Humánní papillomaviry v etiologii karcinomu ústní dutiny a orofaryngu


Human Papillomaviruses in Etiology of Carcinoma in Oral Cavity and Oropharynx

The results of the epidemiological and molecular biological studies in the last years provides the evidence that besides the group of head and neck cancers etiologically linked to tobacco and alcohol consumption a group of tumours, mostly localized in the oropharynx, etiologically linked to human papillomavirus (HPV) infection exists.

The aim of our work was to provide an overview about the presence and relevance of HPV in oral and oropharyngeal tumours in the Czech population, about the risk factors of these tumours and about the possible applications of the knowledge about HPV to the clinical practice.

Patients with oral/oropharyngeal tumours and a group of age and gender matched controls were enrolled. Analyses were done on 86 patients and 124 controls. Data about risk factors and sexual behaviour were gained by a questionnaire. Cells from oral/oropharyngeal rinses and from tumour samples were examined for HPV DNA presence by PCR and reverse blot hybridisation. Sera of subjects and controls were examined for the presence of HPV-specific antibodies.

HPV prevalence was 61.6% in the tumour tissue and it was higher in the oropharynx (68%), than in the oral cavity (18.2%).

The group of patients with HPV positive tumours was characterized by lower prevalence of smokers and consumers of alcohol than the group of patients with HPV negative tumours. Regarding age, gender, and sexual behaviour no difference between these two groups was found. In general, the most important risk factor of oral/oropharyngeal cancer was tobacco and alcohol consumption, lower education and higher number of sexual partners. The presence of HPV was favourable for the prognosis of the disease. The presence of HPV in oral/oropharyngeal rinses and the presence of HPV-specific antibodies correlate significantly with the presence of virus in the tumour tissue.

Key words:
HPV, oropharyngeal cancer, epidemiology, prognosis.


Autoři: J. Klozar 1;  M. Zábrodský 1;  R. Kodet 2;  M. Saláková 3;  J. Šmahelová 3;  V. Ludvíková 3;  E. Hamšíková 3;  R. Tachezy 3
Působiště autorů: Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK a FN, Praha Katedra otorinolaryngologie IPVZ, Praha ;  přednosta prof. MUDr. J. Betka, DrSc. Oddělení patologické anatomie a molekulární biologie 2. LF UK, Praha 1;  přednosta prof. MUDr. R. Kodet, CSc. Oddělení experimentální virologie, Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha 2;  ředitel prof. MUDr. P. Klener, DrSc. 3
Vyšlo v časopise: Otorinolaryng. a Foniat. /Prague/, 56, 2007, No. 2, pp. 73-81.
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Jak dokazují epidemiologické a laboratorní práce z posledních let, existuje vedle skupiny nádorů souvisejících s expozicí tabáku a alkoholu skupina nádorů, především orofaryngu, v jejichž etiologii se uplatňují humánní papillomaviry (HPV). Cílem publikace je podat přehled o přítomnosti a významu HPV u nádorů ústní dutiny a orofaryngu v české populaci, o rizikových faktorech těchto nádorů a o možném využití poznatků o HPV v klinické praxi.

Do studie byli zařazováni pacienti s nádory ústní dutiny a orofaryngu a byla vytvořena kontrolní skupina pacientů bez nádoru. Data o rizikových faktorech byla získávána pomocí dotazníků, buňky z výplachů dutiny ústní a orofaryngu a tkáň nádorů byly vyšetřeny na přítomnost HPV pomocí polymerázové řetězové reakce a reverzní hybridizace. Krev byla vyšetřena na přítomnost protilátek proti HPV.

Přítomnost HPV DNA byla nalezena u 61.6 % tumorů, častěji v orofaryngu (68 %) než v ústní dutině (18,2 %). Skupina pacientů s HPV pozitivními nádory se vyznačuje nižším výskytem kuřáků a konzumentů alkoholu než skupina pacientů s HPV negativními nádory. Z hlediska sexuálního chování, věku a pohlaví nebyl zjištěn mezi oběma skupinami rozdíl. Obecně byla nejvýznamnějším rizikovým faktorem konzumace tabáku, dále alkoholu, nižší vzdělání a vyšší počet sexuálních partnerů. Přítomnost HPV v nádoru významně příznivě ovlivňuje prognózu onemocnění. Přítomnost HPV v buňkách z výplachů a přítomnost protilátek proti virovým antigenům významně koreluje s přítomností viru ve tkáni tumoru.

Klíčová slova:
HPV, karcinom orofaryngu, epidemiologie, prognóza.

ÚVOD

Nádory hlavy a krku představují celosvětově značnou část onkologických onemocnění. V České republice bylo v roce 2003 1775 nových případů těchto nádorů (1). Muži jsou zastoupeni výrazně více, celkově je poměr žen a mužů 1:4,4. Nejnižší je převaha mužů u nádorů slinných žláz, kde je poměr jen 1:1,6, ale i nádory tonzil mají nižší zastoupení mužů než nádory ostatních lokalizací (1:3,4). Incidence nádorů hlavy a krku v tuzemsku i v některých jiných zemích mírně stoupá, a to bez závislosti na zvýšení expozice tradičním rizikovým faktorům. Výskyt nádorů v jednotlivých lokalizacích se vyvíjí nerovnoměrně. Incidence nádorů ústní dutiny a orofaryngu je v posledních letech na stálém vzestupu. Ve stejném období incidence nádorů laryngu stagnuje nebo dokonce u mužů mírně klesá.

Etiologie nádorů hlavy a krku je multifaktoriální a uplatňují se v ní četné rizikové faktory, které se liší dle geografických a kulturních zvláštností. Tyto nádory jsou z hlediska rizik patrně nejheterogennější skupinou ze všech lidských nádorů. Ústní dutina a orofaryng patří mezi lokality, kde se uplatňují tzv. tradiční rizikové faktory. V našich podmínkách jde především o kouření tabáku, konzumaci alkoholu a jejich kombinaci. Mezi další tradiční faktory patří výživa, prokázány jsou genetické faktory, příslušnost k nižší socioekonomické skupině, obtížně jsou dnes hledány přesvědčivé důkazy o vlivech pracovního prostředí. Někdy bývají mezi prognostickými faktory uváděny i další, jako je například stav zubů, nebo úroveň hygieny ústní dutiny. Ty však patrně nejsou nezávislými rizikovými faktory, ale souvisí s životním stylem postižené skupiny pacientů. V poslední době epidemiologické a laboratorní práce dokazují, že vedle skupiny nádorů souvisejících s expozicí tabáku a alkoholu, existuje skupina nádorů, především orofaryngu, v jejichž etiologii se uplatňují humánní papillomaviry (HPV).

