Diagnostické stanovení plazmatických D-dimerů dnes

Souhrn

V současnosti neexistuje jednotný konsenzus ohledně jednotek pro vyjádření laboratorních výsledků D-dimerů jako jednoho ze specifických fibrin (ogen) degradačních produktů (FDP). V odborné veřejnosti se často řeší otázka, v jakých jednotkách tento marker odbourávání fibrinu vydávat, resp. jakou použít diagnostickou soupravu, jelikož různí výrobci používají různé jednotky měření. Jedná se o mg/l FEU nebo mg/l DDim navázané na různé kalibrátory. Provedli jsme srovnávací pilotní studii plazmatické koncentrace D-dimerů ve dvou běžně používaných jednotkách:  mg/l FEU (fibrinogen ekvivalentní jednotky) a mg/l DDim (DDim, DDU jednotky). Výsledky byly získány imunoturbidimetrickým měřením při užití dvou různých diagnostických souprav –⁠ jedna kalibrovaná v mg/l DDim a druhá v mg/l FEU. Obě soupravy pro měření D-dimerů pocházely od stejného výrobce a využívaly princip měření LIA vysoce citlivou metodou s certifikací pro klinické vyloučení DVT a PE. Do souboru bylo zahrnuto 65 vzorků plazmy dospělých pacientů (bez rozlišení pohlaví, věku a diagnózy), u nichž byly porovnány naměřené koncentrace D-dimerů oběma diagnostickými soupravami. Primárně a rutinně jsme použili soupravu kalibrovanou v mg/l DDim. Stejné vzorky plazmy byly následně změřeny pomocí další diagnostické soupravy kalibrované v jiných měřících jednotkách –⁠ v mg/l FEU. Naměřená průměrná koncentrace byla 0,524 mg/l DDim (SD = 1,066) a ve fibrinogen ekvivalentních jednotkách 1,598 mg/l FEU (SD = 3,315). Ze statistického zpracování dat pomocí neparametrické Passing-Bablok regrese vyplývá, že vztah mezi oběma jednotkami není dvojnásobný, jak bylo dříve někdy obecně prezentováno v literatuře a v povědomí odborné veřejnosti, ale ve skutečnosti může být až trojnásobný. Výsledky naměřené různými testy, tj. bez návaznosti kalibrátorů, nelze tedy nikterak číselně porovnávat. Doporučuje se používat vždy jednu validovanou metodu s definovaným cut-off stanoveným výrobcem.

Klíčová slova:

D-dimery – hluboká žilní trombóza – plicní embolie – diseminovaná intravaskulární koagulopatie – FEU (fibrinogen ekvivalentní jednotky) – LIA (Latex Immuno Assay) – fibrin (ogen) degradační produkty – DDim (jednotky vyjádřené v mg/l DDim)

ÚVOD

D-dimery jsou specifické proteolytické fragmenty vznikající při degradaci stabilizovaného fibrinu v krevní sraženině za účasti aktivovaného plazminu. Jsou považovány za marker trombotických stavů, přičemž jejich zvýšená koncentrace může indikovat přítomnost již vzniklého trombu v cévním řečišti [1]. Na druhou stranu však pozitivní výsledek může často odhalit i poruchu odbourávání D-dimerů při dalších hyperkoagulačních stavech, např. při úrazu, jaterních, maligních, hematoonkologických, zánětlivých, infekčních, septických a dalších reaktivních stavech spojených s aktivací koagulace (vč. gravidity). D-dimery mají charakter nespecifického zánětlivého markeru, proto jsou často mírně zvýšeny u starších chronicky nemocných a polymorbidních pacientů, ale např. také u těhotných žen apod. V nedávné době byly D-dimery popsány také jako diagnostický a prognostický marker u pacientů s onemocněním COVID-19, a to v souvislosti se vznikem mikrotrombů při aktivované hemostáze s výraznou koagulopatií a často extrémně vysokými výsledky fibrin (ogen) degradačních produktů. Největší přínos měření D-dimerů však spočívá v rutinní diagnostice pro vyloučení akutních stavů –⁠ hluboké žilní trombózy (DVT), plicní embolie (PE) nebo diseminované intravaskulární koagulopatie (DIC). Kvalitně změřený výsledek –⁠ tj. výsledek měření testem s vysokou negativní prediktivní hodnotou (96–100 %) přináší diagnosticky cennou hodnotu v možnosti přímého vyloučení DVT, PE nebo DIC bez požadování dalších nákladných zobrazovacích vyšetření. D-dimery lze využít též jako vhodný laboratorní marker ke sledování a monitoraci léčby pacienta po prodělaném tromboembolickém onemocnění. Protože v současnosti nepanuje jednotný názor na vyjadřování laboratorních výsledků stanovení koncentrace D-dimerů jako jednoho ze specifických fibrin (ogen) degradačních produktů (FDP), je v odborné veřejnosti často řešena otázka, v jakých jednotkách tento marker odbourávání fibrinu vydávat a jakou použít diagnostickou soupravu.

