Srovnání histologické struktury kryokonzervované ovariální tkáně metodou pomalého zamražení

Souhrn

Cíl: Cílem této studie bylo ověřit metodiku kryokonzervace ovariální tkáně metodou pomalého mražení jako metodu pro zachování fertility a její možné zavedení do klinické praxe Centra asistované reprodukce Fakultní nemocnice Olomouc. Současně byla optimalizována a nacvičena technika samotné kryokonzervace. Soubor a metodika: Studie probíhala v období od dubna 2022 do prosince 2024 na Porodnicko -⁠ -gynekologické klinice Fakultní nemocnice Olomouc a zahrnovala šest transgender pacientek ve věku 19–25 let, které podstoupily laparoskopickou hysterektomii s oboustrannou adnexektomii v rámci chirurgické tranzice. Získaná ovariální tkáň byla bezprostředně po vyjmutí zpracována a kryokonzervována metodou pomalého zamražování v Centru asistované reprodukce Fakultní nemocnice Olomouc. Histopatologické hodnocení ovariální tkáně bylo provedeno před kryokonzervací, následně po rozmražení vzorků na Ústavu klinické a molekulární patologie Fakultní nemocnice Olomouc. Výsledky: Výsledky morfologického hodnocení ovariální tkáně po kryokonzervaci potvrdily zachovalost strukturálních charakteristik folikulů i stromální komponenty bez známek výrazné degenerace. Závěr: Výsledky tak potvrzují, že použitý protokol kryokonzervace ovariální tkáně metodou pomalého mražení je vhodný a dostatečně šetrný pro klinické využití. Tato metodika představuje spolehlivou možnost zachování plodnosti u pacientek podstupujících gonadektomii, s potenciálním uplatněním při následné transplantaci či in vitro kultivaci folikulů.

Klíčová slova:

asistovaná reprodukce – in vitro fertilizace – onkofertilita – zachování fertility – kryokonzervace ovariální tkáně – pomalé mražení – transgender

Úvod

Kryokonzervace ovariální tkáně (OTC –⁠ ovarian tissue cryopreservation) představuje slibnou možnost zachování plodnosti u žen a dívek, které jsou vystaveny riziku předčasného ovariálního selhání (POI –⁠ premature ovarian insufficiency) [1]. K tomuto riziku může vést onkologická léčba, genetické predispozice, autoimunitní onemocnění nebo chirurgické zákroky na reprodukčních orgánech [2]. Chemoterapie a radioterapie poškozují ovariální rezervu, což může mít za následek nejen neplodnost, ale i ztrátu hormonální funkce vaječníků s následným negativním dopadem na kostní metabolizmus, kardiovaskulární systém a metabolizmus [3]. Na rozdíl od kryokonzervace oocytů nebo embryí, která vyžaduje řízenou ovariální stimulaci gonadotropními hormony, je OTC vhodná i pro ženy, které hormonální terapii nemohou podstoupit, a lze ji provádět i u prepubertálních dívek [4]. Procedura zahrnuje laparoskopický odběr ovariální tkáně, která obsahuje nezralé primordiální folikuly, následné zamražení ovariální tkáně, v časovém odstupu rozmražení a transplantace ovariální tkáně zpět do těla pacientky. Po transplantaci může dojít nejen k obnovení plodnosti, ale také k obnovení hormonální funkce vaječníků, což může oddálit nástup menopauzy a zlepšit kvalitu života [5–7]. Od prvního úspěšného případu transplantace a porodu v roce 2004 došlo k významnému pokroku v této oblasti. Dnes již bylo celosvětově dosaženo více než 200 porodů po transplantaci kryokonzervované ovariální tkáně [8,9]. Americká společnost pro reprodukční medicínu (ASRM –⁠ the American Society for Reproductive Medicine) přestala v roce 2019 tuto metodu považovat za experimentální [10]. Výhodou metody je, že není závislá na menstruačním cyklu ani přítomnosti partnera a umožňuje provedení bezprostředně před zahájením gonadotoxické léčby [11]. Navzdory svým úspěchům se metoda potýká s problémy. Hlavními problémy zůstává ztráta folikulů, oxidační a ischemické poškození [12]. U pacientů s akutní leukemií se OTC nedoporučuje kvůli riziku přenosu maligních buněk [13,14]. Transplantovaná tkáň má navíc omezenou životnost a někdy vyžaduje opakované transplantace [15].

