Využití moderních bioanalytických metod pro určení složení pevných biologických vzorků

Souhrn

Cíl: Cílem práce bylo pomocí mikroskopických a spektroskopických metod analyzovat vzorky močového sedimentu a pevných biominerálů. Materiál a metody: Metodami mikroskopické analýzy a vyhodnocení analýzou obrazu byly hodnoceny biologické vzorky močového sedimentu. Dále pokročilými metodami spektroskopické analýzy FTIR byly identifikovány jednotlivé typy pevných konkrementů. Výsledky: Ve FN Motol bylo v roce 2025 uskutečněno 55 443 vyšetření močového sedimentu za využití automatizované mikroskopické analýzy s následnou analýzou obrazu. Mezi hlavní skupiny identifikovaných krystalů patří oxaláty (1952), kyselina močová (624), fosfáty (370) a uráty (19). Kromě toho jsou provedena vysoce specializovaná spektroskopická vyšetření biomateriálů; konkrementů (ročně kolem 250 až 350). V této skupině převažují různé formy oxalátů. Závěr: Moderní spektroskopické metody umožňují minimalistickou přípravu vzorku. Získaná data jsou matematicky vyhodnocena a mohou být velmi důležitým podkladem pro určení diagnózy.

Klíčová slova:

spektroskopické metody – analýza močového sedimentu – biominerály

ÚVOD

Problematice krystalů a biomateriálů v organismech je v klinické medicíně a výzkumu věnována značná pozornost (1–4). Mechanismus vzniku krystalů a konkrementů není stále uspokojivě vysvětlen. Mezi faktory, které mají asociaci s těmito procesy, jsou zvýšené koncentrace různých sloučenin a prvků, změny v metabolismu a fyziologických procesech tkání orgánů, přítomnost patogenů (5–8). Mezi závažná onemocnění patří dna, která je známa hyperurikemií, artritidou a ukládáním krystalů urátu v kloubech a ostatních tkáních (6).

Podobně je tomu u hyperoxalurie, která se může začít projevovat již v dětském věku a vede k chronickému onemocnění ledvin (CDK) (9). I u hospodářských zvířat se vyskytují významné urolitiázy se značným ekonomickým dopadem na chov (7). Navíc jsou hledány nové vhodné biomarkery, které by byly vhodné pro včasnou diagnostiku (10). Krystalové struktury vzhledem ke svým opticky významným vlastnostem jsou vhodným cílem pro aplikaci různých modifikací optických biosenzorů (11, 12). Tato onemocnění představují závažné ohrožení zdraví, neboť jejich důsledky mohou vést až k orgánovému selhání. Klíčovým úkolem je stanovení zákonitostí vzniku a vývoje konkrementů, což je podkladem pro vypracování efektivních metod prevence a léčby (13).

VZTAH K NÁDOROVÝM ONEMOCNĚNÍM

Prevalence litiázy se pohybuje mezi 1–5 % populace a jsou zjišťovány asociace se zhoubnými nádory (14 –⁠ 19). Konkrementy vznikají v ledvinové pánvičce (nefrolitiáza), močovodu (ureterolitiáza) nebo močovém měchýři (cystolitiáza) (20). Městnání moči v důsledku obstrukce často vede k sekundární infekci a chronické pyelonefritidě (21). Chronický zánět je obecně uznávaným rizikovým faktorem pro vznik malignit. Imunitní buňky v zánětlivém prostředí produkují reaktivní formy kyslíku (ROS) a reaktivní formy dusíku (RNS). Tyto látky poškozují DNA buněk urotelu, což vede ke genomické nestabilitě a mutacím. Dlouhodobá litiáza, zejména spojená s chronickým zánětem a obstrukcí, představuje zvýšené riziko pro rozvoj uroteliálního karcinomu v horních močových cestách (pánvička a močovod) (17). Opakované buněčné poškození a nutnost regenerace vedou ke zvýšené mitotické aktivitě buněk. V průběhu let může tento chronický proces indukovat karcinogenezi. Tato asociace je vysvětlována mechanismem chronického mechanického dráždění a chronického zánětu, které vedou k dysplazii a karcinogenezi. Riziko uroteliálního karcinomu ledvinové pánvičky je u pacientů s dlouhodobou litiázou prokazatelně vyšší. Vztah urolitiázy k renálnímu buněčnému karcinomu, který vzniká z parenchymu ledviny, je méně přímý a je stále předmětem výzkumu (20). Také cystolitiáza je spojována se zvýšeným rizikem karcinomu, konkrétně dlaždicobuněčného karcinomu močového měchýře (20). Opět platí mechanismus chronického mechanického dráždění a chronického zánětu. Chronické dráždění močového měchýře je jednou z hlavních příčin skvamózní metaplazie, která je významným prekurzorem nádorů močového měchýře (22, 23). Existuje méně častá, ale klinicky významná souvislost mezi urolitiázou a gamapatiemi (24–27). U pacientů může docházet k akumulaci lehkých řetězců imunoglobulinů v ledvinách. Tyto lehké řetězce mohou v ledvinových tubulech precipitovat a tvořit krystaly nebo odlitky. V některých případech tato krystalizace vede ke vzniku konkrementů specifického složení nebo mohou krystaly mechanicky ucpávat tubuly, a způsobovat tak krystalickou nefropatii, která je formou renálního poškození (akutní selhání ledvin) (28). Při nálezu tubulárních krystalů nebo atypického složení konkrementu by mělo být zváženo vyšetření na přítomnost M-proteinu v séru a moči.

