Bioaktivní složky mateřského mléka

Souhrn

Mateřské mléko (MM) poskytuje svými bioaktivními složkami zdraví prospěšné slizniční stimuly, ovlivňuje složení střevní mikrobioty a podporuje vyvíjející se imunitní systém. Role bioaktivních složek MM je komplexní a v mnoha ohledech ještě nejasná. Charakteristické pro novorozenecký věk je nastavení imunitního systému, který je tzv. „naivní“ vůči novému extrauterinnímu prostředí [3], přes sliznici dýchacího traktu a gastrointestinálního traktu dochází k expozici s antigeny, na který musí reagovat [4]. Současně se moduluje tolerance vůči některým antigenům. MM zprostředkovává svými složkami buď primárně imunitní obranu (přímá obrana proti infekcím), nebo zastává imunomodulační funkci (bioaktivní složky ovlivňují imunitní systém). Současný přehled se zaměřuje na funkci solubilních imunitních složek MM [20].

Klíčová slova:

mateřské mléko – novorozenecký imunitní systém – donošení a nedonošení novorozenci

ÚVOD

Mateřské mléko (MM) je optimální výživou pro novorozence a kojence, zajišťuje nejen optimální růst a vývoj, ale také významnou imunitní ochranu. Kromě základních makronutrientů (bílkoviny, tuky a sacharidy) obsahuje řadu bioaktivních složek, které zásadním způsobem ovlivňují vývoj imunitního systému, mikrobioty střev a metabolické procesy dítěte. Tyto složky působí jako biologicky aktivní látky a zprostředkovávají buď primárně imunitní funkci (přímá obrana proti infekcím), nebo imunomodulační funkci (složky ovlivňují imunitní systém, ale jejich hlavní úloha je např. výživa, podpora neurovývoje. Mezi hlavní solubilní imunitní složky MM patří imunoglobuliny, alfa-laktalbumin, laktoferin, lysozym, oligosacharidy mateřského mléka (human milk oligosaccharides, HMO), ale i další nové prvky, např. mikroRNA (tab. 1).

IMUNOGLOBULINY

Imunoglobuliny (Ig) patří mezi glykoproteinové molekuly produkované plazmatickými buňkami. V mateřském mléce se vyskytuje všech pět tříd Ig –⁠ IgA, IgG, IgM, IgE a IgD.

Sekreční imunoglobulin A (sIgA)

sIgA je hlavní imunoglobulin MM (90 % všech protilátek v MM), slz a slin, vyskytuje se i v dalších sekretech. V mléce je především zastoupena sekreční forma sIgA. Maximální koncentrace je v kolostru, a to 1,2 g/100 ml, ve zralém MM je přibližně 0,1 g/100 ml. Hladina sIgA v MM klesá v prvních 12 týdnech po porodu. Počet plazmatických buněk, které produkují sIgA ve střevě novorozenců, je při narození nízký a postupně se zvyšuje, proto je koncentrace sIgA ve stolici u kojených dětí ve věku 6 měsíců již srovnatelná s nekojenými [8, 13]. sIgA se dostává do MM transcytózou. Na vnitřní straně epiteliální buňky se IgA váže na transportní receptor, transportním váčkem je přenesen na luminální stranu a fúzuje s membránou. Část membránového receptoru pro IgA zůstává připojena k sIgA jako tzv. sekreční komponenta, která zajišťuje sIgA rezistenci vůči střevním proteázám. Schéma sIgA uvádí obrázek 1. Mechanismus účinku je následující:

• sIgA se váže na sliznice trávicího traktu kojence, blokuje adhezi a průnik patogenů do podslizničních vrstev.

• Váže a neutralizuje antigeny na slizničním povrchu, obranné mechanismy sliznic (hlen, řasinky, peristaltika) tyto komplexy IgA s antigeny vyloučí z organismu (imunitní exkluze).

• sIgA neaktivuje komplement, který by mohl poškozovat sliznici. Označí  antigeny a po označení je komplex fagocytován –⁠ proces opsonizace.

• sIgA –⁠ specifická protilátka (např. proti rotavirům, E. coli, virům chřipky, SARS-CoV-2, aj.)

• Podporuje počáteční vývoj mikrobioty novorozence, vytváří selekční tlak, který podporuje kolonizaci symbiotickými druhy.