Fyziologie a morfologie ovaria, význam primordiálních folikulů

Ovarium je párový orgán ženského reprodukčního systému s hlavními funkcemi gametogeneze (produkce oocytů) a endokrinní funkcí (hormonální sekrece). Nachází se v pánevní dutině, kde se jeho struktura i funkce během menstruačního cyklu a reprodukčního života mění [16,17].

Z histologického hlediska se ovarium skládá z kortexu, který obsahuje folikuly v různých vývojových stadiích, oocyty a podpůrné buňky, a z meduly obsahující krevní a lymfatické cévy, nervy a vazivo. Povrch ovaria tvoří jednovrstevný kubický epitel krytý tunica albuginea [18,19].

Folikulogeneze

Folikulogeneze je složitý proces vývoje folikulů od klidových primordiálních folikulů až po zralé Graafovy folikuly schopné ovulace. Proces se dělí na preantrální fázi řízenou lokálními autokrinními a parakrinními růstovými faktory nezávislými na gonadotropinech, a antrální fázi, v níž působí gonadotropiny (FSH –⁠ folikulostimulační hormon, LH –⁠ luteinizační hormon) a růstové faktory společně [20,21].

Primordiální folikuly jsou základní neobnovitelnou zásobou folikulů tvořenou oocytem zastaveným v profázi I meiózy, obklopeným jednou vrstvou plochých pregranulózních buněk. Tyto folikuly většinu života zůstávají v klidovém stavu a jejich počet představuje zásadní faktor určující reprodukční potenciál ženy [22,23].

Primární folikul obsahuje oocyt obklopený jednovrstevnou vrstvou kubických granulózových buněk a je obalen zona pellucida –⁠ glykoproteinovou vrstvou důležitou pro fertilizaci [24,25]. Sekundární folikul vykazuje vícevrstevnou granulózovou strukturu a vzniká obal theky. Jeho vývoj je řízen růstovými faktory produkovanými oocytem a okolními buňkami. Antrální folikul se vyznačuje vznikem tekutinou naplněného antra, které vytváří vhodné prostředí pro metabolickou a signální podporu oocytu, který je uložen v cumulus oophorus [26]. Graafovy folikuly představují zralé velké folikuly (18–25 mm), které pod vlivem LH dokončují meiózu I a uvolňují sekundární oocyt při ovulaci. Mezi nimi se rozlišují zdravé folikuly, které rostou a diferencují se, a atretické, které podléhají apoptóze (obr. 1) [27–29].

Metody kryokonzervace ovariální tkáně

Pomalé mražení (slow-freezing) je v současnosti nejčastěji používanou metodou pro kryokonzervaci ovariální tkáně. Využívá řízené ochlazování pomocí programovatelného mrazicího zařízení, které podporuje tvorbu ledových krystalů převážně v extracelulárním prostoru. Tím dochází ke zvýšení osmolality a výstupu vody z buněk, čímž se minimalizuje riziko intracelulární krystalizace –⁠ hlavní příčiny poškození buněk při rychlém zamražení. Příliš pomalé ochlazování však může způsobit dehydrataci a osmotický stres, což může negativně ovlivnit folikulární struktury. Moderní protokoly se proto snaží vyvážit ochranné a toxické účinky pomocí optimalizovaných chladicích křivek a kombinací permeačních a nepermeačních kryoprotektivních látek [30–32].

Vitrifikace je alternativní metoda založená na ultrarychlém ochlazení a vysoké koncentraci kryoprotektivních látek, které umožňují přechod do sklovitého (amorfního) stavu bez tvorby krystalů. Vyžaduje přesné a rychlé provedení –⁠ při zpomalení hrozí vznik krystalů a poškození buněk. Úspěšnost vitrifikace lze posoudit podle čirého vzhledu vzorku, zakalení značí přítomnost ledu. Menší objem tkáně snižuje riziko krystalizace. I přes technickou dostupnost však chybí standardizovaný vitrifikační protokol pro ovariální tkáň, což omezuje její širší využití [33,34].