HPV jsou epitelotropní DNA viry s dnes již potvrzeným kancerogenním potenciálem. Nalézají se v řadě maligních lézí i prekanceróz v oblasti hlavy a krku s různou prevalencí, která je pravděpodobně závislá na použitých detekčních technikách. V současné době je známo přibližně 100 typů HPV, které byly definovány na základě homologie DNA. Patnáct onkogenních (vysoce rizikových, high risk = HR) typů bylo nalezeno v nádorech děložního hrdla: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82. Z nich se u nádorů horních dýchacích a polykacích cest nalézá zdaleka nejčastěji typ HPV 16, v menší míře i 18, 31, 33 a vzácně i některé další typy.

S pokračujícím výzkumem jsou nalézány stále nové rozdíly v zastoupení proteinů buněčného cyklu mezi HPV pozitivními a HPV negativními nádory. HPV pozitivní karcinomy mají sníženou hladinu retinoblastomového proteinu (pRb) a cyklinu D1 a zvýšenou expresi p16 INK4A. HPV pozitivní karcinomy zpravidla též obsahují, na rozdíl od HPV negativních nádorů, nemutovaný (divoký typ) gen p53 (2). Tyto údaje ukazují na odlišnosti v procesu, jakým dojde k vyvolání HPV pozitivních a negativních tumorů. Onkogeneze nádorů hlavy a krku, podobně jako jiných lokalizací, není dokonale objasněna a na buněčné úrovni jsou popsány pravděpodobně jen některé dráhy, které se na vzniku nádoru podílejí. U nádorů hlavy a krku, kde se uplatňují tradiční kancerogeny, jsou pravděpodobně jednou z důležitých cest mutace genů pro regulátory buněčného cyklu. Naproti tomu u HPV pozitivních karcinomů se na deregulaci podílejí produkty virových onkogenů E6 a E7 (10, 20). Produkt prvního z nich vytváří komplex, který se naváže na buněčný protein p53 a způsobí jeho degradaci. Buňky bez funkčního p53 pak nepodléhají apoptóze a jsou geneticky nestabilní. Navíc protein E6 inaktivuje telomerázu, enzym, který udržuje stabilní telomerickou DNA na koncích chromozomů. Bez ní dojde při dělení k postupnému zkracování chromozomu, které může vyústit až k poškození kódujících úseků. Protein E7 se váže na retinoblastomový protein (pRb) a další příbuzné proteiny. Způsobí tak uvolnění transkripčního faktoru, který aktivuje geny regulující buněčnou proliferaci. Protein E7 ovlivňuje i další proteiny regulující buněčný růst a indukuje tak nepřirozenou duplikaci centrosomů, což vede k abnormálním mitózám, aneuploiditě a genomové nestabilitě. Infekce rizikovým typem HPV nemusí nutně vést ke karcinomu. Faktorů, které vedou ke vzniku nádoru u infikovaného pacienta je bezesporu více a infekce HPV je jen jedním z nich.

Výsledky léčby, která zahrnuje především chirurgii, radioterapii a v menší míře i chemoterapii, přes evidentní pokroky těchto modalit (rekonstrukční metody, intenzitně modulovaná radioterapie, konkomitantní radiochemoterapie) stagnují, nebo se zlepšují jen velmi pomalu. Pomalé zlepšování úspěšnosti léčby je zaznamenáno celosvětově, v České republice se na něm pravděpodobně podílí i velký počet nemocných  s nádory v pokročilém stadiu, kteří mají jen omezený prospěch z nových léčebných metod. Již léta proto platí, že pětileté přežití u těchto nádorů dosahuje přibližně jen 50 %.

Pro rozhodnutí o léčebném postupu má význam znalost prognostických faktorů. Terapeutické rozhodnutí se dnes řídí převážně stagingem, který má ale z hlediska prognózy jen omezený význam. To podporuje nutnost hledání dalších faktorů, které by umožnily individuálnější stanovení terapeutického plánu pro daného pacienta. V klinické praxi jsou dnes používána například patologická kritéria zpřesňující informaci o primárním nádoru (hloubka invaze, průnik do cév), o postižení regionálních uzlin (počet postižených uzlin, šíření mimo pouzdro uzliny), v experimentech jsou ověřovány i markery genetického poškození (ploidita, ztráta heterozygozity a další). Vzhledem k možnému významu HPV pro výsledek léčby by k takovým kritériím mohla patřit i detekce přítomnosti HPV, případně HPV-specifických protilátek.

Výzkum HPV má i další vztahy ke klinické praxi. Epidemiologické metody zkoumají charakteristiky populace postižené HPV nádory. Závěry tohoto výzkumu mohou ovlivnit doporučení týkající se prevence a depistáže těchto nádorů. Předmětem intenzivního zájmu je i souvislost mezi nádory hlavy a krku a nádory jiných lokalizací asociovanými s HPV, tedy především s nádory urogenitální oblasti. Jsou zkoumány neinvazivní metody detekce HPV DNA. Velká pozornost je rovněž věnována průkazu HPV-specifických protilátek. Jak vyplývá z některých předběžných výsledků, hladiny protilátek proti virovým onkoproteinům do značné míry sledují klinický průběh. Otevírá se tu potenciální možnost použít takové protilátky jako marker při sledování pacientů po léčbě HPV pozitivních tumorů.

Schválením profylaktických HPV vakcín pro komerční použití (jedna je již schválena a uvedena na trh také v České republice, u druhé se ukončení schvalovacího procesu očekává v průběhu prvního pololetí roku 2007) se stala reálnou myšlenka plošné vakcinace, která by v horizontu několika desetiletí mohla vést k eliminaci značné části případů karcinomu děložního hrdla, ale pravděpodobně by významně ovlivnila i prevalenci také dalších karcinomů etiologicky spjatých s infekcí HPV, tedy i karcinomu orofaryngu, a v menší míře i nádorů některých dalších lokalizací na hlavě a krku. Z tohoto pohledu má znalost prevalence HPV, včetně údajů o přítomných typech HPV, základní důležitost a může být podkladem pro rozhodování s budoucím významným dopadem na incidenci některých nádorů.