Imunoglobulin G (IgG)

Jedná se o hlavní sérový imunoglobulin, většinu IgG dítě dostává aktivním transplacentárním přenosem před porodem prostřednictvím receptoru FcRn. Tento receptor je na povrchu buněk, chrání protilátku IgG před degradací, umožňuje transport přes epiteliální tkáně. IgG je typický tím, že aktivuje komplementovou kaskádu k odstranění patogenů, podobně jako IgA má schopnost neutralizovat antigeny. Hladiny IgG v mateřském mléce jsou nízké, postupně se zvyšují. Maximální koncentrace je 0,005 g/100 ml. Na rozdíl od IgA je koncentrace IgG vyšší v MM výlučně kojících matek

ve srovnání s těmi, které kojí pouze částečně [1]. Může přecházet přes střevní sliznici do krevního oběhu novorozence v prvních dnech po porodu (tzv. „open gut“ fáze). Mechanismus účinku je následující:

• IgG neutralizuje bakterie a viry, které by mohly proniknout do krve.

• Aktivuje tzv. komplementový systém, tj. kaskádu proteinů, jejichž hlavní funkcí je narušení buněčné membrány patogenů.

• Usnadňuje fagocytózu (pohlcení) patogenů makrofágy a neutrofily –⁠ proces opsonizace.

° Funguje také jako specifická protilátka, tedy přispívá k dlouhodobější ochraně proti infekcím, včetně virových (např. CMV, herpesviry, respirační viry).

Imunoglobulin M (IgM)

Obecně se tvoří při akutní infekci jako reakce na nové infekční podněty. Chrání před bakteriálními a virovými infekcemi. IgM v MM je přítomen v menším množství, ale má významnou obrannou funkci [17]. Maximální koncentrace je 0,002 g/100 ml. Molekula IgM v MM je v gastrointestinálním traktu (GIT) kojených dětí částečně natrávena [7]. Mechanismus účinku je následující:

• Velmi silně aktivuje komplementový systém, dochází k vytvoření pórů v buněčných membránách patogenů.

• Je velmi účinný ve vazbě na antigeny, podobně jako IgA a IgG má schopnost se vázat na bakterie v trávicím traktu a označit je pro fagocytózu –⁠ proces opsonizace.

Imunoglobulin IgE

V mateřském mléce je přítomen v malém množství. Sérový IgE je spojen s alergickou reakcí a parazitární infekcí. Některé studie naznačují, že také u autoimunitních onemocnění může dojít ke zvýšení IgE. Mechanismus účinku je následující:

• MM může obsahovat IgE protilátky specifické pro určité alergeny, na které je matka alergická (např. pyl, mléčné bílkoviny, arašídy). Specifické IgE mohou senzibilizovat kojence na podobné alergeny. Vyšší hladiny IgE v MM mohou být spojeny s vyšším rizikem alergických onemocnění (např. atopického ekzému), důkazy jsou však nejednotné [9].

• Přestože je IgE známý jako „spouštěč alergie“, má imunoregulační efekt. V mateřském mléce IgE ovlivňuje vývoj T-regulačních buněk u dítěte, tím podporuje toleranci k antigenům.

Přesná role IgE je stále předmětem výzkumu. Může být ochranná i riziková v závislosti na dalších faktorech (genetika, expozice alergenům, stav střevní bariéry).

Imunoglobulin IgD

munoglobulin IgD IgD je nejméně prozkoumaná třída protilátek, jeho funkce v MM zůstává nejasná. Je exprimován především na povrchu zralých B-lymfocytů, kde slouží jako receptor pro antigeny, což vede ke stimulaci a aktivaci B-buněk. Ve volné formě (v tělních tekutinách včetně MM) se nachází v zanedbatelných koncentracích.

Koncentrace IgA, sIgA, IgM a IgG jsou nižší v pasterizovaném mléku dárkyň. IgM a IgG jsou na Holderovu pasterizaci citlivější než IgA (u IgA je 30% ztráta). Druhým důvodem poklesu imunoglobulinů může být doba, kdy bylo mléko odsáváno (pokles imunoglobulinů v prvních 6 měsících po porodu) [17].

