Inaktivace genů BRCA1, BRCA2 a p53 u sporadického karcinomu vaječníků


Inactivation of BRCA1, BRCA2 and p53 Genes in Sporadic Ovarian Cancer

Objective:
To analyze loss of heterozygosity (LOH), loss of expression and somatic mutations of BRCA1, BRCA2 and p53 genes in sporadic epithelial ovarian cancer samples.

Design:
Original paper.

Setting:
Oncogynecologic center, Clinic of Obstetrics and gynecology, First Faculty of Medicine, Charles University in Prague and General Teaching Hospital, Prague.

Material and methods:
We used genomic DNA and total RNA from peripheral blood and fresh frozen tumor as a template for LOH, loss-of-expression and mutation analyses.

Results:
LOH in at least one region was found in 60% of tumors. Majority of these alterations occurred not solely, but in conjunction with other region deletions.

Conclusion:
Our study confirms high frequency of somatic alteration of BRCA1, BRCA2 and p53 genes in sporadic epithelial ovarian cancer.

Key words:
BRCA1, BRCA2, p53, ovarian cancer, LOH.


Autoři: M. Zikán 1;  P. Pohlreich 2;  P. Freitag 1;  M. Janoušek 1;  D. Pavlišta 1;  D. Fischerová 1;  N. Jančárková 1;  J. Sláma 1;  I. Pinkavová 1;  D. Cibula 1
Působiště autorů: Onkogynekologické centrum, Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha, přednosta prof. MUDr. A. Martan, DrSc. 1;  Ústav biochemie a experimentální onkologie 1. LF UK, přednosta prof. MUDr. A. Šedo, DrSc. 2
Vyšlo v časopise: Čes. Gynek.2008, 73, č. 5 s. 298-302
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Cíl studie:
Analýza četnosti a způsobu inaktivace tumorsupresorových genů BRCA1, BRCA2 a p53 u sporadického epiteliálního karcinomu vaječníků.

Typ studie:
Původní práce.

Název a sídlo pracoviště:
Onkogynekologické centrum, Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha.

Materiál a metodika:
Analýza ztráty heterozygozity (LOH), ztráty exprese a přítomnosti somatických mutací byla zpracována na templátu genomické DNA a celkové buněčné RNA získaných z čerstvě zmražených nádorů a periferní krve.

Výsledky:
LOH v alespoň jedné oblasti byl nalezen u 60 % nádorů. Většina alterací se nevyskytovala solitárně, ale ve spojení s delecí dalších oblastí.

Závěr:
Naše studie potvrdila vysokou četnost somatických alterací genů BRCA1 a BRCA2 u sporadického epiteliálního karcinomu vaječníků.

Klíčová slova:
BRCA1, BRCA2, p53, karcinom vaječníků, LOH.

ÚVOD

Naše znalosti o roli genů BRCA1 a 2 (BReast CAncer genes 1 and 2) u hereditárního karcinomu prsu a vaječníků se velmi rychle rozšiřují [16, 17]. Stále však víme velmi málo o jejich úloze v procesu vzniku a rozvoje sporadického karcinomu prsu, a především vaječníků.

Frekvence alelických ztrát genu BRCA1 u epiteliálního ovariálního karcinomu je uváděna v rozmezí 23–44 procenta, genu BRCA2 pak 25–40 % [4, 5, 7, 11]. Somatické mutace genů BRCA1 a 2 jsou extrémně vzácné. Je zajímavé, že pokud jsou nalezeny, pak u karcinomu z jasných buněk [7, 14]. Dalším možným mechanismem somatické inaktivace těchto tumorsupresorových genů je hypermetylace promotorových sekvencí [3, 12], a tím potlačení exprese. V úvahu přicházejí i velké genomické přestavby (gross genomic rearrangements), dosud sice popisované vzácně, nicméně teoreticky považované za poměrně časté události při amitotickém dělení nádorových buněk [13, 17].

Výpadek funkce genu BRCA1 je spojován s horší odpovědí na léčbu taxany. Teoretické vysvětlení tkví v odpovědnosti proteinového produktu tohoto genu za rozpoznání poruchy mitotického vřeténka a spuštění procesu apoptózy.

Alterace genu p53 jsou časnou událostí v ovariální karcinogenezi [10]. Mutace a/nebo overexprese p53 byly detekovány ve 26–62 % nádorů [2]. Univariantní analýza ukázala v několika studiích vztah mezi overexpresí a horším přežitím u pacientek s ovariálním karcinomem, zdá se však, že nebude nezávislým markerem špatné prognózy [6].

