Stanovenie markerov konzumácie etylalkoholu v tehotnosti

Souhrn

Expozícia plodu alkoholu počas tehotenstva (PAE –⁠ prenatal alcohol exposure), s celosvetovou prevalenciou približne 10 %, predstavuje najčastejšiu preventabilnú príčinu fetálnej morbidity, pričom najzávažnejším dôsledkom je fetálny alkoholový syndróm. Zlatým štandardom diagnostiky zostávajú dotazníky so samovýpoveďou o konzumácii alkoholu počas tehotenstva, avšak ich výpovedná hodnota je často obmedzená v dôsledku podhodnocovania spotreby. Preto je nevyhnutné zaviesť objektívnu diagnostickú metódu. Medzi najperspektívnejšie biomarkery patria metabolity etanolu v smolke novorodencov. V tejto pilotnej štúdii sme kvantifikovali prítomnosť etylglukuronidu (EtG) a etylsulfátu (EtS) v smolke a porovnali sme ich výskyt s údajmi o expozícii alkoholu na základe dotazníkov. Do štúdie bolo zaradených 51 tehotných žien. Od každého novorodenca bola odobratá vzorka smolky, ktorá bola následne analyzovaná pomocou kvapalinovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou. Každá účastníčka štúdie dostala dotazník týkajúci sa konzumácie alkoholu počas tehotenstva. EtG bol detegovaný v 41 vzorkách (80,3 %) a EtS v 51 vzorkách (100 %). Tri zo zapojených žien dotazník nevyplnili. Zo zostávajúcich 48 žien šesť (11,7 %) uviedlo konzumáciu alkoholu počas tehotenstva. Medián koncentrácií EtG a EtS bol 49,6 ng/g a 13,9 ng/g. U žien, ktoré uviedli konzumáciu alkoholu, boli mediány oboch biomarkerov vyššie v porovnaní so ženami, ktoré alkohol neudávali. Hodnoty EtG presahujúce 30 ng/g –⁠ ktoré podľa niektorých štúdií predstavujú hraničnú hodnotu pre expozíciu alkoholu –⁠ boli namerané u 82,35 % žien, ktoré uviedli abstinenciu počas tehotenstva. Naša štúdia potvrdzuje, že EtG a EtS sú spoľahlivé markery expozície etanolu v smolke novorodencov. Nepodarilo sa nám však stanoviť jednoznačné hraničné hodnoty týchto markerov pre diagnostiku PAE. Vysoké hladiny EtG u žien, ktoré popreli konzumáciu alkoholu, môžu byť dôsledkom expozície etanolu z iných zdrojov a/alebo endogénnej produkcie. Zostáva tiež možnosť neúplnej alebo nepresnej výpovede v dotazníkoch.

Klíčová slova:

biomarkery – mekonium – fetálny alkoholový syndróm – expozícia alkoholu počas tehotenstva

Úvod

Expozícia plodu alkoholu počas tehotenstva predstavuje najčastejšiu preventabilnú príčinu materskej, a predovšetkým fetálnej, morbidity. Jej celosvetová prevalencia sa pohybuje okolo 10 % [1], pričom v niektorých krajinách a rizikových populačných skupinách je ešte vyššia [2]. Rôzne spôsoby a vzorce konzumácie alkoholu počas tehotenstva môžu mať rôznorodý vplyv na vývoj plodu. Doposiaľ nebolo stanovené množstvo ani časový rámec konzumácie alkoholu, ktorý by bol považovaný za bezpečný. Z tohto dôvodu medzinárodné zdravotnícke a odborné organizácie konzumáciu alkoholu počas tehotenstva jednoznačne neodporúčajú [3].

Najzávažnejšou formou dôsledkov prenatálnej expozície alkoholu je fetálny alkoholový syndróm (FAS), ktorý je súčasťou širšieho spektra fetálnych alkoholových porúch (FASD) [4]. Ich prevalencia v bežnej populácii sa odhaduje na približne 0,77 %, pričom v niektorých regiónoch, ako je Severná Amerika a Európa, môže dosahovať až 2–5 % [5]. Podľa štúdií sa predpokladá, že z 13 matiek, ktoré počas tehotenstva preukázateľne konzumovali alkohol, jedna porodí dieťa s FASD [6], pričom FAS sa vyskytne u jednej zo 67 takýchto matiek [4]. Spektrum prejavov FASD môže zahŕňať morfologické abnormality tváre, srdca, centrálneho nervového systému, rastovú retardáciu, ako aj rôzne nešpecifické neurobehaviorálne poruchy a odchýlky [7]. Napriek existencii viacerých diagnostických a klasifikačných systémov je v dôsledku ich nejednotnosti náročné zachytiť všetky prípady, najmä v ranom štádiu, a obzvlášť v prípadoch, kde chýbajú morfologické príznaky [8].