ALFA-LAKTALBUMIN

Jedná se o syrovátkový protein, tvoří 1/3 celkového obsahu proteinů v MM. Reguluje produkci laktózy v MM. Jeho exprese je ovlivněna prolaktinem. Alfa -⁠ -laktalbumin je nezbytný pro výživu, protože poskytuje  esenciální aminokyseliny  a bioaktivní sloučeniny nezbytné pro optimální růst, vývoj. Je zdrojem větvených aminokyselin, cysteinu a tryptofanu. Tryptofan je prekurzorem neurotransmiteru serotoninu, cystein je aminokyselina, která se podílí na produkci glutathionu (ochrana buněčných membrán před oxidačním stresem). Mechanismus účinku je následující:

• Imunomodulační efekt –⁠ obsahuje bioaktivní peptidy, které aktivují např. makrofágy, tím je posilována obrana proti virovým a bakteriálním infekcím.

• Protinádorový efekt –⁠ spolu s kyselinou olejovou tvoří komplex známý jako HAMLET (human alpha -⁠ -lactalbumin made lethal to tumour cells), který narušuje strukturu membrány nádorové buňky a podporuje její apoptózu, destruuje jádra rakovinných buněk, nikoli však buněk zdravých. Kyselina olejová pravděpodobně exprimuje apoptotickou aktivitu, zatímco alfa-laktalbumin je zodpovědný za usměrnění na specifické buněčné linie (nádorové buňky tlustého střeva, močového měchýře a glioblastomu, papilomu aj. [16].

Některá kojenecká mléka (např. HA formule nebo hypoalergenní směsi) využívají alfa-laktalbuminu z kravského mléka pro snížení celkového množství bílkovin při zachování dostatečné výživové hodnoty a zlepšení tolerance mléka u kojenců s rizikem alergií.

LAKTOFERIN

Tento glykoprotein ze skupiny transferinů je zastoupen také v různých sekrečních tekutinách (sliny, slzy a sekret dýchacích cest). Vykazuje imunomodulační, protizánětlivé, antibakteriální a antivirové funkce. Hladiny laktoferinu jsou vyšší v kolostru 0,3 g/100 ml, ve zralém MM 0,1 g/100 ml. Mechanismus účinku je následující:

• Bakteriostatický efekt –⁠ laktoferin silně váže ionty železa (Fe3+). Bakterie ke svému růstu potřebují železo (E. coli, Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa a další), které je součástí enzymů a dýchacího řetězce. Některé patogeny mají speciální strategii k získání železa, produkují chelační molekuly, které vážou železo, ale laktoferin tyto molekuly neutralizuje.

• Baktericidní účinek –⁠ závisí na jeho přímé interakci s lipoteichoovou kyselinou grampozitivních bakterií nebo liposacharidy gramnegativních bakterií. Laktoferin působí synergicky s lysozymem přítomným v MM. Oxidované železo vázané na laktoferin pomocí kyslíkových radikálů oxiduje bakterie, tím mění propustnost membrány s výsledným rozpadem buňky [12].

• Antivirová aktivita –⁠ působí na širokou škálu DNA a RNA virů, včetně viru herpes simplex, CMV, HIV, RSV, koronaviru. Váže se na lipoproteiny buněčných membrán, čímž blokuje virové částice, potlačuje replikaci viru. • Imunomodulační účinek –⁠ ovlivňuje migraci, zrání a funkce imunitních buněk. V animálních studiích byl prokázán při suplementaci výživy laktoferinem zvýšený počet buněk CD4+  a CD8+, vyšší počet NK-buněk v mezenterických lymfatických uzlinách a monocytů v periferní krvi.

Ve studiích byl použit jak rekombinantní lidský laktoferin (studie in vitro), kde působí proti E. coli,  Staphylococcus aureus,  Pseudomonas aeruginosa,  Candida albicans  aj., tak bovinní laktoferin, který je velmi podobný lidskému (udávaná homologie je 77 %). Bovinní laktoferin se podával předčasně narozeným novorozencům s cílem zhodnotit snížení rizika pozdní sepse a nekrotizující enterokolitidy. V roce 2014 a 2019 Manzoni popsal snížení výskytu sepsí a invazivních mykotických infekcí u kategorie dětí s velmi nízkou porodní hmotností (very low birth weight, VLBW) v prvních 45 dnech života ve srovnání s placebem. V roce 2020 metaanalýza (Cochrane Review) zhodnotila dostupné randomizované studie u předčasně narozených dětí se závěrem, že suplementace laktoferinem snižuje riziko LOS (low onset sepsis), nikoli však výskyt NEC II. stadia nebo mortalitu. Nebyl prokázán efekt na neurovývoj ve 24 měsících věku [15]. Autoři se shodují na potřebě dalších rozsáhlejších studií.