Cílem této studie bylo vzájemné porovnání stanovení plazmatické koncentrace D-dimerů ve dvou běžně používaných jednotkách:  mg/l FEU (fibrinogen ekvivalentní jednotky) a mg/l DDim (DDim, DDU jednotkách). Měření v mg/l DDU udává skutečně naměřenou hodnotu fragmentů D-dimerů, zatímco mg/l FEU udává hodnotu D-dimerů relativně k fibrinogenu.

METODIKA

Pro srovnání byly použity dvě LIA diagnostické soupravy výrobce Instrumentation Laboratory (tab. 1). Obě metody využívaly princip latexové imunoturbidimetrie (LIA) –⁠ soupravy mají certifikaci vysoké senzitivity na DVT a PE kolem 100 %. Imunoturbidimetrické měření probíhalo na automatickém koagulometru ACL TOP 550 CTS.

Charakteristika testovaného souboru

V desetidenní studii bylo použito 65 náhodně vybraných vzorků plazmy od dospělých pacientů s rutinně indikovaným vyšetřením na D-dimery. Vzorky bez udané diagnózy byly zaslepeny, poměr mezi pohlavím ani věk nebyl znám. Jednalo se pouze o standardní čerstvé vzorky plazmy bez viditelných známek sraženiny, lipémie, hemolýzy a ikteru. Diagnózy k potvrzení DVT nebo PE nebyly známé. Ve studii se nevyskytly žádné odlehlé hodnoty.

Preanalytická fáze

Vzorky krve byly standardně odebrány dle platných doporučení ČHS ČLS JEP [2]. Byl použit uzavřený odběrový systém Greiner Bio-One typ Vacuette^® s citrátem sodným 3,2%. Po jemném promíchání byly zkumavky standardně centrifugovány 15 min při 2 500 g a byla získána plazma chudá na destičky (PLT < 10×10⁹/l).

Šetrně provedený odběr plné krve má být proveden s uvolněným turniketem, vpich nesmí být opakovaný, traumatický a nesmí následovat po i. m. injekci.

Analytická fáze

Měření oběma metodami byla provedena na automatickém koagulometru ACL TOP 550 CTS (Instrumentation Laboratory –⁠ IL) pomocí 2 diagnostických souprav Hemosil^® IL: D-Dimer HS (použité cut-off 0,230 mg/l DDim) a Hemosil^® IL: D-Dimer HS 500 (použité cut-off0,500 mg/l FEU). Hlavní složku diagnostika představuje latexová reagencie D-dimer HS, tj. suspenze polystyrenových latexových částic jednotné velikosti, které jsou pokryty fragmentem F (ab‘) 2 monoklonální protilátky (MA-8D3) vysoce specifické pro epitop Dpodjednotky D-dimerů v rozpustných derivátech fibrinu. Použití fragmentu F (ab‘) 2 umožňuje specifičtější detekci D-dimeru při vyloučení interference s některými endogenními faktory, např. revmatoidním faktorem. Po smíchání krevní plazmy obsahující D-dimer s latexovou reagencií a reakčním pufrem ze soupravy dojde k aglutinaci monoklonální protilátkou pokrytých latexových částic [3,4]. Zeslabení intenzity paprsku světla v infračervené oblasti při 671 nm po průchodu imunokomplexem (zákalem) je přímo úměrné koncentraci D-dimerů v měřeném vzorku plazmy. Při takto vysoké vlnové délce jsou potlačeny běžné optické interference (HIL –⁠ hemolýza, ikterus, lipémie) na minimum.

