Častou příčinou geneticky podmíněných prenatálně diagnostikovaných onemocnění jsou tzv. de novo mutace. Jde o náhodně vzniklé chyby při přepisu DNA v zárodečných buňkách zdravého rodiče (spermii či vajíčku), případně k nim může dojít v raném embryonálním stadiu vývoje plodu. V takovém případě je riziko opakování v další graviditě velmi nízké. Další možností jsou autosomálně recesivně dědičná onemocnění, kdy oba rodiče jsou zdravými přenašeči a riziko opakování v další graviditě činí 25 %. U X-vázaných onemocnění pak žena může být zdravou přenašečkou a vada se objeví při přenosu mutovaného genu na plod mužského pohlaví.
V rámci analýzy klinického exomu dokážeme odhalit de novo mutace, autosomálně recesivní onemocnění i onemocnění s X-recesivním typem dědičnosti. Znalost molekulárně genetické podstaty onemocnění nám umožňuje stanovit riziko opakování v dalším těhotenství a nabídnout páru možnost prenatální diagnostiky nebo preimplantačního genetického testování v rámci metod asistované reprodukce. Vyšetření je prováděno metodou sekvenování nové generace (NGS) na přístroji NextSeq (Illumina) panelem Clinical Exome Solution (Sophia Genetics). Tento panel obsahuje 5500 klinicky významných genů. V případě detailnější analýzy lze využít celoexomovou analýzu (WES), jež obsahuje 19 425 genů a umožňuje vyšetřit i mitochondriální DNA. Vyšetření exomu zahrnuje trio analýzu (postižený jedinec/plod a oba rodiče), která nám pomáhá identifikovat kauzální varianty a k filtraci získaných dat se používají též kritéria HPO dle fenotypu postiženého jedince/plodu. Získaná sekvenační data jsou analyzována softwarem Sophia DDM. Potenciálně kauzální varianty ověřujeme Sangerovou sekvenací, a pokud je to možné, pak i segregační analýzou v rodině.
Omezením při analýze klinického exomu v prenatální diagnostice je především množství a kvalita genetického materiálu, který je k dispozici. S tímto problémem jsme se potýkali také v rámci genetické diagnostiky příčiny postižení plodu v následující kazuistice. Naštěstí díky spolupráci s oddělením patologie Uherskohradišťské nemocnice a také díky kreativnímu přístupu a nasazení molekulárních genetiků v laboratoři GHC Genetics se podařilo diagnózu u plodu stanovit.
Ke kombinovanému screeningu v I. trimestru se do Centra prenatální diagnostiky a genetiky PREDIKO dostavila 29letá žena v tt 12+1. Ona i její partner byli zcela zdraví, nepříbuzní a v rodině nebyla žádná významnější genetická zátěž. Kombinovaný screening na základní chromosomové vady byl negativní, ale již v tomto týdnu těhotenství byla zřetelná patologie v oblasti mozečku, rozšířená IV. mozková komora a nedařilo se zobrazit intrakraniální translucenci.
Následná kontrola vývoje mozku plodu byla provedena v tt 13+6, kdy byla viditelná dilatace cisterna magna na 6 mm, hypertelorismus a bylo vysloveno podezření na Dandyho-Walkerův syndrom. Byl již přítomen oligohydramnion. Placenta byla v nepříznivé poloze nízko vzadu za plodem a nebylo tak technicky možné provedení odběru choriových klků (CVS). Vzhledem k nepříznivému vývoji mozku plodu byl proveden časný odběr plodové vody (AMC). Analýza pomocí kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce (QF PCR) neodhalila žádnou z nejčastějších chromosomových vad a následně i karyotyp plodu byl fyziologický. Při odběru časné AMC je však v odebraném materiálu koncentrace DNA natolik nízká, že pro další genetickou diagnostiku již nebyla žádná DNA plodu k dispozici a nebyla tak možná ani analýza pomocí komparativní genomové hybridizace (array-CGH) na mikrodeleční/mikroduplikační syndromy.
Při kontrole v tt 15+1 byl zjištěn anhydramnion a byla potvrzena vada mozku plodu. Vzhledem k anhydramnionu bylo detailní UZ vyšetření plodu limitované a nebyl možný ani další odběr plodové vody. Prognóza pro plod byla vzhledem k anhydramnionu infaustní. Pacientka se tedy rozhodla v graviditě dál nepokračovat a ta byla ukončena. Jako příčina se zvažovala také možná infekční etiologie.
