239G
Obr. 1. Výstup z programu Genorama: Výsledek čipové analýzy – pacient 9 s genotypem p.E1064K/p.V1239G

Diskuze

Současným trendem nejen v molekulární diagnostice je miniaturizace analýz a nástup čipové technologie. Genotypovací čipy představují vhodný nástroj pro detekci širokého spektra mutací a polymorfismů v genech v rámci jedné analýzy (15, 16). Cílem naší práce bylo urychlit a zjednodušit molekulární diagnostiku Wilsonovy choroby využitím genotypovacího čipu na bázi APEX pro detekci sekvenčních změn v ATP7B genu. Principem APEX technologie je Sangerovovo dideoxysekvenování. Na čipu dochází k prodlužování imobilizovaných sond vždy právě o jeden fluorescenčně značený terminátor – dideoxynukleotid (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddUTP) komplementárně dle hybridizovaného úseku analyzovaného DNA vzorku. Každý ze čtyř terminátorů je označen jinou fluorescenční barvou. Podle toho, který dideoxynukleotid se naváže na danou mutačně-specifickou sondu, lze detekovat sekvenční změny v DNA. APEX technologie umožňuje analyzovat pouze vybrané spektrum známých mutací, nikoliv mutace nové. Nicméně je možné tuto metodu využít pro detekci jak substitucí, tak i delecí a inzercí jednoho či více nukleotidů. Současně je také možné pomocí jedné sondy detekovat více sekvenčních variant. Výhodou APEX metody je její rychlost, jednoduchost a přesnost (17–22). Pro analýzu na Wilsonově čipu bylo vybráno 87 mutací a 17 polymorfismů ATP7B genu. Vybraný mutační panel zahrnoval mutace vyskytující se v české populaci, mutace prevalentní u jiných etnik a polymorfismy pro haplotypovou analýzu (23–29). Na každém čipu byly natištěny kontrolní sondy pro zajištění správného průběhu APEX reakce. Validace Wilsonova čipu, která spočívala v otestování funkčnosti jednotlivých sond, ukázala, že z celkového počtu 210 oligonukleotidových sond natištěných na čipu, 23 sond (11 %) vykazovalo slabý nebo žádný signál. Současně prokázala schopnost správně určit všechny vybrané mutace/polymorfismy. Každá mutace byla spolehlivě detekována alespoň jednou z dvojice specifických sond. Fakt, že některé sondy vykazovaly velmi slabý nebo žádný signál, souvisí s největší pravděpodobností se skutečností, že determinují mutace/polymorfismy nacházející se v sekvenci ATP7B genu s vysokým obsahem GC či AT párů, případně repetitivních oblastí (21). Problém se správnou funkčností může být spojen také s tvorbou sekundárních struktur, délkou a teplotou tání sond. Každou mutaci detekovanou na čipu je nicméně nutné vždy nezávisle ověřit jinou molekulárně biologickou metodou (např. restrikčním štěpením nebo sekvenční analýzou). Zavedením genotypovacího čipu do molekulární diagnostiky Wilsonovy choroby jsme rozšířili prvotní screeningový panel mutací v ATP7B genu z 5 na 87 (14). Příprava vzorku formou multiplexové polymerázové řetězové reakce i samotná APEX reakce na čipu jsou otázkou několika hodin. V případě, že jsou na čipu nalezeny dvě mutace, je diagnóza Wilsonovy choroby potvrzena. Pokud je čipovou analýzou detekována pouze jedna mutace, je nutné v molekulární diagnostice WCH pokračovat přímým sekvenováním genu ATP7B. V případě, že na čipu není prvotním screeningem nalezena žádná mutace, měla by následovat konzultace s ošetřujícím lékařem, zda pokračovat v molekulární analýze. Pokud má pacient klinicky potvrzenou diagnózu WCH, je nutné osekvenovat celý ATP7B gen (obr. 2). Naše výsledky ukazují, že Wilsonův čip je vhodná screeningová metoda jednonukleotidových polymorfismů, malých delecí a inzercí v ATP7B genu.