Jednou z možností zisťovania expozície alkoholu počas tehotenstva sú dotazníky. Ich výpovedná hodnota je však obmedzená, pretože nie je možné overiť pravdivosť uvedených údajov. Štúdie preukázali, že aj ženy s potvrdenou konzumáciou alkoholu túto skutočnosť často nepriznali [9].

Diagnostické aj terapeutické možnosti pri FASD sú, napriek prebiehajúcemu výskumu, stále značne obmedzené. Mnohé prípady zostávajú nediagnostikované alebo sú diagnostikované oneskorene, často až v priebehu života postihnutého jedinca. Liečba si vo väčšine prípadov vyžaduje celoživotné multidisciplinárne úsilie a predstavuje výraznú záťaž pre zdravotnícky, sociálny aj ekonomický systém [2,8–10].

Z uvedených dôvodov boli realizované viaceré štúdie zamerané na hľadanie objektívnych metód na zistenie konzumácie alkoholu počas tehotenstva [3]. Skúmali sa rôzne biomarkery v biologických materiáloch matky aj plodu, ako sú krv, moč, vlasy, nechty či smolka [11]. Smolka novorodenca sa začína tvoriť približne od 20. týždňa tehotenstva, čo z nej robí vhodný biologický materiál na zistenie chronickej expozície alkoholu počas dlhého obdobia gravidity, hoci je dostupná len počas prvých troch dní po pôrode [12]. Podľa viacerých štúdií je práve smolka považovaná za najvhodnejší materiál na detekciu intrauterinnej expozície alkoholu [13].

Doterajšie výskumy sa zameriavali na detekciu rôznych metabolitov etanolu v smolke novorodenca. Medzi najperspektívnejšie biomarkery patrili etylestery mastných kyselín, etylglukuronid (EtG) a etylsulfát (EtS), ktoré preukázali najvyššiu zhodu s údajmi získanými z dotazníkov. Napriek tomu výsledky doterajších štúdií zatiaľ neumožňujú stanoviť jednoznačné hraničné (cut-off) hodnoty týchto markerov pre všeobecné použitie v populácii [12–15].

Cieľom tejto pilotnej štúdie bolo stanoviť prítomnosť biomarkerov etylalkoholu (EtG a EtS) v populácii tehotných žien na Slovensku a porovnať ich koncentrácie s údajmi získanými z dotazníkov o konzumácii alkoholu počas tehotenstva.

Štúdia bola schválená Etickou komisiou Univerzitnej nemocnice Bratislava dňa 12. 10. 2022 (EK/153/2022).

Metódy

Metodický postup rekrutácie probandiek a dotazníkové šetrenie

Pacientky do štúdie boli rekrutované v prenatálnej poradni II. Gynekologicko-pôrodníckej kliniky v 36. týždni tehotnosti. Po pôrode bola odobraná vzorka smolky každému novorodencovi a odoslaná na analýzu. Každej rodičke bol po pôrode vydaný skríningový dotazník ohľadne konzumácie alkoholu. Najlepšie skúsenosti v populácií tehotných sú s T-ACE skríningovým dotazníkom a s WHO hodnotením pomocou dotazníku AUDIT.

Metodický postup chemickej analýzy vzorky smolky

Vzorka sa odobrala do plastových uzatvárateľných kontajnerov, zmrazila sa na –20 °C a následne sa transportovala na Chemický ústav Slovenskej akadémie vied (CHÚ SAV). Po rozmrazení sa vzorka extrahovala pomocou vortexu a ultrazvuku do dvojfázového systému voda –⁠ hexán, pričom polárne metabolity etylglukuronid a etylsulfát ostali v polárnom rozpúšťadle a nepolárne metabolity ako sú etylestery mastných kyselín a fosfatidyletanoly prešli do nepolárneho rozpúšťadla. Následne sa centrifugáciou oddelili pevné zvyšky materiálu a odobrali sa alikvotné vzorky. Polárna fáza sa po filtrácii analyzovala pomocou kvapalinovej chromatografie (LC-MS). Chromatograf je vybavený s hmotnostnými detektormi s trojitým kvadrupolom umožňujúcim meranie MS2. Detekcia sa uskutočnila metódou selekcie iónov o zvolenej hmotnosti na prvom kvadrupole, následne štiepenie týchto iónov na druhom kvadrupole a nakoniec znova selekcia vybraného fragmentu o zvolenej hmotnosti a jeho detekcia na poslednom kvadrupole. Táto metóda má vysokú špecificitu a citlivosť dosahujúcu detekčné limity ppt. Kvantifikácia sa robila pomocou štandardov.