Cíle práce

Cílem předkládané publikace je podat přehled o přítomnosti a významu HPV u nádorů ústní dutiny a orofaryngu v české populaci, o rizikových faktorech těchto nádorů a o možném využití poznatků o HPV v klinické praxi. Výsledky tuzemské studie pak zařazujeme do kontextu světového výzkumu dané problematiky. Práce vychází z výzkumu HPV na Klinice otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku 1. lékařské fakulty UK ve spolupráci s Oddělením experimentální virologie ÚHKT. Tato pracoviště zkoumají přítomnost HPV v nádorech hlavy a krku již více než 10 let. Prvními společně řešenými otázkami byl význam HPV v etiologii laryngeální papilomatózy a jejich úloha u invertovaného papilomu. V posledních letech je podobně jako na řadě zahraničních pracovišť nejvíce zkoumána role HPV v etiopatogenezi karcinomu orofaryngu (26). První část výzkumu byla zaměřena na zjištění prevalence HPV infekce v nádorech různých lokalizací. Epidemiologická studie zkoumala možné etiologické faktory orálního a orofaryngeálního dlaždicového karcinomu a zabývala se otázkou rozdílů mezi skupinami pacientů s HPV negativními a pozitivními nádory. Dalším tématem řešeným v současnosti je otázka prognostického významu HPV infekce u těchto nádorů a rozdílů klinického průběhu u nemocných obou skupin. Zároveň s tímto tématem byly zkoumány i prognostické faktory nádorů zejména orofaryngu obecně. Velká část výzkumu byla též orientována na hledání optimálních diagnostických technik a odběru materiálu pro detekci HPV DNA a HPV-specifických protilátek. Posledním tématem je využití HPV specifických protilátek ve sledování pacientů. 

MATERIÁL A METODY

Do studie byli postupně zařazováni všichni pacienti léčení pro karcinom ústní dutiny a orofaryngu na Klinice otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK, kteří se zařazením do studie souhlasili a podepsali informovaný souhlas. Pacienti s předchozím tumorem a pacienti se vzdálenými metastázami byli vyloučeni. Demografická data a informace o expozici rizikovým faktorům a o sexuálním chování byly získávány pomocí dotazníků, které byly poté převedeny do digitální formy. Všem pacientům byl odebrán vzorek tumoru, výplach ústní dutiny a 5 ml krve. Spolupracovníci zpracovávající materiál byli z laboratorního pracoviště a neměli přístup k údajům identifikujícím jednotlivé pacienty. Kromě souboru pacientů byl vytvořen i soubor věkem a pohlavím odpovídajících kontrol z pacientů léčených na klinice pro benigní diagnózy. Pro sběr dat byl použit stejný dotazník a od kontrol byl získán výplach ústní dutiny a krev. Do konce roku 2006 bylo do studie zařazeno celkem 164 pacientů a 148 kontrol. Vyšetřen byl dosud materiál 86 pacientů a 124 kontrol. Ve skupině 86 pacientů s kompletním vyšetřením byla většina tumorů lokalizována v orofaryngu (87,2 %) a jen 12,8 % tumorů bylo v ústní dutině. Orofaryngeální lokalizace zahrnovaly kořen jazyka (n=10), tonzilu (n=54), měkké patro (n=2) a jiné části orofaryngu (n=9). Orální tumory se nacházely na spodině ústní dutiny (n=5), jazyku (n=4) a jiných částech ústní dutiny (n=2). V analyzovaném souboru bylo 68 mužů (průměrný věk 58,6 let; rozsah 40-77) a 18 žen (průměrný věk 55,3 let; rozsah 44-71).

Pro detekci HPV byla použita tkáň nádorů z parafinových řezů, získaná sendvičovou technikou. Jde o metodu, při které je histologicky ověřena přítomnost nádoru v řezu před a po zkoumaném vzorku. Buněčný koncentrát z výplachů byl získán centrifugací.

Přítomná HPV DNA byla amplifikována pomocí polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction = PCR). Detekce a zjištění typu byly prováděny pomocí obrácené hybridizace a případně sekvenací. Detekce HPV-specifických protilátek byla prováděna metodou sendvičové enzymatické imunoanalýzy (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay = ELISA) a jako antigeny byly použity kapsidy (virus-like particles = VLP) odvozené od čtyř HR HPV a dvou LR HPV (low risk = LR) typů a dále rekombinantní antigeny odvozené od virových onkoproteinů E6 a E7. Metody byly již podrobněji popsány (26).

Statistická analýza dat

Pro porovnání průměrů kontinuálních proměnných mezi skupinami jsme použili t-test a ÷ 2-test. V 2x2 tabulkách byly vypočteny poměry šancí (odds ratio = OR) s 95% intervaly spolehlivosti (confidence interval = CI) a hladinou významnosti á = 0,05 pro dvoustranné testy pomocí programu EPI INFO statistical package (2002) a GraphPad InStat (version 3,00) (GraphPad Software, San Diego, CA). Korelace mezi proměnnými a pozitivitou na HPV byla hodnocena za použití logistické mnohorozměrné regrese.

Přežití bylo měřeno ve dnech od data diagnózy až po úmrtí či do data posledního kontaktu s pacientem. Datum úmrtí pacienta, který zemřel z jiné příčiny než na sledovaný nádor, bylo hodnoceno jako cenzurovaný údaj v analýze specifického přežití vztaženého k nádoru. Míry přežití byly odhadovány Kaplan-Meierovou metodou. Významnost rozdílu v přežívání mezi skupinou pacientů s HPV pozitivními a HPV negativními nádory byla vypočtena pomocí log-rank testu. Pomocí Coxovy mnohorozměrné regrese jsme ověřili faktory ovlivňující prognózu pacienta. Významnost byla vypočtena pro hladinu významnosti á = 0,05 (dvoustranný test). Analýzy byly provedeny pomocí programu SPSS (version 12; SPSS Inc., Chicago, IL).