VZNIK KRYSTALŮ A BIOMINERÁLŮ

Chemicky jsou konkrementy velmi heterogenní skupinou. Přibližně 70–80 % biominerálů tvoří oxalát vápenatý, následují fosfáty vápenaté a konkrementy z kyseliny močové (urátové). V chemickém složení převažují vápenaté, hořečnaté a amonné kationty. Z aniontů nacházíme oxaláty, fosfáty a uráty (29). Organická matrix je tvořená především proteiny a glykoproteiny, slouží jako nukleační jádro. Vznik konkrementů je komplexní proces, který je výsledkem interakce mezi přesycením moči krystalotvornými látkami, nerovnováhou mezi inhibitory a promotory krystalizace a přítomností organické matrix (obr. 1) (6).

METODIKA

Biologické vzorky

Vzorky pro analýzu byly získány od jednotlivých probandů a jejich použití je v souladu s vnitřními předpisy. Všechna vyšetření jsou v souladu se zásadami Helsinské deklarace. Tato studie byla schválena etickou komisí pro multicentrická klinická hodnocení Fakultní nemocnicí v Motole a  2. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze. EK vydala souhlas dne 17. 4. 2024 pod jednacím č. EK-282/24. Vzorky močových konkrementů byly získány od pacientů buď chirurgickým zákrokem, nebo spontánní exkrecí. Ihned po odběru byly uloženy do plastových transportních zkumavek a doručeny do laboratoře k analýze. Před vlastní charakterizací byly konkrementy omyty 3% roztokem peroxidu vodíku a následně sušeny při laboratorní teplotě (20–25 °C) po dobu 24 hodin. U každého vzorku byl při převzetí zaznamenán tvar, barva, velikost, tvrdost a počet. V případě FTIR analýzy moči byly vzorky před vlastní analýzou vysušeny v sušárně ECOCELL (BMT, Česká republika) při teplotě 130 °C po dobu 3 hodin a následně uchovávány v exsikátoru se silikagelem.

Chemikálie a činidla

Pro přípravu činidel byly zakoupeny chemikálie u společnosti Merck, USA. Deionizovaná voda byla připravena pomocí zařízení pro reverzní osmózu Aqual 25 (AQUAL, Česká republika) a následně dočištěna na odpor 18 MΩ deionizátorem ELGA Purelab Flex (Londýn, Velká Británie). Vodivost a pH byly měřeny multiměřičem MU 6100L (VWR, Radnor, PA, USA). pH elektroda (662-1161 Phenomenex, pH 0–14/3 M KCl, Torrance, CA, USA) byla pravidelně kalibrována dvoubodovou kalibrací (pufry VWR, při 22 °C).

Infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR)

Charakterizace vzorků byla provedena pomocí FTIR spektroskopie (Nicolet iS10 Spectrometer, Thermo Fisher Scientific, USA) metodou KBr tablet. Konkrementy anebo lyofilizované vzorky (30 mg) rozemlety na jemný prášek byly homogenizovány s KBr (500 mg) a slisovány v třecí misce za použití manuální hydraulické lisovací jednotky s tlakem 80 kN (Hydraulic Press H-62, Trystom, Česká republika) a vakuové pumpy (Siemens, Erlangen, Německo). Takto připravené tablety (průměr 13 mm, tloušťka 1 mm) jsou vhodné pro měření. Lisované tablety byly vloženy do spektrometru a infračervená spektra byla zaznamenána v rozsahu vlnových čísel 4000–400 cm¯¹. Rozlišení bylo nastaveno na 0,5 cm¯¹ a počet skenů činil 64. Rušivá spektra vzduchu a vodní páry byla zaznamenána jako pozadí a následně automaticky odečtena softwarem. Pro akvizici dat a porovnání se spektrálními knihovnami byl použit software OMNIC 9.2 (Thermo Fisher Scientific, USA).

Automatizovaná chemická a mikroskopická analýza

Pro chemickou analýzu vzorků byl použit fotometrický analyzátor Atellica Solutions CH 930 (Siemens, USA). Močový sediment byl analyzován pomocí analyzátoru Atellica 1500, který kombinuje analyzátor Clinitek Novus a automatický systém Atellica 800 (Siemens, USA). Mikroskopická analýza byla provedena na mikroskopu OLYMPUS BX53 vybaveném polarizátorem Olympus U-POT ve spojení s kamerou CANON a vyhodnocovacím softwarem QuickPHOTO CAMERA 3.2. Suchý vzorek byl po důkladném rozemletí nanesen na podložní sklíčko. Pro každé zvětšení (100×, 200×, 400× a  600×) bylo vyhodnoceno deset snímků v procházejícím a polarizovaném světle. Vybrané snímky byly zaznamenány v programu pro vyhodnocení a uloženy. Pozorování v běžném i polarizovaném světle poskytlo informace o morfologii a struktuře vzorků.

Statistická analýza dat

Dostupná experimentální data byla zpracována a vyhodnocena matematicky a statisticky přímo v databázi Qinslab nebo programováním matematických funkcí v tabulkovém procesoru Microsoft Excel.

VÝSLEDKY

Ve FN Motol se uskuteční více než 50 tisíc vyšetření močového sedimentu ročně za využití automatizované mikroskopické analýzy s následnou analýzou obrazu. Mezi hlavní skupiny identifikovaných krystalů patří oxaláty (1952), kyselina močová (624), fosfáty (370) analýz. Kromě toho jsou provedena vysoce specializovaná vyšetření biominerálů (ročně kolem 250 až 350). V této skupině jednoznačně převažují různé formy oxalátů. Ostatní minerály se vyskytují velmi vzácně, jak je vidět na obrázku 2.

Mikroskopická analýza močového sedimentu

Mikroskopická analýza močového sedimentu představuje klíčový diagnostický nástroj pro posouzení funkčního stavu ledvin a močového traktu. Zatímco základní chemické vyšetření pomocí testovacího proužku poskytuje rychlou informaci o přítomnosti krve či bílkovin, až mikroskopický pohled na odstředěný vzorek dokáže přesně identifikovat původ a povahu těchto nálezů. Při analýze se v první řadě sleduje přítomnost buněčných elementů (obr. 3A). Nález erytrocytů může naznačovat mechanické poškození, zánětlivé procesy, přičemž jejich narušený tvar často ukazuje na poškození filtrační bariéry v ledvinách (obr. 3A). Zvýšený počet leukocytů je naopak jasným signálem imunitní reakce, nejčastěji v důsledku bakteriální infekce. Kromě krvinek se v sedimentu objevují také různé typy epitelových buněk, zatímco běžné dlaždicové buňky jsou často pouhou kontaminací z povrchu těla, nález buněk z ledvinných kanálků je varovným signálem akutního poškození ledvin (obr. 3B). Specifickou a vysoce významnou kategorií jsou močové válce. Jde o mikroskopické útvary, které vznikají ve vnitřním prostoru ledvinných kanálků z bílkovinné hmoty. Pokud se v těchto strukturách zachytí červené nebo bílé krvinky, zánět či krvácení pochází přímo z ledvin, nikoliv z močového měchýře. Od prostých hyalinních válců, které se mohou objevit i po velké fyzické námaze, až po voskové válce signalizující chronické selhávání. Celý proces doplňuje sledování krystalů. Mezi běžně se vyskytující krystalické útvary přítomné v močovém sedimentu patří tripelfosfáty (obr. 3C), uráty amonné (obr. 3D), kyselina močová (obr. 3E) či weddellit (obr. 3F). Jejich přítomnost vypovídá o látkové výměně a riziku vzniku močového písku či kamenů.