Štatistické spracovanie

Získané údaje z dotazníkov a z analýz boli vložené do Microsoft Excel a štatisticky spracované pomocou software OpenEpi. Za štatisticky významnú bola považovaná hodnota p < 0,05.

Výsledky

Do pilotnej štúdie bolo zaradených 51 žien, ktoré porodili na II. Gynekologicko-pôrodníckej klinike v Bratislave. Od troch účastníčok sa nepodarilo získať údaje z dotazníkov. Zo zostávajúcich 48 žien len šesť (11,76 %) uviedlo konzumáciu alkoholu počas tehotenstva. Vo všetkých prípadoch išlo o malé množstvo (1–3 alkoholické nápoje za mesiac) (tab. 1).

Etylglukuronid (EtG) bol detegovaný v 41 vzorkách smolky s mediánom 49,6 ng/g (rozsah: 11,8–288 030,7 ng/g). V deviatich vzorkách EtG detegovaný nebol. Zo žien, ktorých vzorky nevykazovali prítomnosť EtG, sedem uviedlo abstinenciu a dve uviedli konzumáciu alkoholu počas tehotenstva. V skupine žien, ktoré neudávali konzumáciu alkoholu, bol medián EtG nižší (43 ng/g) v porovnaní so skupinou žien, ktoré alkohol konzumovali (61,8 ng/g). Nepotvrdili sme však štatisticky významný vzťah medzi udanou konzumáciou alkoholu a nameranými hodnotami EtG v smolke (graf 1).

Všetky hodnoty EtG boli nad hranicou kvantifikácie podľa štúdie Himes et al., teda nad 5 ng/g. V 35 prípadoch hodnoty presiahli 30 ng/g, čo je podľa Himes et al. hranica spojená s preukázanou konzumáciou alkoholu počas tehotenstva na základe dotazníkových údajov. Všetky ženy, ktoré uviedli konzumáciu alkoholu, mali hodnotu EtG vyššiu ako 30 ng/g. Zo 34 žien, ktoré podľa dotazníkov alkohol nekonzumovali, malo až 28 hodnoty EtG nad touto hranicou.

Jedna vzorka vykazovala extrémne vysokú hodnotu EtG (288 030,7 ng/g). Pre túto pacientku však nemáme k dispozícii údaje z dotazníka o konzumácii alkoholu.

Etylsulfát (EtS) bol detegovaný vo všetkých 51 vzorkách smolky s mediánom 13,9 ng/g (rozsah: 2,9–204,2 ng/g). Medián EtS bol nižší u žien, ktoré neudávali konzumáciu alkoholu (12 ng/g; rozsah: 2,9–83 ng/g), v porovnaní so ženami, ktoré alkohol konzumovali (15,4 ng/g; rozsah: 3,7–96,5 ng/g). Všetky hodnoty EtS presiahli hranicu kvantifikácie podľa Himes et al., ktorá je 2,5 ng/g. Nepotvrdili sme však štatisticky významný vzťah medzi hladinami EtS a konzumáciou alkoholu počas tehotenstva (grafy 2, 3).

Najvyššia hodnota EtS (204,2 ng/g) bola nameraná v rovnakej vzorke, v ktorej sa zistila aj najvyššia hodnota EtG.

Diskusia

Prevalencia konzumácie alkoholu počas tehotenstva v našej študijnej skupine bola 11,76 %, čo približne zodpovedá celosvetovej prevalencii udávanej na úrovni 10 % [1]. Naše výsledky podporujú vhodnosť použitia smolky ako biologického materiálu na detekciu biomarkerov expozície alkoholu počas tehotenstva. EtG bol detegovaný v 80,3 % vzoriek a EtS vo všetkých (100 %) vzorkách nad hranicou detekcie. Tento nález môže potvrdzovať aj vyššiu stabilitu EtS v porovnaní s EtG pri vystavení externým faktorom, ako sú produkty obsahujúce alkohol, alebo pri niektorých ochoreniach ovplyvňujúcich metabolizmus alkoholu [15–17].

Zaujímavým zistením bolo, že v skupine žien, ktoré v dotazníkoch neuviedli konzumáciu alkoholu počas tehotenstva, až 82,35 % vykazovalo hodnoty EtG nad 30 ng/g. Táto hodnota je podľa Himes et al. v súčasnosti považovaná za najrelevantnejší dostupný objektívny ukazovateľ prenatálnej expozície alkoholu. Možným vysvetlením tohto nesúladu je nepresné alebo neúplné vyplnenie dotazníkov. Alternatívne môže ísť o exogénny prísun etylalkoholu, napríklad prostredníctvom ústnych vôd, dezinfekčných prostriedkov na ruky, alebo konzumáciou nealkoholických nápojov (najčastejšie piva), prípadne o endogénnu produkciu alebo znížené odbúravanie EtG. Tieto faktory však neboli súčasťou aktuálneho dotazníka a ich zahrnutie by mohlo významne prispieť k presnosti budúcich štúdií [14–18].