Soubor pacientek

V období od dubna 2022 do prosince 2024 probíhala na Porodnicko-gynekologické klinice Fakultní nemocnice Olomouc (FNOL) studie zaměřená na analýzu ovariální tkáně u šesti transgender osob, které byly při narození přiřazeny jako ženy (AFAB –⁠ assigned female at birth). Účastnice studie byly ve věku 19–25 let, s průměrným věkem 21,7 roků a podstoupily chirurgickou změnu pohlaví (bilaterální ovariektomii).

Všechny pacientky byly dlouhodobě léčeny hormonální terapií s androgeny (Sustanon 500 mg i. m. 1krát za 2–4 týdny po dobu 12–36 měsíců). Provádění chirurgické změny pohlaví bylo možné pouze na základě souhlasného stanoviska odborné komise Ministerstva zdravotnictví České republiky pro provádění změn pohlaví u transsexuálních pacientů.

Pacientky poskytly informovaný souhlas nejen s provedením operace, ale také se zpracováním a využitím odebrané ovariální tkáně pro výzkumné účely. V rámci studie byly realizovány jednotlivé fáze –⁠ odběr, zpracování, kryokonzervace, rozmražení a histopatologické zhodnocení ovariální tkáně.

Metodika a materiál

Chirurgický odběr

U všech pacientek bylo před samotným odběrem ovariální tkáně provedeno laboratorní vyšetření infekčních markerů sexuálně přenosných onemocnění (anti-HIV 1 a 2, HIV p24, HBsAg, anti-HBc, anti-HCV, syfilis) v souladu se standardy biologické bezpečnosti a příslušnými požadavky vyplývajícími ze zákona o specifických zdravotních službách a prováděcích předpisů pro oblast asistované reprodukce. Tato vyšetření jsou nezbytná před uložením biologického materiálu do kapalného dusíku s cílem minimalizovat riziko kontaminace a přenosu infekce mezi vzorky uchovávanými v Dewarových nádobách.

Chirurgický odběr ovariální tkáně byl následně realizován v rámci laparoskopické hysterektomie s oboustrannou adnexektomií prováděné na Gynekologicko-porodnické klinice FNOL. Operační výkony proběhly podle standardních protokolů bez výskytu perioperačních komplikací. Peroperačně byla resekována část ovariální tkáně, která byla okamžitě přenesena do studeného manipulačního média G-MOPS (Vitrolife, Švédsko) a transportována k dalšímu zpracování do Centra asistované reprodukce FNOL. Resekovaná děloha s adnexy byla odeslána k histopatologickému vyšetření na Ústav klinické molekulární patologie FNOL [35,36].

Transport tkáně

Ovariální tkáň je před zpracováním transportována ve předem připraveném studeném médiu G-MOPS (Vitrolife, Švédsko), při teplotě 4–8 °C ve studeném izolovaném obalu. Veškerá manipulace se tkání je prováděna ve sterilním prostředí za použití sterilních pomůcek a technik. Tento teplotní rozsah je považován za bezpečný pro krátkodobou přepravu tkáně, obvykle do 48 hod, bez významného poškození folikulů. Studie prokázaly, že transport ovariální tkáně při 4–8 °C po dobu 24–48 hod nemá negativní dopad na folikulární aktivitu ani kvalitu tkáně [37,38]. Transport při této nízké teplotě odpovídá indukované hypotermii, která snižuje metabolickou aktivitu tkáně na minimum, a tím chrání buňky před poškozením. Klinické zkušenosti z Dánska a Německa dokumentují úspěšné těhotenství po transplantaci ovariální tkáně, která byla transportována ve studeném prostředí po dobu 5–20 hod před kryokonzervací, což potvrzuje relativní odolnost tkáně vůči chladu během přepravy [38–40]. Výhodou zavedení této metody na našem pracovišti je to, že operační zákrok i následné laboratorní zpracování probíhají v rámci jedné kliniky, čímž je doba transportu tkáně ze sálu do embryologické laboratoře minimální. To by mělo přispět k zachování vysoké kvality tkáně a optimalizaci výsledků kryokonzervace a následné transplantace.