Množství spotřebovaného tabáku bylo vyjádřené jako rok/balíček.  Jeden rok/balíček znamená kouření 1 balíčku (20 cigaret) za den po dobu 1 roku. Množství vypitého alkoholu bylo vyjádřené počtem dávek za týden. Dávkou alkoholu se rozumí 0,5 l piva, 0,2 l vína nebo 0,05 l destilátu. Při analýze rizikových faktorů byli pacienti rozděleni do skupin: nekuřáci, bývalí kuřáci (kouřili pravidelně alespoň půl balíčku cigaret za týden po dobu jednoho roku nebo více, ale nebyli kuřáky v době diagnózy), a současní kuřáci. Podobné definice byly použity u konzumace alkoholu; abstinenti (nepili nikdy), bývalí pijáci (pili průměrně jednu dávku alkoholu nebo více za týden, ale nepili v době diagnózy) a současní konzumenti alkoholu. 

VÝSLEDKY

Epidemiologie – HPV prevalence a lokalizace

Prevalence HPV byla zjišťována u kompletního souboru 86 vyšetřených pacientů. Přítomnost HPV DNA byla nalezena u 61,6 % tumorů. Nalezli jsme jen vysoko rizikové typy HPV, a to častěji u tumorů orofaryngu (51/75, 68 %) než u tumorů ústní dutiny (2/11, 18,2 %). Nejvyšší HPV prevalence byla nalezena u tumorů patrových mandlí (41/52, 80 %). Právě lokalizace tumoru byla ze všech zkoumaných klinických faktorů nejvýznamněji asociována s HPV pozitivitou (p=0,002).

Epidemiologie – charakteristika skupiny pacientů s HPV pozitivními tumory

Epidemiologické a demografické charakteristiky byly zkoumány u souboru 68 mužů a 18 žen. Současných kuřáků bylo 50 % (průměrně kouřili 37 let), 40 % bylo bývalých kuřáků (průměrně kouřili 31 let) a 10 % bylo nekuřáků. Současných konzumentů alkoholu bylo 63 % (průměrně pili 38 let), 13 % byli bývalí konzumenti alkoholu (průměrně pili 26 let) a 24 % pacientů nikdy nepilo alkohol.

Tumory nekuřáků a abstinentů byly častěji HPV DNA pozitivní než tumory pacientů s konzumací tabáku (p pro trend=0,0001) a alkoholu (p pro trend=0,081) v anamnéze.  Prevalence HPV DNA v tumorech byla podobná ve skupině pacientů s více než 6 sexuálními partnery za život jako ve skupině s 6 a méně partnery (61,9 %, versus 58,5 %; p=0,824). Podobně nebyl rozdíl v HPV pozitivitě mezi skupinami pacientů praktikujících a nepraktikujících oro-genitální sex (64,3 %, versus 55,2 %; p=0,484) a oro-anální sex (70 %, versus 60 %, p=0,824). Nebyly zjištěny rozdíly ani z hlediska věku a pohlaví. HPV DNA pozitivní tumory byly nalezeny v 55,6 % pacientů (20/36) mladších než 55 let a v 66,0 % pacientů (33/50) starších 55 let (p=0,373). Prevalence HPV DNA byla u žen 72,2% (13/18) a u mužů 58,8% (40/68; p=0,415).

Skupina pacientů s HPV pozitivními nádory se vyznačuje z epidemiologického hlediska nižším výskytem kuřáků a konzumentů alkoholu než skupina pacientů s HPV negativními nádory. Z hlediska sexuálního chování, věku a pohlaví nebyl zjištěn mezi oběma skupinami rozdíl.

Epidemiologie – rizikové faktory

Rizikové faktory obecně byly zkoumány na skupině 86 pacientů a 124 kontrol. V souhlase s očekáváním bylo jako nejvýznamnější rizikový faktor zjištěno kouření tabáku (p=0,0003). Mezi pacienty bylo 82,6 % kuřáků s konzumací větší než 5.4 roků/balíček, zatímco mezi kontrolami bylo těchto kuřáků 49,5 %. Dalším významným rizikovým faktorem byla konzumace alkoholu (p=0,036). Více než 4 dávky alkoholu za týden konzumovalo 67,4 % pacientů a 49,5 % kontrol. Nízké vzdělání je rovněž významným faktorem, méně než 12 let do školy chodilo 68 % pacientů a 51 % kontrol (p=0,03). Překvapivě se mezi rizikové faktory zařadil počet životních sexuálních partnerů, více než 6 jich uvedlo 51 % pacientů a 30 % kontrol (p=0,004). Naproti tomu v provozování oro-genitálního sexu a oro-análního sexu nebyl mezi pacienty a kontrolami žádný rozdíl (66 % versus 76 %; p=0,106 a 12 % versus 7,3 %, p=0,326, respektive).

Vliv HPV na prognózu

Z hlediska přežití bylo analyzováno 81 pacientů léčených chirurgicky. Z nich žije 3 až 5 let po léčbě 48 (59 %) a zemřelo 33 pacientů. Příčinou smrti byla v 28 případech recidiva nebo per-zistence původního onemocnění, ve 2 případech další primární nádor a ve 3 případech jiné neonkologické onemocnění. Ve skupině nemocných s HPV pozitivními  nádory přežívalo 73,1 %, naproti tomu ve skupině pacientů s HPV negativními nádory jen 34,5 %. Rozdíl je signifikantní jak v přežití celkovém (p=0,0013), tak i ve specifickém přežití vztaženém k nádoru (p=0,002). Zastoupení pacientů s přítomností regionálních metastáz bylo v obou skupinách podobné (81 % versus 76 %). Mezi skupinou s HPV pozitivními a HPV negativními nádory nebyly nalezeny signifikantní rozdíly ani v celkovém množství regionálních uzlinových metastáz, ani v přítomnosti uzlin s šířením tumoru mimo pouzdro.

Prognostické faktory karcinomu ústní dutiny a orofaryngu

Ve sledované skupině 81 pacientů léčených chirurgicky pro nádory ústní dutiny a orofaryngu byla nejvýznamnějším prognostickým faktorem přítomnost HPV. Dalšími významnými faktory bylo pohlaví a přítomnost extrakapsulárního šíření. Mužské pohlaví a uzliny s šířením nádoru mimo pouzdro signifikantně zhoršovaly přežití, zatímco přítomnost HPV v nádoru naopak prognózu významně zlepšovala. Dalším významným faktorem byla podle očekávání klasifikace T. Poměr šancí (OR) pro smrt následkem tumoru byl 4,0 mezi T1 a T4. Klasifikace N překvapivě neměla ve zkoumaném souboru pacientů prognostický význam. Prognóza pacientů s uzlinovou klasifikací N1 byla dokonce lepší (OR=0,714) než pacientů s N0. Vyšší počet nádorem postižených uzlin byl asociován s horší prognózou, avšak nevýznamně. Věk neměl na přežití vliv. Výsledky byly podobné i po korekci na jednotlivé faktory mezi sebou a na konzumaci tabáku a alkoholu.