V naší práci jsme studovali frekvenci a způsob inaktivace genů BRCA1, BRCA2 a p53 ve skupině 30 vzorků sporadického karcinomu vaječníků. Analyzovali jsme ztrátu heterozygozity (loss of heterozygosity – LOH), přítomnost somatických mutací a ztrátu exprese.

METODIKA

Nádorová tkáň

U pacientek operovaných na Gynekologicko-porodnické klinice 1. LF UK a VFN pro diagnózu epiteliálního karcinomu ovaria byla přímo na operačním sále nebo při vyšetření peroperační histologie odebrána částka asi 1 x 1 x 1 cm z velmi suspektního místa odebraného nádoru. Částka byla bezprostředně po odběru zmražena v tekutém dusíku a skladována v hlubokomrazícím boxu při teplotě –80 °C. Z každého odebraného vzorku nádoru byly standardním postupem připraveny dva histologické řezy. Po obarvení hematoxylinem-eozinem odečetl patolog podíl nádorových buněk ve vyšetřovaném vzorku. Pro analýzu byly použity pouze nádory, v nichž bylo zastoupení nádorových buněk větší než 50 %.

Každé pacientce bylo současně odebráno 7 ml periferní žilní krve do zkumavky s EDTA. Tento vzorek sloužil k izolaci DNA a RNA.

Všechny vyšetřované pacientky daly písemný informovaný souhlas s genetickým vyšetřením a byly poučeny o možnosti odhalení hereditární dispozice a o důsledcích tohoto nálezu. Protokol vyšetření i text informovaného souhlasu byly schváleny Etickou komisí 1. lékařské fakulty University Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice.

Histopatologické charakteristiky analyzovaných nádorů jsou uvedeny v tabulce 1. Většina pacientek (21/30 – 70 %) byla diagnostikována ve stadiu III podle FIGO. Téměř identicky byla zastoupena stadia I a IV (4/30 – 13,3%; 5/30 – 16,7 %), stadium II nebylo reprezentováno žádnou pacientkou.

Tab. 1. Histopatologické charakteristiky vyšetřovaných nádorů
Histopatologické charakteristiky vyšetřovaných nádorů

Izolace DNA a RNA z plné periferní krve a tkáně tumoru

Nukleové kyseliny byly izolovány komerčními kity dle instrukcí výrobce, jak již bylo dříve popsáno [16]. Jako referenční DNA byla použita DNA z nenádorové tkáně, celková RNA byla přepsána do cDNA (complementary DNA) a použita k části mutační analýzy genů BRCA1 a 2.

Mikrosatelitární markery

Jako mikrosatelitární markery (také STRs – short tandem repeats) jsou označovány úseky DNA, v nichž se opakovaně tandemově za sebou vyskytuje jedno- až šestibázový motiv. Celková délka takové sekvence je do několika set párů bází. Jsou velmi frekventní, jeden mikrosatelitární marker připadá na 6 kb genomické sekvence. Pro svou vysokou heterozygozitu jsou využívány v mnoha aplikacích, včetně forenzních.

V naší studii jsme použili mikrosatelitové markery pro analýzu ztráty heterozygozity. Jako informativní byl označen marker, pro nějž byla pacientka heterozygotní. Ztráta heterozygozity (LOH – loss of heterozygosity) v nádoru byla posuzována vzájemným srovnáním intenzity alel ve zdravé a nádorové tkáni podle vzorce (At x Bn)/(Bt x An). LOH byl přítomen, pokud byla intenzita předpokládané deletované alely snížena na méně než 50 % (posuzováno podle jednotlivých metod – vizuálně, nebo podle plochy pod křivkou).

Amplifikace mikrosatelitárních markerů

K analýze byly pro oblast každého z genů BRCA1/2 zvoleny tři mikrosatelitové markery, pro oblast genu p53 markery dva. Všechny markery pro gen BRCA1 a jeden marker pro gen p53 byly intragenové, jeden marker pro gen p53 a tři markery pro gen BRCA2 hraničící (flanking). Vzdálenost markeru D13S169 od začátku kódující sekvence genu BRCA2 (up-stream) byla 284,5 kb, a markerů D13S1699 a D13S1701 od konce kódující sekvence genu BRCA2 (down-stream) 550 kb a 171 kb, vzdálenost markeru TP02 od konce kódující sekvence genu p53 byla 27 kb. Dostupné markery byly nalezeny pomocí databází The Genom Database (http://www.gdb.org) a LocusLink (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Amplifikace byla provedena pomocí standardní PCR [8]. Použité primery a délku amplikonu uvádí tabulka 2.