Zpracování tkáně

Zpracování ovariální tkáně by mělo být zahájeno do 1 hod od jejího odběru, aby byla zachována maximální životaschopnost folikulů. Veškerá disekce by měla být prováděna za sterilních podmínek při teplotě 4 °C. Po odběru je nutné tkáň opláchnout ve studeném manipulačním médiu G-MOPS (Vitrolife, Švédsko) pro udržení optimálního pH. Během zpracování je nutné tkáň uchovávat v chladném médiu a pravidelně ji oplachovat, aby se zabránilo kontaminaci krví a zachovala se její kvalita. Pomocí tupé disekce je nutné pečlivě oddělit kortex od meduly ovaria. Kortikální tkáň by měla být důkladně očištěna od tukových a dřeňových zbytků (obr. 2) a upravena do plochého tenkého plátu (obr. 3). Pomocí sterilního skalpelu se kortikální plát nařeže na čtverce o velikosti 5,0 × 5,0 mm (obr. 4) nebo lamely o rozměrech 2,0 × 0,5 cm a maximální tloušťce 1 mm. Veškerá tkáň nevyužitá pro kryokonzervaci, převážně dřeň a také menší část kortexu, byla odeslána k histopatologickému vyšetření. Po dokončení zpracování ovariální tkáně je zaznamenán celkový počet získaných fragmentů kortikální tkáně, které jsou poté připraveny pro proces kryokonzervace metodou pomalého mražení.

Postup mražení

Pro zamražení metodou pomalého zamražení bylo použito médium Embryo Freezing Pack, (Origio, Dánsko), které obsahuje 3 roztoky kryoprotektiv. Před zahájením samotného procesu mražení jsou předem připraveny zkumavky (CryoTubes) obsahující 0,9 ml kryokonzervačního média (roztok č. 3), které jsou následně umístěny do lednice. Vlastní kryokonzervace začíná ekvilibrací ovariální tkáně v kryokonzervačním roztoku č. 1 po dobu 5 min při pokojové teplotě. Poté je tkáň přenesena do roztoku č. 2 na 10 min a následně do roztoku č. 3, kde setrvá po dobu 15 min. Následně je tkáň vložena do připravené zkumavky (CryoTube) s vychlazeným roztokem č. 3 a doplněna na celkový objem 1,8 ml (obr. 5). Takto připravené vzorky jsou umístěny na 30 min do lednice při teplotě 4 °C před následným mražením.

Mrazicí program

Následně jsou připravené vzorky ovariální tkáně umístěny do automatizovaného programovatelného mrazicího systému (Kryo-360, Planer, Velká Británie) (obr. 6). Proces mražení je řízen přesně definovaným programem s následující teplotní křivkou (obr. 7): ochlazování je zahájeno rychlostí –2 °C/min do teploty –9 °C. Po dosažení této teploty následuje 5 min ekvilibrace, po níž je proveden manuální seeding (obr. 8). Poté dojde k setrvání vzorku 5 min při této teplotě. Dále ochlazování pokračuje rychlostí –0,3 °C/min do –40 °C, následně zrychleno na –10 °C/min do konečné teploty –140 °C. Poté jsou vzorky vyjmuty z přístroje a rychle přeneseny do Dewarovy nádoby s kapalným dusíkem (–196 °C) pro dlouhodobé skladování.