Nejdůležitějším nezávislým prognostickým faktorem ve sledované skupině pacientů byla přítomnost HPV DNA v buňkách nádoru.

Diagnostika - cytologie

Ve studiích byla zkoumána přítomnost HPV DNA přímo v nádorové tkáni a zároveň ve výplachu ústní dutiny. Cílem bylo ověřit vhodnost výplachů jako klinického materiálu pro detekci HPV, a zjistit spolehlivost tohoto vyšetření. Korelace přítomnosti HR HPV ve vzorku výplachu a v tkáni byla vysoce signifikantní (p<0,0001). Navíc byla velmi dobrá shoda v přítomnosti stejného typu HPV v obou typech materiálů (60,4 %).

Dále byla porovnávána prevalence HPV ve výplaších ústní dutiny u pacientů s nádory a v kontrolní skupině. To nám umožnilo  porovnat prevalenci virů a jejich typovou specificitu mezi oběma skupinami a ověřit možnost použití výplachů jako diagnostického markeru rizikové skupiny. HPV DNA jsme zjistili ve výplachu u 48,8 % (42/86) pacientů a 12,9 % (16/124) kontrol (p<0,0001). U pacientů byly zjištěny převážně HR HPV typy – v 89,2 % a z toho HPV16 v 73,9 % těchto pozitivních izolátů. U kontrol se HR HPV vyskytly jen v 5 případech (31,3 % pozitivních izolátů), další případy tvořily potenciálně nové, kožní a nízce rizikové typy.

Přítomnost viru ve tkáni a ve výplachu vysoce koreluje. Z toho plyne, že výplach by byl vhodnou neinvazivní metodou odběru materiálu od pacientů. U zdravých jedinců se HR HPV v ústní dutině a orofaryngu vyskytují vzácně, zatímco u pacientů s tumory jsou v buňkách z výplachů zjišťovány převážně HR HPV. Z toho vyplývá možnost využít vyšetření orálního výplachu jako markeru rizika.

Diagnostika - HPV - Specifické protilátky

U pacientů s nádory orofaryngu jsme našli signifikantně vyšší hladinu protilátek proti kapsidovým proteinům HPV signalizujícím přítomnost HPV infekce ve srovnání s kontrolní skupinou (58,7 % versus 29,8 %, p<0,0001). Tento rozdíl byl zjištěn i u nádorů ústní dutiny, ale pravděpodobně díky menšímu počtu pacientů s touto lokalizací nádoru nebyl signifikantní (45,5 % versus   29,8 %, p=0,308). Ještě výraznější rozdíl jsme zaznamenali u antigenů specifických pro virové onkoproteiny, jejichž přítomnost je spojena s  invazivním onemocněním. U pacientů s orofaryngeálními nádory byla prevalence protilátek proti HPV16 E6 a E7 antigenu 73,2% a 29,9% a u kontrolní skupiny 1,0% a 2,9% (p<0,0001 v obou případech). Žádný z pacientů s nádorem dutiny ústní neměl protilátky proti těmto antigenům.

Výsledky ukazují na možnost využití HPV specifických protilátek, především anti-HPV 16 E6/E7 v diagnostice nádorů orofaryngu, ale nikoli nádorů ústní dutiny.

Význam HPV markerů pro sledování pacientů

Při sledování pacientů v rámci studie byla od pacientů získána krev 1 měsíc po léčbě a krev a výplach dutiny ústní 1 rok po ukončení léčby. V předcházejících kapitolách jsme již ukázali, že pacienti s HPV pozitivními nádory měli signifikantně lepší prognózu.

Z hlediska detekce HPV DNA jsme z původního počtu 37 pacientů pozitivních ve výplachu na HR HPV při náběru rok po léčbě měli k dispozici výplach od 28 pacientů bez známek původní nemoci (4 zemřeli před kontrolou a u 5 nebyla v době hodnocení k dispozici kontrolní séra). Pouze v jednom vzorku jsme detekovali HR HPV, ve dvou pak LR HPV svědčící o nové infekci.

Od pacientů séropozitivních v prvním odběru jsme měli k dispozici párová séra v případě VLP16 u 24 osob, v případě E6 u 30 a v případě E7 u 20 pacientů. Zjistili jsme, že hladina protilátek proti kapsidovým proteinům se po léčbě nemění (p=0,294), ale dochází k velmi výraznému poklesu protilátek proti virovým onkoproteinům E6 a E7 (p<0,0001 pro E6 i E7).

Výsledky detekce HPV DNA i HPV-specifických protilátek jasně dokazují etiologickou úlohu HR HPV u karcinomů orofaryngu a naznačují možnost využití protilátek proti virovým onko-proteinům při sledování pacientů. Zatímco hladina protilátek proti kapsidovým proteinům svědčí o HPV infekci aktuální nebo v anamnéze, hladina protilátek proti virovým onkoproteinům E6/E7 pravděpodobně koreluje s klinickým průběhem. Další postup studie ukáže, zda tyto markery mohou spolehlivě indikovat rekurenci nebo perzistenci onemocnění a přispět tak ke zlepšení kvality sledování. 

DISKUSE

Incidence, lokalizace

Nedávno publikovaná meta-analýza zahrnující přes 5000 případů (14) potvrzuje závislost prevalence HPV na lokalizaci tumoru. HPV DNA byla nalezena ve 20 – 25% nádorů ústní dutiny a hrtanu, a přibližně u 30 % nádorů orofaryngu. Rozpětí je však v referovaných publikacích široké a pohybuje se, bez ohledu na lokalizaci, v rozmezí 0-70 %. V novějších publikacích je prevalence HPV pozitivity vyšší a pohybuje se v rozpětí 55-75 % u orofaryngeálních a 10-35 % u orálních karcinomů.