Vzhledem k různým složením latexových souprav na trhu (různé kalibrátory, odlišné monoklonální protilátky atd.) neexistuje doposud jednotný mezinárodní standard ISTH (International Society of Thrombosis and Haemostasis) pro navázání kalibrátorů a pro harmonizaci různých metodik stanovení D-dimerů v plazmě [5–7].

Statistická analýza

Výsledky byly vyjádřeny ve formě deskriptivní statistiky jako medián, průměr, minimum/maximum (min./max.), směrodatné odchylky (SD) a hodnoceny pomocí Pearsonova korelačního koeficientu. Ve studii nebyla testována podmíněná pravděpodobnost, proto nebyla pro hodnocení použitá tzv. Bayesova věta, toto statistické vyhodnocení by předpokládalo znalost diagnózy a její klinické potvrzení dalšími zobrazovacími metodami atd. Pro statistické vyhodnocení byla použita Passing-Bablokova regrese jako základní metoda robustní statistiky pro neparametrickou regresní analýzu. Pro testování linearity dat byl použit Kolmogorov-Smirnov CUSUM test (Statistica, Dell, USA). Bland-Altman plot byl vytvořen pomocí softwaru MedCalc^® Statistical Software version 20.010 (MedCalc Software Ltd, Ostend, Belgium).

VÝSLEDKY

Bylo analyzováno 65 vzorků citrátové plazmy. Průměrná koncentrace D-dimerů měřená metodou kalibrovanou v mg/l DDim byla 0,524 mg/l, zatímco u metody kalibrované v mg/l FEU byla průměrná koncentrace 1,598 mg/l FEU. Intercept u Passing-Bablokovy regrese 95% CI = –0,01264–0,04831; Slope: 95% CI = 2,925–3,288.

Statistické zpracování ukázalo, že vztah mezi těmito dvěma jednotkami může být i trojnásobný, nikoliv dvojnásobný, jak bývá někdy neodborně uváděno (vliv mají matrix vzorku, použitá metoda, vlastnosti kalibrátoru).

V souboru se vyskytly u 14 % výsledků primárně diskrepantní výsledky měření, kdy metodou kalibrovanou v mg/l DDim byly výsledky dle cut-off metody hodnoceny jako negativní a metodou v mg/l FEU jako mírně pozitivní.

Při použití obou souprav bylo dosaženo vysoké korelace (r² = 0,9789) a vztah mezi oběma metodami byl lineární.

Základní statistické údaje jsou uvedeny v tab. 2.

Průměrná koncentrace ze všech měření byla 0,524 mg/l DDim a ve fibrinogen ekvivalentních jednotkách 1,598 mg/l FEU. Pomocí Kolmogorov-Smirnova CUSUM testu nebyla zamítnuta hypotéza linearity, tj. lze se domnívat, že vztah mezi výsledky obou metod je lineární. Ze statistického zpracování pomocí Passing-Bablok regrese vychází vztah mezi oběma jednotkami měření D-dimerů až trojnásobný (Hemosil^® D-dimer HS 500 (mg/l FEU) = 0,01298 + 3,058 Hemosil^® D-dimer HS (mg/l DDim), 95% CI (graf 1).