LYSOZYM

Jedná se o enzym s významnou antimikrobiální funkcí, který patří mezi hlavní složky imunity MM [19]. Podobně jako laktoferin je přítomen v různých sekrečních tekutinách. Skládá se ze 129 aminokyselin, jeho struktura zajišťuje vysokou odolnost vůči proteolýze i vůči změnám pH v trávicím traktu novorozence. Koncentrace lysozymu je v kolostru nízká, ve zralém MM stoupá, po šesti měsících může dosáhnout až 0,005 g/100 ml. Tento růst koncentrace odráží adaptaci MM, kdy je dítě více vystaveno mikrobiálnímu prostředí. Mechanismus účinku je následující:

• Baktericidní účinek –⁠ rozkládá bakteriální buněčné stěny (hydrolyzuje vazby v peptidoglykanové vrstvě buněčných stěn, štěpí vazby mezi molekulami N-acetylmuramové kyseliny a N-acetylglukosaminu peptidoglykanu), to vede k rozpadu a likvidaci především grampozitivních bakterií. V MM působí také synergicky s laktoferinem.

• Imunomodulační efekt –⁠ eliminuje patogeny bez nadměrné stimulace zánětlivé odpovědi, přispívá k ochraně sliznic a rozvoji imunologické tolerance. Podporuje tvorbu zdravé střevní mikrobioty a napomáhá optimálnímu vývoji imunitního systému.

OLIGOSACHARIDY MATEŘSKÉHO MLÉKA

Oligosacharidy mateřského mléka (HMO) jsou třetí nejvíce zastoupenou složkou v MM s koncentrací 0,5–1,5 g/100 ml ve zralém mléce a  1,5–2 g/100 ml v kolostru. HMO patří mezi nekonjugované sacharidy na bázi laktózy. Jsou složeny z pěti základních monomerů: kyseliny sialové,  N-acetylglukosaminu,  L-fukózy, D-glukózy a D-galaktózy. Jejich tvorba se odehrává v mléčné žláze, kde je několik monosacharidů připojeno k molekule laktózy působením enzymů glykosyltransferáz [5]. Profil mléčných oligosacharidů v MM je rozmanitější než u jiných savců. Bylo identifikováno více než 200 odlišných struktur HMO. Jejich rozmanitost je podmíněna geneticky. Liší se v důsledku rozdílů v expresi sekrečních (Se) a Lewisových (Le) genů v mléčné žláze. Jsou popsány konkrétní variace HMO v mléce matek, kterým chybí gen Se nebo Le. Některé studie ukazují na změnu koncentrací HMO v závislosti na prostředí (venkovské vs. městské prostředí), termínu porodu, délky kojení, stáří matky. Mechanismus účinku je následující:

• Podpora zdravé střevní mikrobioty –⁠ HMO nejsou jako sacharidy pro novorozence stravitelné, mají funkci prebiotika, tvoří nutriční substrát pro střevní mikrobiotu, tím stimulují její růst a složení. Nejlépe byla popsána interakce s bakteriemi rodu Bifidobacterium, zejména Bifidobacterium longum subsp. infantis. Schopnost využít HMO mají také Bifidobacterium bifidum a Bacteroides. Naproti tomu jiné bakterie, například Lactobacillus gasseri či Enterococcus,  mají při HMO omezený růst. HMO v kombinaci s mikrobiotou mohou regulovat funkci střevní bariéry. Selektivně podporují množení bifidobakterií a laktobacilů, které produkují kyselinu mléčnou, dochází ke snížení intraluminálního pH a vytváří se mastné kyseliny s krátkým řetězcem (short-chain fatty acids, SCFA), které slouží jako zdroj energie pro enterocyty.