Mikroskopická analýza močového sedimentu v polarizovaném světle

Použití polarizačního mikroskopu při analýze močového sedimentu posouvá běžné optické pozorování do roviny fyzikální diagnostiky, která využívá specifické chování světla při průchodu krystalickou mřížkou. Zatímco v běžném světle mohou být mnohé krystaly téměř průhledné a snadno přehlédnutelné, polarizační technika využívá jev zvaný dvojlom, díky němuž se anizotropní struktury na tmavém pozadí rozzáří jasnými barvami nebo bílým světlem. Pro analýzu drobných krystalů přímo v moči se pak používá polarizační mikroskopie, často doplněná o fázový kontrast, který zvýrazňuje kontury i u látek s nízkým indexem lomu. Analýza probíhá na mikroskopu vybaveném polarizačním filtrem. Jak je ukázáno na obrázku 4, krystaly přítomné ve vzorku mění své optické vlastnosti v polarizovaném světle. Kromě identifikace minerálních solí je polarizace nenahraditelná při diagnostice závažných stavů, jako je nefrotický syndrom, kde se v moči objevují tukové částice. Tyto lipidové kapénky nebo buňky jimi naplněné vytvářejí v polarizovaném světle diagnosticky nezaměnitelný obrazec známý jako Maltézský kříž. Jde o zářící kruh rozdělený tmavým křížem, což je jev, který běžná světelná mikroskopie nedokáže zachytit. Stejně tak lze touto metodou odhalit přítomnost dalších metabolitů (2,8-dihydroxyadenin) a exogenních látek, například krystalů sulfonamidů nebo jiných léků, které mohou mechanicky dráždit ledvinné kanálky. Kromě optické mikroskopie lze využít skenovací elektronovou mikroskopii (SEM) spojenou s disperzní rentgenovou spektroskopií (EDX) (30). Metoda tak umožní provést mapování povrchu konkrementu bodovou elementární analýzu prvků, jako jsou vápník, hořčík, fosfor nebo síra.

Pevné konkrementy u organismů

Pevné konkrementy u organismů představují patologické útvary vznikající krystalizací a následným vrstvením minerálních látek kolem organického jádra v tělních dutinách nebo vývodech žláz. Tento proces, odborně nazývaný litiáza, není omezen pouze na člověka, ale vyskytuje se napříč živočišnou říší, přičemž jeho podstata je v narušení rovnováhy mezi rozpustností solí a jejich koncentrací v tělních tekutinách. Základem každého takového útvaru je obvykle mikroskopický shluk bílkovin, odumřelých buněk nebo bakterií, který slouží jako takzvané krystalizační jádro, na němž se postupně srážejí anorganické složky, jako jsou šťavelany, fosfáty, uráty či uhličitany (viz obr. 1). U savců se tyto pevné útvary nejčastěji formují v močovém ústrojí, kde jejich vznik úzce souvisí s pH moči, stupněm hydratace a stravou. Například u přežvýkavců krmených bohatou rostlinnou stravou se často setkáváme s křemičitými nebo fosfátovými kameny, zatímco u masožravců dominují spíše struvity nebo krystaly kyseliny močové (obr. 5). Kromě močových cest jsou častým místem výskytu také žlučové cesty, kde vznikají žlučové kameny (cholelity) následkem nerovnováhy mezi cholesterolem, žlučovými kyselinami a barvivy. Tyto pevné struktury mohou nabývat fascinujících tvarů, od drobných zrnek písku až po masivní odlitkové kameny, které vyplňují celou ledvinnou pánvičku, což vede k mechanické obstrukci, zánětům a v krajním případě k nevratnému poškození orgánu. Zajímavým aspektem je, že ne všechny pevné útvary v organismech jsou považovány za patologické. Některé organismy využívají podobné biomineralizační procesy k funkčním účelům, jako je tvorba otolitů v uších ryb pro vnímání rovnováhy nebo tvorba vaječných skořápek. Hranice mezi fyziologickou biomineralizací a patologickou tvorbou konkrementů je tedy definována především funkčností daného systému; jakmile pevná struktura začne bránit přirozenému toku tekutin nebo dráždit okolní tkáň, stává se klinickým problémem.