Schéma postupu molekulárně-genetického vyšetření Wilsonovy choroby
Obr. 2. Schéma postupu molekulárně-genetického vyšetření Wilsonovy choroby

Zkratky

APEX – Arrayed Primer Extension

ddATP – dideoxyadenosintrifosfát

ddGTP – dideoxyguanosintrifosfát

ddCTP – dideoxycytosintrifosfát

ddUTP – dideoxyuridintrifosfát

WCH – Wilsonova choroba

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Lucie Gojová

Centrum molekulární biologie a genové terapie FN

Černopolní 9, 613 00 Brno

fax: +420 532 234 623, e-mail: lgojova@fnbrno.cz, luciegojova@seznam.cz


Zdroje

1. Bingham MJ, Ong TJ, Summer KH, et al. Physiologic function of the Wilson disease gene product, ATP7B. Am J Clin Nutr 1998; 67: 982S–987S.

2. Kodama H. Genetic disorders of copper metabolism. In: Chang LW. (ed.) Toxicology of Metals. New York: CRC Lewis Publishers 1996; 371–386.

3. Harris ED. Cellular copper transport and metabolism. Annu Rev Nutr 2000; 20: 291–310.

4. Ferenci P. Review article: diagnosis and current therapy of Wilson’s disease. Aliment Pharmacol Ther 2004; 19: 157–165.

5. Medici V, Rossaro L, Sturniolo GC. Wilson disease-A practical approach to diagnosis, treatment and follow-up. Dig Liver Dis 2007; 39: 601–609.

6. Medici V, Trevisan CP, D’Inca R et al. Diagnosis and management of Wilson’s disease: results of a single center experience. J Clin Gastroenterol 2006; 40: 936–941.

7. Liu M, Cohen EJ, Brewer GJ, et al. Kayser-Fleischer ring as the presenting sign of Wilson disease. Am J Ophthalmol 2002; 133: 832–834.

8. Vrabelova S, Letocha O, Borsky M, et al. Mutation analysis of the ATP7B gene and genotype/phenotype correlation in 227 patients with Wilson disease. Mol Genet Metab 2005; 86: 277–285.

9. Petrukhin K, Fischer SG, Pirastu M, et al. Mapping, cloning and genetic characterization of the region containing the Wilson disease gene. Nat Genet 1993; 5: 338–343.

10. Tanzi RE, Petrukhin K, Chernov I, et al. The Wilson disease gene is a copper transporting ATPase with homology to the Menkes disease gene. Nat Genet 1993; 5: 344–350.

11. Petrukhin K, Lutsenko S, Chernov I, et al. Characterization of the Wilson disease gene encoding a P-type copper transporting ATPase: genomic organization, alternative splicing, and structure/function predictions. Hum Mol Genet 1994; 3: 1647–1656.

12. Ferenci P. Regional distribution of mutations of the ATP7B gene in patients with Wilson disease: impact on genetic testing. Hum Genet 2006; 120: 151–159.

13. Payne AS, Kelly EJ, Gitlin JD. Functional expression of the Wilson disease protein reveals mislocalization and impaired copper-dependent trafficking of the common H1069Q mutation. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 10854–10859.

14. Gojova L, Jansova E, Kulm M, et al. Genotyping microarray as a novel approach for the detection of ATP7B gene mutations in patients with Wilson disease.Clin Gen 2008; 73: 441–452.

15. Gemignani F, Perra C, Landi S, et al. Reliable detection of beta-thalassemia and G6PD mutations by a DNA microarray. Clin Chem 2002; 48: 2051–2054.

16. Jaakson K, Zernant J, Kulm M, et al. Genotyping microarray (gene chip) for the ABCR (ABCA4) gene. Hum Mutat 2003; 22: 395–403.

17. Schrijver I, Oitmaa E, Metspalu A, et al. Genotyping microarray for the detection of more than 200 CFTR mutations in ethnically diverse populations. J Mol Diagn 2005; 7: 375–387.