Vysvětlení rozdílů v prevalenci HPV v různých publikacích je možno hledat v různém výskytu HPV infekce ve studovaných populacích, ale i v odlišných laboratorních metodách nebo v systematických chybách při zařazování pacientů do jednotlivých studií. Obecně je vyšší prevalence popisována v pracích používajících PCR, než tam, kde detekce HPV DNA probíhala hybridizací Southern blot nebo in situ. Záleží i na použitých primerech, zdá se, že primery vymezující delší fragmenty DNA hůře fungují ve vzorcích získaných z parafinových bločků, než primery vymezující  kratší segmenty (20). Volba diagnostického testu je tedy velmi důležitá. Spolehlivost vyšetření lze zvýšit kombinací testů, což ale zvyšuje personální i finanční náročnost studií. Některé publikované soubory jsou dosti malé a výsledky tak mohou být zatíženy chybou malých čísel. Srovnání epidemiologických dat u HPV pozitivních tumorů hlavy a krku je v současné době obtížné pro nejednotnost metodologie v různých studiích. Metody se však postupně zlepšují a klesá jejich cena, takže můžeme očekávat, že v budoucnosti budeme mít přesnější údaje o prevalenci HPV v nádorech různých lokalizací na hlavě a krku v různých regionech.

Prakticky vždy je uváděna nejvyšší prevalence HPV DNA v nádorech orofaryngu, což by mohlo potvrzovat těsnější vztah nádorů této lokalizace k infekci HPV. Možným  vysvětlením této skutečnosti je histologické uspořádání epitelu a měkkých tkání. Význam hraje zřejmě submukózní uložení lymfatické tkáně v orofaryngeální oblasti. Toto uspořádání je přirovnáváno k atypické architektonice povrchových vrstev epitelu děložního hrdla, kde převážně vznikají nádory ženského genitálního traktu s prokázanou HPV etiologií (27). Význam má patrně také rozsáhlý povrch epiteliálního krytu tonzil zvětšený díky četným kryptám.

Na relativně vysoké prevalenci HPV pozitivity v souboru českých pacientů se mohou podílet všechny jmenované faktory. HPV infekce může být v České republice silně rozšířená, jak o tom svědčí i vysoká incidence karcinomu děložního hrdla. Použitá metodika zahrnovala PCR a má proto vysokou senzitivitu. Nelze vyloučit ani systémovou deformaci ve výběru pacientů, protože na zdejší pracoviště jsou směřováni pacienti s větším podílem rozsáhlejších nádorů.

Epidemiologie- rizikové faktory

Z epidemiologického hlediska jsou důležité charakteristiky skupiny pacientů s HPV pozitivními tumory. Většina autorů uvádí, že pacienti s HPV pozitivními tumory jsou častěji nekuřáky a méně konzumují alkohol (5, 19, 24), někdy je uváděno, že pacienti s HPV pozitivními tumory jsou mladší a častěji jde o ženy (24). Kouření, jako nejvýznamnější tradiční rizikový faktor je nejsilněji asociováno s HPV negativními tumory. Prevalence HPV pozitivity je u nekuřáků až 70% (4).

Data z české populace se s uvedenými závěry shodují, tumory pacientů bez abusu tabáku a alkoholu byly častěji HPV pozitivní než tomu bylo u pacientů s „klasickými“ rizikovými faktory. Věk a pohlaví v našem souboru roli nehrály.

Dalším studovaným znakem je sexuální chování. Stejně jako u onkogynekologických onemocnění je vyšší sexuální aktivita možným rizikovým faktorem pro nádory hlavy a krku. HPV infekce je obecně považována za převážně pohlavně přenosnou (11). Rizikové chování zahrnuje větší počet sexuálních partnerů, praktikování oro-anální a oro-genitální formy sexuálního kontaktu. To vede ke zvýšené pravděpodobnosti infekce HPV. Dle některých autorů je prokazatelná souvislost mezi sexuálním chováním a vznikem HPV pozitivních tumorů v oblasti hlavy a krku (8, 24).

Tento vztah v prezentovaném souboru nebyl prokázán. Vyšší počet sexuálních partnerů ani sledované sexuální aktivity nebyly u české populace rizikovým faktorem HPV infekce. Naproti tomu signifikantně více pacientů než kontrol udalo více jak 6 sexuálních partnerů.

Prognóza

Prognostický význam přítomnosti HPV v tumorech hlavy a krku je dosud nejistý. V poslední době řada autorů popisuje lepší léčebné výsledky u pacientů s HPV pozitivními tumory než má skupina s HPV negativními tumory (3, 6, 13, 15, 19, 21), jiní však mezi těmito skupinami rozdíly nenalezli (9, 12, 13, 25). 

Pacienti s HPV pozitivními tumory se mohou lišit věkem, pohlavím, klasifikací T a N, diferenciací tumoru a dalšími charakteristikami. Ve většině publikací autoři korigují výsledky přežití některými z těchto parametrů, avšak výsledky jsou nestejné a studie jsou obtížně srovnatelné (6, 9, 15, 17, 21, 25), protože jsou používány různé korekce. Významem regionálního metastazování pro přežití se zabývá Hoffmann a spol. (9). Autoři nenašli rozdíl v léčebných výsledcích mezi pacienty s HPV pozitivními a HPV negativními tumory, ale zjistili významně vyšší postižení uzlin u HPV pozitivních tumorů. Jen pokud byli srovnáváni pacienti se stejnou klasifikací N, bylo prokázáno lepší přežití HPV pozitivních pacientů. Vyšší klasifikace N u HPV pozitivních tumorů byla popisována i ve studii Smith a spol.. Tyto výsledky odporují našim zjištěním, protože v našem souboru bylo jak celkové, tak specifické přežití HPV pozitivních pacientů výrazně lepší, zatímco klasifikace N se mezi oběma skupinami nelišila.

Dosud chybí vysvětlení možné lepší prognózy pacientů s HPV pozitivními tumory. Lepší výsledky léčby byly přičítány vyšší radiosenzitivitě (16, 17) nebo aktivní protivirové buněčné imunitní odpovědi (3). Je možné, že menší poškození buněčného genomu u HPV pozitivních tumorů způsobuje jejich příznivější odezvu na léčbu, což by v budoucnu měly objasnit další molekulárně biologické studie. K vysvětlení jsou nezbytné i další epidemiologické studie sledující klinický průběh zároveň s parametry HPV infekce.