Průměrná koncentrace 0, 524 mg/l DDim patřila mezi pozitivní hodnoty –⁠ výrobcem doporučený interval negativních výsledků je do 0,243 mg/l DDim. Také průměrná koncentrace v mg/l FEU vyšla pozitivní 1,598 mg/l FEU, zde je výrobcem udávaný interval negativních výsledků pro dospělé od 18 let do 0,500 mg/l FEU. U starších pacientů ve věku 50–80 let je při měření v mg/l FEU zmíněno velmi vhodné zavedení tzv. modifikovaného cut-off dle věku, a to pro vyloučení falešně pozitivních výsledků vyžadujících další CT angiografická nebo sonografická vyšetření pacienta: věk pacienta × 0, 01 = mg/l FEU [8–11].

DISKUZE

Laboratorní stanovení D-dimerů v plaz-mě dosáhlo po roce 1990 velkého progresu. K původní metodě BioMérieux Vidas^® (zlatý standard ELISA) začaly na trhu přibývat další diagnostické soupravy, bez kalibrační návaznosti pro absenci mezinárodního standardu a s minimálně dvěma jednotkami měření. Obecné interference měření se liší dle výrobce, u IL jsou shodné pro obě soupravy [3,4]. Např. přítomnost hemolýzy měření při 671 nm neovlivní měření do koncentrace hemoglobinu do 5 g/l. Hladina revmatoidního faktoru neovlivní měření až do 1 400 kIU/l. Ostatní FDP neinterferují do 10 mg/l. Extrémně chylózní (lipemické) vzorky mohou způsobit naměření falešně nižších výsledků měření –⁠ týká se hypertriglyceridémií nad 13 g/l (odpovídá 14,7 mmol/l).

Monoklonální protilátka (MA –⁠ 8D3) přítomna v latexové suspenzi vykazuje vysokou specifitu právě pro D-dimerové domény zesíťovaných fibrin degradačních produktů. Přidaný reakční pufr obsahuje blokující činidlo proti myším heterofilním protilátkám HAMA (Human Anti-Mouse Antibodies), aby se při měření vzorku se vzácnou lidskou anti-myší protilátkou interference zcela minimalizovala a výsledky imunoanalýz nebyly falešně nadhodnoceny. Tyto tzv. anti-myší lidské protilátky jsou multispecifické, polyreaktivní, relativně slabé protilátky a mohou být v krvi pacienta vzácně přítomné po indukci infekcí, po specifické léčbě nebo při některých revmatoidních onemocněních. Také často diskutovaný prozónový neboli Hook efekt je při měření oběma soupravami vzhledem ke vhodně zvolené hodnotě kalibrátoru plně vyloučen. Při tomto efektu by teoreticky mohlo dojít jen při vysokém přebytku antigenu, který vysytí protilátku v jednostupňových analýzách a následně dochází k naměření falešně negativních –⁠ velice nízkých a chybných výsledků. Tento efekt je během analýzy vyloučen po celý rozsah měření až do 69 mg/l DDim (128 mg/l FEU). Analyzátor automaticky ředí pozitivní vzorky vyšší než koncentrace kalibrátoru (kolem 3 mg/l DDim, resp. kolem 7 mg/l FEU). Extrémně vysoké vzorky s D-dimery nad celý rozsah měření lze ručně doředit diluentem –⁠ fyziologickým roztokem, takové však nebyly při studii zaznamenány.

Za negativní hodnoty se obecně považují koncentrace D-dimerů nižší než cut-off validované výrobcem. Laboratoř si ale cut-off doporučené výrobcem [3,4] může po provedení verifikace a stanovení celkové nejistoty měření (naměřeno 9 % pro oba systémy) upravit –⁠ tedy snížit a tím minimalizovat riziko vydání falešně negativních výsledků u vyšetřovaných pacientů. Současně s tímto zvýšením cenné diagnostické senzitivity je nutné počítat s odpovídajícím poklesem specifity. To však v případě D-Dimerů nemusí vadit, protože tato diagnostická metoda s výrobcem validovanou prediktivní negativní hodnotou blízko 100 % má sloužit především k bezpečnému vyloučení PE a DVT. V naší studii jsme prokázali, že vztah mezi sledovanými jednotkami pro vyjádření D-dimerů není dvojnásobný, ale dle Passing-Bablok analýzy v 95 % měření vyšel trojnásobný.