18. Kurg A, Tonisson N, Georgiou I, et al. Arrayed primer extension: solid-phase four-color DNA resequencing and mutation detection technology. Genet Test 2000; 4: 1–7.

19. Zernant J, Kulm M, Dharmaraj S, et al. Genotyping microarray (disease chip) for Leber congenital amaurosis: detection of modifier alleles. Invest Ophthalmol Vis Sci 2005; 46: 3052–3059.

20. Cremers FP, Kimberling WJ, Kulm M, et al. Development of a genotyping microarray for Usher syndrome. J Med Genet 2007; 44: 153–160.

21. Tonisson N, Zernant J, Kurg A, et al. Evaluating the arrayed primer extension resequencing assay of TP53 tumor suppressor gene. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 5503–5508.

22. Shadrina M, Nikopensius T, Slominsky P, et al. Association study of sporadic Parkinson’s disease genetic risk factors in patients from Russia by APEX technology. Neurosci Lett 2006; 405: 212–216.

23. Curtis D, Durkie M, Balac P, et al. A study of Wilson disease mutations in Britain. Hum Mutat 1999; 14: 304–311.

24. Margarit E, Bach V, Gomez D, et al. Mutation analysis of Wilson disease in the Spanish population — identification of a prevalent substitution and eight novel mutations in the ATP7B gene. Clin Genet 2005; 68: 61–68.

25. Shah AB, Chernov I, Zhang HT, et al. Identification and analysis of mutations in the Wilson disease gene (ATP7B): population frequencies, genotype-phenotype correlation, and functional analyses. Am J Hum Genet 1997; 61: 317–328.

26. Gromadzka G, Schmidt HH, Genschel J, et al. Frameshift and nonsense mutations in the gene for ATPase7B are associated with severe impairment of copper metabolism and with an early clinical manifestation of Wilson’s disease. Clin Genet 2005; 68: 524–532.

27. Loudianos G, Dessi V, Lovicu M, et al. Molecular characterization of wilson disease in the Sardinian population—evidence of a founder effect. Hum Mutat 1999; 14: 294–303.

28. Firneisz G, Lakatos PL, Szalay F, et al. Common mutations of ATP7B in Wilson disease patients from Hungary. Am J Med Genet 2002; 108: 23–28.

29. Loudianos G, Dessi V, Lovicu M, et al. Mutation analysis in patients of Mediterranean descent with Wilson disease: identification of 19 novel mutations. J Med Genet 1999; 36: 833–836.

Štítky
Adiktologie Alergologie a imunologie Angiologie Audiologie a foniatrie Biochemie Dermatologie Dětská gastroenterologie Dětská chirurgie Dětská kardiologie Dětská neurologie Dětská otorinolaryngologie Dětská psychiatrie Dětská revmatologie Diabetologie Farmacie Chirurgie cévní Algeziologie Dentální hygienistka

Článek vyšel v časopise

Časopis lékařů českých


Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Léčba bolesti v ordinaci praktického lékaře
nový kurz
Autoři: MUDr. PhDr. Zdeňka Nováková, Ph.D.

Revmatoidní artritida: včas a k cíli
Autoři: MUDr. Heřman Mann

Jistoty a nástrahy antikoagulační léčby aneb kardiolog - neurolog - farmakolog - nefrolog - právník diskutují
Autoři: doc. MUDr. Štěpán Havránek, Ph.D., prof. MUDr. Roman Herzig, Ph.D., doc. MUDr. Karel Urbánek, Ph.D., prim. MUDr. Jan Vachek, MUDr. et Mgr. Jolana Těšínová, Ph.D.

Léčba akutní pooperační bolesti
Autoři: doc. MUDr. Jiří Málek, CSc.

Nové antipsychotikum kariprazin v léčbě schizofrenie
Autoři: prof. MUDr. Cyril Höschl, DrSc., FRCPsych.

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se