Rozmražení

Rozmražení kryokonzervované ovariální tkáně probíhá podle standardizovaného protokolu, který zahrnuje postupnou rehydrataci a odstranění kryoprotektivních látek. Zkumavky s ovariální tkání jsou nejprve vyjmuty z kapalného dusíku a ponechány při pokojové teplotě po dobu 5 s. Následně jsou umístěny do vodní lázně o teplotě 37 °C na 2 min, čímž dochází k řízenému rozmražení obsahu. Poté je ovariální tkáň postupně přenesena do série rozmražovacích roztoků (Origio, Dánsko) při pokojové teplotě: nejprve do roztoku č. 1 po dobu 5 min, následně do roztoku č. 2 opět po dobu 5 min, poté do roztoku č. 3 na 10 min a nakonec do roztoku č. 4 bez časového omezení. Následně je tkáň přemístěna do manipulačního média G-MOPS (Vitrolife, Švédsko) a ponechána zde po dobu 10 min před další manipulací. V našem případě ovariální tkáň nebyla použita k transplantaci, ale byla podrobena histopatologickému hodnocení za účelem posouzení kvality procesu kryokonzervace a následného rozmražení.

Histologické zpracování materiálu

Ovariální tkáň byla po odběru fixována v 10% neutrálně pufrovaném formalínu po dobu 24 hod. Následně byly vzorky standardně zpracovány a zality do parafinových bloků na Ústavu klinické molekulární patologie FNOL. Od každé pacientky byly zpracovány všechny zaslané fragmenty, přičemž pro každý vaječník bylo připraveno 5–7 parafinových bloků. Stejný postup byl aplikován i u vzorků, které byly po kryokonzervaci znovu rozmraženy. Z každého bloku byly připraveny 4 µm silné řezy, které byly obarveny hematoxylinem a eozinem (HE). Takto připravené preparáty byly následně histologicky zhodnoceny patologem a vzájemně porovnány. Pro histologické zhodnocení byl použit mikroskop Olympus BX46.

Výsledky

Ve zpracovaných fragmentech převažovala kortikální oblast s početným zastoupením dobře zachovalých primordiálních folikulů (obr. 9a, 9b). Méně často byly přítomny folikuly primární (obr. 10a, 10b), nejméně četně byly detekovány folikuly sekundární (obr. 11a, 11b). Antrální folikuly (obr. 12a–12c) byly zachyceny pouze ojediněle a převážně ve formě parciálních fragmentů.

Medulární oblast tvořila přibližně 10–30 % objemu hodnoceného materiálu. Její zastoupení bylo nižší u vzorků zpracovaných ve formě tkáňových kostek, naopak vyšší u vzorků připravených ve formě lamel.

Ve vzorcích znovu rozmražené tkáně nebyly pozorovány výrazné morfologické odchylky ve srovnání s tkání, která neprošla procesem pomalého zamražení. Mírné prosáknutí až edém stromatu kortikální oblasti může být důsledkem zpracování při fixaci a krájení, nelze však vyloučit ani vliv samotné kryokonzervace následného rozmražení. Tyto změny však nelze histologicky jednoznačně odlišit.

Morfologie folikulů všech vývojových stadií (primordiální, primární, sekundární) zůstala zachována, jednotlivé vrstvy folikulů byly dobře rozlišitelné a hodnotitelné.

V hodnocené ovariální tkáni nebyly přítomny žádné nádorové struktury, známky endometriózy ani jiné patologické změny.

Diskuze

Výsledky této studie ukazují, že kryokonzervace ovariální tkáně metodou pomalého mražení umožňuje zachování dobré morfologické integrity folikulů, zejména primordiálních, které tvoří klíčovou a nejpočetnější folikulární populaci v kortikální části ovaria. Tato zjištění potvrzují efektivitu metody pro uchování ovariální tkáně a podporují její využití v klinické praxi jako účinné strategie zachování plodnosti u vybraných skupin pacientek.

Dominance primordiálních folikulů ve vzorcích odpovídá jejich fyziologickému rozložení v ovariální tkáni mladých žen a potvrzuje správnost odběrové a zpracovatelské techniky, která upřednostňuje zachycení kortikální vrstvy. Ve všech hodnocených vzorcích byla morfologie primordiálních, primárních a sekundárních folikulů zachována, jednotlivé buněčné vrstvy byly histologicky rozlišitelné a nebyly patrné známky degenerace, apoptózy či ireverzibilního poškození. Přítomnost těchto struktur po kryokonzervaci a rozmražení odpovídá výsledkům dosavadních studií, které prokazují vysokou odolnost primordiálních folikulů vůči chladovému stresu a jejich schopnost přežít proces zamražení [42].