Z pitvy plodu provedené na oddělení patologie Uherskohradišťské nemocnice následně vyplynul překvapivý nález. Byly potvrzeny vývojové vady mozku plodu, které byly popsány při prenatálním UZ vyšetření – ageneze vermis mozečku, dilatace IV. mozkové komory a ageneze corpus callosum. Byly však také nalezeny zvětšené ledviny s mnohočetnými cystičkami – tedy oboustranná polycystóza ledvin. Ta byla odpovědná za oligohydramnion a následný anhydramnion. Kombinace vrozené vývojové vady mozku s polycystózou ledvin pak jednoznačně ukazovala na možnou monogenní příčinu.
Bylo nutné začít pátrat po příčině vad u plodu. Problémem byla absence jeho DNA. Na oddělení patologie Uherskohradišťské nemocnice byla k dispozici tkáň plodu v parafínových bločcích. Z minulosti víme, že z těchto preparátů je možné DNA extrahovat a vyšetřit. Tyto analýzy jsou prováděny například ze vzorků nádorů cíleně na konkrétní geny. Analýza je obtížná, protože naložení tkáně do formalínu a následné zalití parafínem vede k fragmentaci DNA, navíc v tomto případě bylo nutné vyšetřit velké množství genů, abychom se dobrali ke konečné diagnóze. Vyšetření tedy bylo provedeno z tkáně plodu i ze vzorku DNA od obou rodičů a proběhla jak analýza klinického exomu, tak celoexomové sekvenování (WES). Data se následně skládala dohromady.
Tímto složitým a časově náročným postupem se nakonec podařilo odhalit příčinu postižení plodu v genu CEP290. V DNA plodu byla zjištěna přítomnost dvou variant CEP290 (NM_025114) v trans pozici. První byla patogenní varianta c.4962_ 4963delTT (p.Glu1656AsnfsTer3, rs764309755) v heterozygotním stavu zděděná od matky a druhou pravděpodobně patogenní varianta c.1225delT (p.Ile409PhefsTer5, rs1287628446) zděděná od otce. CEP290 je genem s autosomálně recesivním typem dědičnosti a kóduje centrosomový protein vyskytující se v různých typech buněk. Ačkoliv jeho funkce není zcela objasněna, studie naznačují, že má důležitou roli v centrosomech a řasinkách. Centrosomy se podílejí na buněčném dělení, sestavování mikrotubulů sloužících k transportu uvnitř buněk a udržování tvaru buňky. Řasinky (cilie) jsou výběžky na povrchu buněk sloužící k pohybu a podílející se na přenosu chemických signálů. Jsou také nezbytné pro smyslové vnímání.
Bialelické patogenní varianty v genu CEP290 jsou spojeny s několika závažnými autosomálně recesivními onemocněními (Joubertův syndrom 5, Seniorův-Løkenové syndrom 6, Meckelův syndrom 4, Bardetův-Biedlův syndrom 14). Tyto syndromy mají řadu příznaků, postihují mnoho částí těla a jejich projevy se mezi jednotlivými pacienty liší. Charakteristický je abnormální vývoj mozku (Dandyho-Walkerova malformace – chybějící cerebelární vermis, dilatace IV. mozkové komory, zvětšení zadní jámy mozkové), očí (retinální dystrofie, kolobom), ledvin (polycystické onemocnění, nefronoftíza), jater, kostry (polydaktylie) a hormonálního systému. Fenotyp plodu odpovídal tomu, že jde o kauzální příčinu zjištěných vad.
Vzhledem k tomu, že oba partneři byli zdravými přenašeči variant, činilo riziko opakování v další graviditě 25 %. Výsledky jim byly vysvětleny a byla s nimi probrána možnost plánování další gravidity. Partneři se rozhodli pro další graviditu pomocí cyklu in vitro fertilizace (IVF) s provedením preimplantačního genetického testování na toto monogenní onemocnění (PGT-M). Pomocí analýzy metodou karyomappingu tak budou vyřazena embrya, která by měla obě patogenní varianty, aby se naprosto minimalizovalo riziko opakování v dalším těhotenství. V případě přirozeného otěhotnění je možné provedení invazivní prenatální diagnostiky (CVS/AMC) s případným ukončením gravidity při průkazu přítomnosti obou variant u plodu.
MUDr. Věra Hůrková
Centrum prenatální diagnostiky a genetiky PREDIKO, Zlín