Diagnostika - Cytologie

Odběr materiálu z tumoru představuje komplikaci zejména pokud bychom chtěli využívat informaci o přítomnosti HPV v rozhodnutí o léčebném postupu, u kontrolních souborů je pak jiný neinvazivní způsob získání materiálu nutností. Buňky k vyšetření přítomnosti HPV lze získat výplachem ústní dutiny, případně stěrem ze sliznice ústní dutiny a orofaryngu. Publikované výsledky většinou, stejně jako naše výsledky, demonstrují silnou asociaci mezi infekcí HR HPV a orálním/orofaryngeálním karcinomem (7, 23), i když multicentrická studie prováděná IARC stejnou korelaci neprokázala především z důvodu špatné kvality výplachů (8). Negativní cytologické vzorky u pacientů s HPV pozitivními tumory mohou svědčit o tom, že virová nálož byla v těchto případech nižší, jak o tom svědčí výsledky korelace počtu virových kopií ve výplachu s HPV pozitivitou nádoru (28). Pro jednoznačný závěr o vhodnosti použití výplachů jako screeningového testu bude zapotřebí dalších studií.

Sérologie v diagnostice a sledování pacientů

Stejně jako ostatní infekce i HPV v lidském těle indukují imunitní odpověď. Tělo produkuje protilátky proti proteinovým součástem virové kapsidy i proti časným virovým proteinům, včetně onkoproteinů E6 a E7. Závislost hladin protilátek na přítomnosti HPV pozitivních nádorových buněk by mohla být využitelná v časné diagnostice nádorových onemocnění hlavy a krku a ve sledování průběhu onemocnění, tedy časné detekce rekurencí HPV pozitivních tumorů. Výhodou sérologie je samozřejmě možnost získání potřebné informace bez nutnosti invazivního odběru vzorku. 

Byla zjištěna velmi těsná vazba mezi zvýšeným titrem HPV specifických protilátek a výskytem HPV-16 pozitivního karcinomu (8, 22). Protilátky proti HPV 16 E6/E7 onkoproteinům vykazují lepší korelaci mezi zvýšením hladin a výskytem HPV pozitivních karcinomů hlavy a krku. Přítomnost těchto protilátek podstatně zvyšuje riziko vzniku karcinomu horních cest dýchacích a polykacích. Například u orofaryngu uvádějí autoři poměr šancí (OR) pro vznik nádoru u séropozitivních jedinců 9,2 až 72,8 (8, 22).

Výsledky publikovaných studií svědčí podobně jako naše výsledky o tom, že přítomnost protilátek proti E6 a E7 lze velmi pravděpodobně využít jako velmi specifického biomarkeru přítomnosti HPV pozitivních tumorů. Další možností sérologie je její využití při sledování pacientů po léčbě, jak naznačují výsledky české studie. Pacienti souboru jsou dále sledováni a v dalším průběhu studie bude tato teorie dále ověřována.

Práce byla podporována grantem IGA MZ ČR NR/8126–3. 

Došlo 22. 1. 2007 

Doc. MUDr. Jan Klozar, CSc.

Na Topolce 7

140 00  Praha 4


Zdroje

1. Cancer Incidence 2003. 2006, Prague: UZIS.

2. Andl, T., Kahn, T., Pfuhl, A., Nicola, T., Erber, R., Conradt, C., Klein, W., Helbig, M., Dietz, A., Weidauer, H.,Bosch, F. X.: Etiological involvement of oncogenic human papillomavirus in tonsillar squamous cell carcinomas lacking retinoblastoma cell cycle control. Cancer Res, 58, 1998, s. 5-13.

3. Dahlstrand, H. M.,Dalianis, T.: Presence and influence of human papillomaviruses (HPV) in Tonsillar cancer. Adv. Cancer Res., 93, 2005, s. 59-89.

4. Dahlstrom, K. R., Adler-Storthz, K., Etzel, C. J., Liu, Z., Dillon, L., El-Naggar, A. K., Spitz, M. R., Schiller, J. T., Wei, Q. Sturgis, E. M.: Human papillomavirus type 16 infection and squamous cell carcinoma of the head and neck in never-smokers: a matched pair analysis. Clin. Cancer Res., 9, 2003, s. 2620-2626.

5. Fouret, P., Monceaux, G., Temam, S., Lacourreye, L., St Guily, J. L.: Human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinomas in nonsmokers. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 123, 1997, s. 513-516.

6. Gillison, M. L., Koch, W. M., Capone, R. B., Spafford, M., Westra, W. H., Wu, L., Zahurak, M. L., Daniel, R. W., Viglione, M., Symer, D. E., Shah, K. V.,Sidransky, D.: Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers. J. Natl. Cancer Inst., 92, 2000, s. 709-720.

7. Hansson, B. G., Rosenquist, K., Antonsson, A., Wennerberg, J., Schildt, E. B., Bladstrom, A., Andersson, G.: Strong association between infection with human papillomavirus and oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma: a population-based case-control study in southern Sweden. Acta Otolaryngol., 125, 2005, s. 1337-1344.

8. Herrero, R., Castellsague, X., Pawlita, M., Lissowska, J., Kee, F., Balaram, P., Rajkumar, T., Sridhar, H., Rose, B., Pintos, J., Fernandez, L., Idris, A., Sanchez, M. J., Nieto, A., Talamini, R., Tavani, A., Bosch, F. X., Reidel, U., Snijders, P. J., Meijer, C. J., Viscidi, R., Munoz, N.,Franceschi, S.: Human papillomavirus and oral cancer: the International Agency for Research on Cancer multicenter study. J. Natl. Cancer Inst., 95, 2003, s. 1772-1783.

9. Hoffmann, M., Gottschlich, S., Gorogh, T., Lohrey, C., Schwarz, E., Ambrosch, P., Kahn, T.: Human papillomaviruses in lymph node neck metastases of head and neck cancers. Acta Otolaryngol., 125, 2005, s. 415-421.

10. Chen, R., Aaltonen, L. M.,Vaheri, A.: Human papillomavirus type 16 in head and neck carcinogenesis. Rev. Med. Virol., 15, 2005, s. 351-363.

11. Kjaer, S. K., Chackerian, B., van den Brule, A. J., Svare, E. I., Paull, G., Walbomers, J. M., Schiller, J. T., Bock, J. E., Sherman, M. E., Lowy, D. R., Meijer, C. L.: High-risk human papillomavirus is sexually transmitted: evidence from a follow-up study of virgins starting sexual activity (intercourse). Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 10, 2001, s. 101-106.