Vzhľadom na obmedzenú veľkosť skúmanej vzorky a nízky počet žien, ktoré v dotazníkoch uviedli konzumáciu alkoholu počas tehotenstva, nebolo možné stanoviť spoľahlivé cutoff hodnoty pre EtG a EtS, ktoré by v našej populácii jednoznačne indikovali prenatálnu expozíciu etylalkoholu. Pre určenie takýchto hraničných hodnôt by bolo nevyhnutné pracovať so širšou a reprezentatívnejšou skupinou žien, v ktorej by bol vyšší podiel účastníčok, ktoré vierohodne priznajú konzumáciu alkoholu počas gravidity. Presnosť týchto údajov je však v praxi často limitovaná vplyvom stigmatizácie a obáv z odsúdenia zo strany zdravotníkov či spoločnosti [2]. To môže viesť k podhodnoteniu výskytu expozície alkoholu, a tým aj k skresleniu výsledkov korelácie medzi biomarkermi a dotazníkovými údajmi. Navyše, aj pri vyššom počte priznanej konzumácie alkoholu je často ťažké získať presné údaje o množstve, frekvencii a čase požitia alkoholu, čo sú všetko faktory ovplyvňujúce koncentráciu biomarkerov v smolke [3,9].

Z metodologického hľadiska by bolo vhodné, aby budúce výskumy cielene zahrnuli rizikovejšie skupiny žien –⁠ napríklad ženy s anamnézou závislosti, ženy v sociálne znevýhodnených podmienkach, alebo pacientky so známkami psychickej alebo psychiatrickej komorbidity, kde je vyššia pravdepodobnosť prenatálnej expozície alkoholu [1]. Paralelne s touto skupinou by mala byť zahrnutá aj dostatočne veľká kontrolná skupina žien, ktoré alkohol počas tehotenstva jednoznačne nekonzumovali, čo by umožnilo dôveryhodnejšie porovnanie medzi skupinami a presnejšie určenie diagnostických hraníc biomarkerov. Dôležitým predpokladom pre takýto výskum by bolo doplnenie štandardizovaného dotazníka o ďalšie faktory, ktoré môžu ovplyvniť hladiny EtG a EtS –⁠ ako sú používanie produktov s obsahom alkoholu (ústne vody, dezinfekčné prostriedky), typ stravovania, prítomnosť infekcií alebo porúch metabolizmu, ako aj celkový zdravotný stav matky. Zaradenie týchto premenných by mohlo pomôcť rozlíšiť skutočnú expozíciu alkoholu od iných zdrojov zvýšenej hladiny biomarkerov a zároveň zvýšiť špecificitu a senzitivitu laboratórneho testovania [13].

Získanie takýchto podrobnejších údajov a ich následné využitie v širších, metodologicky robustných štúdiách predstavuje logický a nevyhnutný krok v úsilí o zavedenie objektívnej a spoľahlivej diagnostiky prenatálnej expozície alkoholu. Práve touto cestou sa plánujeme uberať v pokračovaní nášho výskumu.

Záver

Expozícia alkoholu počas tehotenstva a FAS patria medzi najčastejšie preventabilné príčiny fetálnej morbidity, pričom majú významný dopad na zdravotnícky, ekonomický aj sociálny systém [1,4,10]. Diagnostika sa v súčasnosti opiera najmä o sebahodnotenie spotreby alkoholu prostredníctvom dotazníkov, ktoré však nie sú dostatočne spoľahlivé. Z tohto dôvodu je nevyhnutné zlepšiť objektívne metódy diagnostiky expozície alkoholu počas tehotenstva, čo však predstavuje nemalú výzvu [3,12].

Za najvýznamnejšie biomarkery konzumácie alkoholu v tehotenstve sa v súčasnosti považujú etylglukuronid a etylsulfát zo smolky novorodenca. Viaceré štúdie, vrátane našich vlastných výsledkov potvrdili, že tieto biomarkery predstavujú vhodný a spoľahlivý spôsob objektívneho stanovenia prítomnosti metabolitov alkoholu v smolke. Navyše, na základe štúdie Himes et al. možno hodnoty EtG nad 30 ng/g považovať za objektívny dôkaz expozície plodu alkoholu v tehotenstve [13,15].

Jednoznačná interpretácia výsledkov s univerzálne platnými hraničnými hodnotami však zatiaľ chýba. Na dosiahnutie spoľahlivej a objektívnej diagnostiky FASD, ktorá by umožnila včasnú intervenciu, bude potrebný ďalší rozsiahly výskum [15].