Pro jednoznačnou identifikaci jsou potřebné moderní analytické metody

Moderní analytické metody umožní analýzu malého množství vzorku s velmi malými přítomnými koncentracemi. Určení chemického složení minerálu je vždy výzvou, která vyžaduje náročnou přípravu vzorku. Analýza chemického složení krystalických konkrementů a močového sedimentu vyžaduje kombinaci fyzikálních a spektrálních metod, které dokážou přesně rozlišit jednotlivé minerální fáze a organické příměsi. Chemickou mokrou analýzou, která spočívá v postupném rozpouštění vzorku v různých činidlech, a v  jejich následné analýze, lze určit přítomnost jednotlivých složek v daném analyzovaném vzorku. Takový přístup umožní identifikovat přítomnost organických složek v konkrementu. Velmi vhodnou metodou analýzy krystalů je rentgenová difrakční analýza (XRD) (29). Ta je založena na rozptylu rentgenového záření na krystalové mřížce vzorku. Každá krystalická látka ohýbá paprsky pod specifickými úhly, což umožňuje vytvořit difrakční obrazec charakteristický pro danou atomární strukturu. XRD je nenahraditelná v situacích, kdy je potřeba přesně odlišit různé hydráty stejné látky, což má přímý dopad na odhad rychlosti tvorby kamene a volbu preventivní diety.

Některé optické metody, jako je infračervená a Ramanova spektroskopie, umožňují identifikaci látek ve vzorku bez náročné přípravy (31, 32). V analýze pevných krystalů je velmi využívána infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR) (33, 34). Tato metoda využívá schopnost molekul absorbovat infračervené záření o specifických vlnových délkách, což vyvolává vibrace chemických vazeb. V přehledové práci Kotaška a spol. jsou přehledně popsány přístupy v analýze močových kamenů (35). Metody však vyžadují náročnější matematické nástroje pro vyhodnocení získaných dat a jsou vhodné jako podklad pro určení diagnózy (obr. 6) (37). Tímto způsobem je možné identifikovat přítomnost jednotlivých funkčních skupin (obr. 7A). Ze získaných spekter je možné v určitých oblastech usuzovat na přítomnost i organických molekul, jako jsou proteiny, lipidy, fosfáty a cukry. Takto je následně možné určit typická spektra pro jednotlivé druhy minerálů nebo metabolitů. V nedávné studii se podařilo prokázat ve vzorku moči zvýšené koncentrace kreatininu i přítomnost velmi vzácně se vyskytujících krystalů (33, 38). Na obrázku 7B jsou typická spektra pro whewellit, weddellit, apatit a struvit a urát.

ZÁVĚRY PRO KLINICKOU PRAXI

Jak je ukázáno, vznik biominerálů a krystalů má asociace s řadou závažných onemocnění a mohou být považovány za rizikové faktory (35, 38). Bez moderní laboratorní techniky by nebylo možné dosáhnout takového pokroku. Je naprosto klíčové, aby laboratorní vybavení bylo dále modernizováno. Intenzivně chceme rozvíjet směr zaměřený na analýzu vzorku s minimální přípravou využívající spektrální infračervené a Ramanovy spektroskopie. V naší výzkumné práci se zaměřujeme na studium detailní analýzy přítomnosti mikroa nanočástic biominerálů a jejich interakce s proteiny a nukleovými kyselinami. Kromě toho detailnější přístupy využívající vhodné mikroskopické techniky včetně prvkového mapování ve spojení s hmotnostní detekcí poskytují nové unikátní informace. Data chceme spojovat se zlepšením diagnostiky závažných onemocnění, jako jsou i zhoubné nádory.

Práce byla realizována za podpory institucionální podpory MZ ČR –⁠ RVO, FN v Motole 00064203.

Konflikt zájmů: žádný.