12. Klussmann, J. P., Weissenborn, S. J., Wieland, U., Dries, V., Eckel, H. E., Pfister, H. J., Fuchs, P. G.: Human papillomavirus-positive tonsillar carcinomas: a different tumor entity? Med Microbiol Immunol (Berl), 192, 2003, s. 129-132.

13. Koskinen, W. J., Chen, R. W., Leivo, I., Makitie, A., Back, L., Kontio, R., Suuronen, R., Lindqvist, C., Auvinen, E., Molijn, A., Quint, W. G., Vaheri, A.,Aaltonen, L M.: Prevalence and physical status of human papillomavirus in squamous cell carcinomas of the head and neck. Int. J. Cancer, 107, 2003, s. 401-406.

14. Kreimer, A. R., Clifford, G. M., Boyle, P., Franceschi, S.: Human papillomavirus types in head and neck squamous cell carcinomas worldwide: a systematic review. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 14, 2005, s. 467-475.

15. Li, W., Thompson, C. H., O‘Brien, C. J., McNeil, E. B., Scolyer, R. A., Cossart, Y. E., Veness, M J., Walker, D. M., Morgan, G. J.,Rose, B. R.: Human papillomavirus positivity predicts favourable outcome for squamous carcinoma of the tonsil. Int.J. Cancer, 106, 2003, s. 553-558.

16. Lindel, K., Beer, K. T., Laissue, J., Greiner, R. H.,Aebersold, D. M.: Human papillomavirus positive squamous cell carcinoma of the oropharynx: a radiosensitive subgroup of head and neck carcinoma. Cancer, 92, 2001, s. 805-813.

17. Mellin, H., Friesland, S., Lewensohn, R., Dalianis, T.,Munck-Wikland, E.: Human papillomavirus (HPV) DNA in tonsillar cancer: clinical correlates, risk of relapse, and survival. Int. J. Cancer, 89, 2000, s. 300-304.

18. Mellin, H. D., Munck-Wikland, E., Dahlgren, L., Dalianis, T.: Occurrence of human papillomavirus is a positive factor in tonsillar cancer. Reduced risk of recurrence and longer survival]. Lakartidningen, 101, 2004, s. 2794-6, 2798.

19. Ritchie, J. M., Smith, E. M., Summersgill, K. F., Hoffman, H. T., Wang, D., Klussmann, J. P., Turek, L. P.,Haugen, T. H.: Human papillomavirus infection as a prognostic factor in carcinomas of the oral cavity and oropharynx. Int. J. Cancer, 104, 2003, s. 336-344.

20. Schlecht, N. F.: Prognostic value of human papillomavirus in the survival of head and neck cancer patients: an overview of the evidence. Oncol. Rep., 14, 2005, s. 1239-1247.

21. Schwartz, S. R., Yueh, B., McDougall, J. K., Daling, J. R., Schwartz, S. M.: Human papillomavirus infection and survival in oral squamous cell cancer: a population-based study. Otolaryngol Head Neck Surg., 125, 2001, s. 1-9.

22. Smith, E. M., Ritchie, J. M., Pawlita, M., Rubenstein, L. M., Haugen, T. H., Turek, L. P., Hamsikova, E.: Human papillomavirus seropositivity and risks of head and neck cancer. Int. J. Cancer, 120, 2006, s. 825-832.

23. Smith, E. M., Ritchie, J. M., Summersgill, K. F., Hoffman, H. T., Wang, D..H., Haugen, T. H.,Turek, L. P.: Human papillomavirus in oral exfoliated cells and risk of head and neck cancer. J. Natl. Cancer Inst., 96, 2004, s. 449-455.

24. Smith, E. M., Ritchie, J. M., Summersgill, K. F., Klussmann, J .P., Lee, J. H., Wang, D., Haugen, T. H., Turek, L. P.: Age, sexual behavior and human papillomavirus infection in oral cavity and oropharyngeal cancers. Int. J. Cancer, 108, 2004, s. 766-772.

25. Strome, S. E., Savva, A., Brissett, A. E., Gostout, B. S., Lewis, J., Clayton, A. C., McGovern, R., Weaver, A. L., Persing, D.,Kasperbauer, J. L.: Squamous cell carcinoma of the tonsils: a molecular analysis of HPV associations. Clin. Cancer Res., 8, 2002, s. 1093-1100.

26. Tachezy, R., Klozar, J., Salakova, M., Smith, E., Turek, L., Betka, J., Kodet, R., Hamsikova, E.: HPV and other risk factors of oral cavity/oropharyngeal cancer in the Czech Republic. Oral. Dis., 11, 2005, s. 181-185.

27. Winer, R. L., Lee, S. K., Hughes, J. P., Adam, D. E., Kiviat, N. B.,Koutsky, L. A.: Genital human papillomavirus infection: incidence and risk factors in a cohort of female university students. Am. J. Epidemiol., 157, 2003, s. 218-226.

28. Zhao, M., Rosenbaum, E., Carvalho, A. L., Koch, W., Jiang, W., Sidransky, D., Califano, J.: Feasibility of quantitative PCR-based saliva rinse screening of HPV for head and neck cancer. Int. J. Cancer, 117, 2005, s. 605-610.

Štítky
Audiologie a foniatrie Dětská otorinolaryngologie Otorinolaryngologie

Článek vyšel v časopise

Otorinolaryngologie a foniatrie

Číslo 2

2007 Číslo 2

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Jistoty a nástrahy antikoagulační léčby aneb kardiolog - neurolog - farmakolog - nefrolog - právník diskutují
nový kurz
Autoři: doc. MUDr. Štěpán Havránek, Ph.D., prof. MUDr. Roman Herzig, Ph.D., doc. MUDr. Karel Urbánek, Ph.D., prim. MUDr. Jan Vachek, MUDr. et Mgr. Jolana Těšínová, Ph.D.

Léčba akutní pooperační bolesti
Autoři: doc. MUDr. Jiří Málek, CSc.

Nové antipsychotikum kariprazin v léčbě schizofrenie
Autoři: Prof. MUDr. Cyril Höschl, DrSc., FRCPsych.

Familiární transthyretinová periferní polyneuropatie
Autoři: MUDr. Radim Mazanec, Ph.D.

Diabetes mellitus a kardiovaskulární riziko, možnosti jeho ovlivnění
Autoři:

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se