Nemusí tedy platit, že: 1 FEU odpovídá přibližně 2 D-dimerové jednotky, jak bývá v literatuře často uváděno. Jakékoliv přepočítávání pomocí různých kalkulátorů je však chybné a zavádějící.

Ovšem ne vždy jsou v odborné literatuře i v praxi jednotky jasně uváděny (DDim nebo FEU nebývá uvedeno) a nezbývá, než se v dané situaci orientovat dle uvedeného referenčního rozmezí nebo cut-off, které musí být za výsledkem měření důsledně uvedeno.

Pro kalibraci v mg/l FEU se jeví jako velmi vhodné posunutí cut-off 0,5 mg/l FEU od 50 let věku výše dle doporučení pro management žilního trombembolizmu American Society of Hematology z roku 2018 [10]. Zde je uvedeno, že při měření D-dimerů metodami s cut-off 0,5 mg/l (500 mg/l) je u starších, často polymorbidních osob diagnosticky přínosné využívat přepočtu výsledků na věk 50–80 let [10,11].

Je třeba zmínit i to, že vzhledem k prokoagulačnímu stavu se u dětí 0–17 let používají k hodnocení D-dimerů věkově odstupňované vyšší hodnoty cut-off než pro dospělou populaci [12].

Již v publikaci prof. Jana Evangelisty Dyra z roku 2006 [13] lze nalézt cennou odpověď na otázku ohledně volby jednotek: „Samotný D-dimer se v cirkulující krvi nevyskytuje, je vždy součástí některého z řady různě velkých fibrinových derivátů s molekulární hmotností větší než 2×106 daltonů. Některé protilátky reagují s konformačními neoepitopy, které vznikají při polymeraci fibrinového monomeru a které se vyskytují i v nestabilizovaném fibrinu. Je zřejmé, že velká část fibrinogenových molekul, které jsou konvertovány do fibrinu není kompletně degradována na D-dimer. Proto je vhodnější vyjadřovat množství stanovovaného D-dimeru v ng/ml, a ne v různých tzv. fibrinogenových ekvivalentních jednotkách“. Nejen v této souvislosti lze konstatovat, že vzhledem k prefixům jednotek ve jmenovateli je dnes již preferován přepočet na jednotky mg/l DDim resp. mg/l FEU před ng/mL DDim resp. ng/ml FEU [13–15].

ZÁVĚR

Ze statistického zpracování pomocí Passing-Bablok regrese vyplývá, že vztah mezi jednotkami mg/l FEU a mg/l DDim pro měření D-dimerů není zdaleka dvojnásobný, jak se často v literatuře mylně udávalo. Naše pilotní studie ověřila mj. že přepočet výsledků měření získaných pomocí různých metod je zavádějící a laboratorní nález pacienta je možné posuzovat pouze na základě jedné a téže validované metody s cut-off stanoveným výrobcem. Výběr metodiky pro vyjádření D-dimerů je sice závislý na možnostech a výběru laboratoří, někteří výrobci diagnostik poskytují soupravy pro měření v mg/l DDim, ale většina jich má soupravy měřící v mg/l FEU. Navíc některé POCT systémy mají vlastní jednotky a vlastní cut-off. Je však na místě doporučit použití pouze jedné měřicí metody, ideálně s certifikací FDA (US Food and Drug Administration) [7], tzn. reagencie vhodné k přímému diagnostickému vyloučení DVT a PE.

PODÍL AUTORŮ NA PŘÍPRAVĚ RUKOPISU

MV –⁠ příprava rukopisu, měření, analýza výsledků

LL –⁠ statistické a grafické zpracování výsledků, úpravy rukopisu

BM –⁠ připomínkování a revize rukopisu

ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ

Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.