• Antimikrobiální účinek –⁠ HMO napodobují struktury receptorů na sliznicích, na které by se navázaly patogeny, a tím fungují jako rozpustné návnady. Zabrání přichycení bakterií/virů ke střevnímu epitelu, patogeny jsou vyloučeny stolicí.

• Modulace imunitního systému –⁠ HMO ovlivňují zrání lymfocytů, tlumí zánětlivou odpověď a podporují toleranci vůči antigenům. Tím přispívají k prevenci alergií potlačením reakce Th2 (např. u atopických dětí). HMO posilují funkce dendritických buněk, které hrají klíčovou roli v regulaci a rozvoji nezralého imunitního systému u novorozenců prostřednictvím regulačních T-lymfocytů. Neutrální HMO tlumí v makrofázích uvolňování oxidu dusnatého (NO), prostaglandinu E2 (PGE2), reaktivních forem kyslíku, TNF-α. HMO ovlivňují expresi toll-like receptorů, tím ovlivňují rozpoznávání patogenů a iniciují signalizaci zánětu.

• Podpora vývoje mozku (neurovývoj) –⁠ tzv. sialylované HMO jsou zásadní složkou gangliosidů v šedé hmotě CNS (podpora neurogeneze, myelinizace, synaptogeneze) [18].

• Podpora bariérové funkce střev –⁠ HMO snižují propustnost střevní sliznice, ovlivňují expresi tzv. proteinů těsných spojů (např. occludin, claudin), které spojují sousední buňky epitelu. Dochází ke snížení paracelulární propustnosti střeva, omezení průchodu patogenů a alergenů mezi buňkami střevního epitelu (tzv. „leaky gut“ syndrom).

Nekrotizující enterokolitida (NEC) u předčasně narozených dětí je méně častá při výživě mateřským mlékem oproti dětem krmených formulí. Klinické studie uvádějí souvislost mezi výživou MM a sníženou střevní propustností u předčasně narozených dětí. Jedním z důvodů může být přítomnost HMO. V animálních studiích měla myší mláďata v modelu NEC zvýšenou expresi mucinu, sníženou střevní permeabilitu a nižší úmrtnost při výživě s HMO.

Vzhledem k imunomodulačním vlastnostem se začaly přidávat do umělé výživy galaktooligosacharidy (GOS) nebo směs s fruktooligosacharidy (GOS/FOS). GOS pochází z kravského mléka a FOS z rostlin. Kromě GOS/FOS byly extrahovány i oligosacharidy z hovězího mléka (BMO). Existují určité podobnosti v profilu BMO a HMO. BMO indukují podobné biologické funkce včetně inhibice adheze patogenů na střevní enterocyty, snížení permeability střeva či potlačení zánětu. V kohortové studii zahrnující 200 matek se analyzovalo jejich MM na přítomnost určitých HMO. Novorozenci s NEC dostávali MM s významně nižšími hladinami disialyllacto-N-tetraózy (DSLNT) ve srovnání s kontrolní skupinou [2]. Další studie ukazují, že specifické HMO, jako je 2‘-fukosyllaktóza (2‘-FL) a lacto-N-neotetraóza (LNnT), mohou modulovat střevní mikrobiotu a imunitní odpověď, což může přispět k ochraně proti NEC. Důkazy z klinických studií jsou zatím omezené a vyžadují další výzkum [14]. Přidávání syntetizovaných oligosacharidů do kojenecké výživy je ve vývoji, zatím je dostupná 2‘-FL. Děti s umělou výživou obohacenou o 2‘-FL měly odpovídající růst s kojenými a plazmatické koncentrace IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α podobné jako u kojených dětí [10]. Evropský úřad pro bezpečnost potravin (European Food Safety Authority, EFSA) uznal 2‘-FL jako bezpečnou složku pro kojeneckou výživu. Formule s  2‘-FL jsou označeny jako výživa obsahující 2‘-fukosyllaktózu nebo HMO.