Mírné edematózní změny v kortikálním stromatu, pozorované u některých vzorků, mohou být částečně artefaktem fixace a parafinizace. Tyto změny jsou nicméně považovány za reverzibilní a nezhoršují hodnotitelnost ani kvalitu folikulární struktury. Podobné nálezy byly popsány i v jiných studiích zabývajících se histologickým hodnocením zamražené ovariální tkáně [43]. Zachování integrity stromatu je přitom důležité nejen z hlediska podpory přežívání folikulů, ale také pro revasularizaci transplantátu a jeho funkční integraci v místě reimplantace.

Z hlediska technického zpracování tkáně bylo zjištěno, že forma přípravy tkáně má přímý vliv na poměr zastoupení kortikální a medulární oblasti. Zpracování tkáně do čtvercových bloků vede k vyššímu podílu kortexu, tedy vrstvy s nejvyšší folikulární hustotou a klinickým významem. Oproti tomu lamelární řezy obsahují více meduly, která je na folikuly chudší. Toto pozorování má významný dopad na optimalizaci laboratorních i operačních postupů, jelikož výběr vhodného tvaru a tloušťky preparátu může zvýšit efektivitu kryokonzervace a následné transplantace.

Laparoskopický odběr ovariální tkáně představuje v současnosti standardní přístup k zachování fertility u onkologických pacientek, a to zejména v případech, kdy není možné provést řízenou ovariální stimulaci a odběr oocytů –⁠ u prepubertálních dívek nebo u pacientek s potřebou urgentního zahájení gonadotoxické léčby. Výhodou této metody je nejen její univerzálnost, ale i fakt, že odběr lze provést nezávisle na menstruačním cyklu a bez nutnosti hormonální přípravy. Ve srovnání s jinými metodami nabízí transplantace ovariální tkáně také obnovení endogenní endokrinní funkce, což je významné z hlediska celkové kvality života pacientek po onkologické léčbě.

Významným přínosem této práce je detailní popsání celého procesu –⁠ od odběru přes laboratorní zpracování až po histopatologické vyhodnocení –⁠ v rámci jednoho pracoviště. Krátká doba transportu tkáně a zachování chladového řetězce zvyšují pravděpodobnost zachování folikulární integrity a podporují kvalitu výsledné kryokonzervace.

Studie rovněž ukazuje potenciál využití ovariální tkáně odebrané u transgender osob, které byly při narození přiřazeny jako ženy (AFAB). I přes dlouhodobou hormonální terapii androgeny byly ve všech případech nalezeny dobře zachovalé folikuly všech vývojových stadií.

Kryokonzervace ovariální tkáně metodou pomalého zmražení umožňuje zachování struktury folikulů i celkové histologické integrity tkáně. Výsledky podporují použití této metody nejen u onkologických pacientek, ale i u dalších skupin, například pacientek s genetickým rizikem předčasného ovariálního selhání. Optimalizace laboratorních protokolů a standardizace operační techniky mohou dále zvýšit její klinickou efektivitu a bezpečnost. Zajištění multidisciplinární spolupráce mezi onkology, gynekology, embryology a patology bude klíčem k úspěšnému začlenění této metody do širší klinické praxe zachování fertility.

Závěr

Histologické hodnocení potvrdilo, že ovariální tkáň kryokonzervovaná metodou pomalého zamražení si zachovává dobrou morfologii folikulů včetně intaktní struktury. Výsledky dále ukázaly, že zpracování tkáně ve formě čtverečků je lepší pro zachování vyššího podílu funkčně významné kortikální oblasti.

Nepřítomnost patologických struktur potvrzuje vhodnost takto uchované tkáně pro klinické využití, zejména v rámci autotransplantačních strategií fertilitní ochrany u onkologických pacientek.