mikroRNA

mikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující RNA molekuly (obvykle 19–24 nukleotidů), které regulují genovou expresi. Vznikají transkripcí z genů v DNA, následně však nedochází k jejich translaci  v protein. miRNA jsou částečně komplementární k určitým molekulám messengerové RNA (mRNA) –⁠ výsledkem je buď degradace cílové mRNA, nebo inhibice translace (zabránění tvorby proteinu). Tímto miRNA regulují syntézu všech podstatných proteinů, které tyto messengerové RNA kódují. Zjednodušené schéma vzniku miRNA, na jejímž  konci dochází k ovlivnění syntézy konkrétního proteinu (regulace genové exprese) uvádí obrázek 2.

miRNA jsou v mateřském mléce přítomny především v extracelulárních malých vezikulách, zapouzdření těchto molekul poskytuje ochranu proti enzymatické degradaci [11]. To znamená, že procházejí GIT v nezměněné formě, jsou absorbovány střevními epiteliálními buňkami, vstupují do systémové cirkulace (předpokládá se větší přestup biologicky aktivních miRNA u nedonošených, kde je vyšší permeabilita střeva). MM je charakteristické tím, že má svůj vlastní unikátní profil miRNA. Na základě současných znalostí o buněčných liniích mléčné žlázy a profilu miRNA se předpokládá, že miRNA v MM pocházejí z buněk imunitního systému matky a z buněk mléčné žlázy. V kolostru je koncentrace miRNA nejvyšší, po přechodu na zralé MM dochází k poklesu a změně profilu. Obsah miRNA v MM je ovlivněn i termínem porodu. Po předčasném porodu obsahuje MM vyšší koncentrace miRNA, zejména miRNA specificky spojených s imunitní regulací a zánětlivou odpovědí. Pravděpodobně to odráží potřebu posílení imunity nutnou po předčasném porodu. miRNA exprimované v mléce po předčasném porodu jsou např. miR-21, miR-146b, miR-155. Naopak miRNA spojené s růstem a vývojem (např. miR-148a, miR-30b) jsou více zastoupeny v MM donošených dětí. Holder pasterizace částečně degraduje miRNA, paskalizace (metoda ošetření MM vysokým tlakem) strukturu miRNA zachovává. Mechanismus účinku je následující:

• Regulace imunitního systému –⁠ modulace vrozené imunitní odpovědi a zánětu. Některé miRNA inhibují zpracování a prezentaci antigenu dendritickými buňkami, jiné indukují diferenciaci a vývoj B -⁠ a T-lymfocytů a hrají roli při zánětu snížením produkce TNF-α. V animálním modelu miRNA blokují toll-like receptory (TLR) ve střevních epitelových buňkách a následně snižují apoptózu indukovanou lipopolysacharidy. Je tedy možné, že mléčné miRNA chrání kojence před infekcí, potlačují zánět a modulují imunitní odpověď různými mechanismy.

• Podpora vývoje střevní mikrobioty –⁠ miRNA pravděpodobně mění složení mikrobioty, protože bakteriální růst je podporován v přítomnosti určitých miRNA. Zatím máme omezené množství informací o vlivu exogenních miRNA z MM na novorozeneckou mikrobiotu. V případě, že se tato domněnka potvrdí, miRNA se mohou stát novou složkou kojenecké výživy.

• Neurovývoj a růst dítěte –⁠ miRNA regulují neuronální diferenciaci a vývoj mozku, čímž mohou ovlivnit kognitivní funkce dítěte.

• Metabolická funkce –⁠ miRNA mění metabolismus lipidů a glukózy, uplatňují se u metabolických poruch v pozdějším věku.

Studie sledující  miRNA v MM jsou především observační. Autoři se shodují, že exozomální miRNA z MM mohou u novorozenců ovlivňovat všechny systémové procesy, nicméně přímou kauzalitu mezi konkrétními miRNA a specifickými onemocněními (např. NEC) zatím studie jednoznačně nepopsaly.

ZÁVĚR

Mateřské mléko je zlatým standardem kojenecké výživy. Tento přehled shrnuje poznatky o hlavních solubilních bioaktivních složkách mateřského mléka a jejich vlivu na imunitní funkce. Některé imunitní složky potlačují zánětlivou reakci, jiné zabraňují pomnožení nebo translokaci patogenů na úrovni slizniční bariéry, modulují slizniční i systémovou imunitu. Zůstává však nezodpovězena řada otázek. Nicméně to nijak nemění pohled na unikátnost a dominantní postavení mateřského mléka.