Tab. 2. Primery použité pro amplifikaci mikrosatelitních markerů a délky jednotlivých amplikonů. 1GenBank L78833. 2GenBank NT_024524. 3Markery nejsou intragenové. 4U těchto markerů nebyla stanovována délka alel. 5GenBank NT_010718.
Primery použité pro amplifikaci mikrosatelitních markerů a délky jednotlivých amplikonů. 1GenBank L78833. 2GenBank NT_024524. 3Markery nejsou intragenové. 4U těchto markerů nebyla stanovována délka alel. 5GenBank NT_010718.

Polyakrylamidová elektroforéza s přídavkem polymeru Spreadex Polymer NAB

Amplifikované fragmenty byly rozděleny horizontální polyakrylamidovou elektroforézou. K akrylamidu byl přidán Spreadex Polymer NAB (Elchrom Scientific, USA) obsahující speciální monomer a síťovací činidlo. Spreadexové gely získávají vysokou rozlišovací schopnost i na krátkých vzdálenostech, což umožňuje separaci fragmentů lišících se pouze o 2 báze na krátkých gelech. 2 – 3 μl PCR produktu byly smíchány s 1 μl nanášecího pufru obsahujícího z 50 % glycerol, 0,05 % bromfenolovou modř a 0,05 % xylencyanol ve standardním TAE pufru. Vzorky byla rozděleny na 5 cm dlouhém nedenaturujícím gelu, acrylamid:bisakrylamid 29:1, obsahujícím 10 % Spreadex Polymer NAB. Pro zabránění nerovnoměrné polymerace gelu při styku s hřebenem byl použit 1 cm dlouhý 4%, tzv. ostřící gel. Elektroforéza probíhala ve standardním TAE pufru při laboratorní teplotě za konstantního napětí 200 V v aparatuře MiniProtean (Bio-Rad Laboratoires, USA). Gely byly 20 min barveny v roztoku SYBR Green (1 : 10000) v TAE pufru a fotografovány. Podle délky mikrosatelitového markeru byla zvolena vhodná koncentrace akrylamidu v gelu a délka (čas) elektroforézy. Ztráta heterozygozity byla hodnocena subjektivně dvěma nezávislými pozorovateli jako snížení intenzity signálu o více než 50 %. Jako velikostní standard byl použit M3 Marker (Elchrom Scientific, USA), získaný digescí pBR322 třemi restrikčními enzymy, MspI, HhaI a HaeIII. Tato metodika byla vyvinuta na Ústavu biochemie a experimentální onkologie 1. LF UK [8].

VÝSLEDKY

Analýza byla provedena ve třech tumorsupresorových genech – BRCA1, BRCA2p53 – za použití intragenových a sousedících (flanking) mikrosatelitových markerů.

Jako informativní byl hodnocen marker, pro nějž byla příslušná pacientka heterozygotní, jako neinformativní pak marker, který byl u pacientky homozygotní. Celková heterozygozita (informativnost) se pohybovala mezi 90,0 % a 96,7 %. V markerech pro alelickou ztrátu v oblasti genu BRCA1p53 nebyla informativní jediná pacientka (3,3 %), v oblasti BRCA2 tři pacientky (10 %).

Ztráta heterozygozity v oblasti genu BRCA1 byla nalezena u 11 nádorů (37,9 %). Histologické typy nádorů, kromě endometroidního karcinomu, jsou v této skupině zastoupeny rovnoměrně: sérózní karcinom – 4 (36,4 %), mucinózní karcinom – 3 (27,2 %), nediferencovaný karcinom – 4 (36,4 %).

V oblasti genu BRCA2 byla ztráta heterozygozity přítomna u 10 nádorů (37,0 %), z toho u 2 serózních karcinomů (20,0 %), 4 mucinózních karcinomů (40,0 %), 3 nediferencovaných karcinomů (30,0 %) a jednoho endometroidního karcinomu (10,0 %).

Ve více než polovině analyzovaných nádorů byla zachycena ztráta heterozygozity v oblasti genu p53 – 16 nádorů (55,1 %). Zastoupení tří hlavních histologických typů je zde rovnoměrné. Serózní karcinom – 6 (37,4 %), mucinózní karcinom – 5 (31,3 %), nediferencovaný karcinom – 5 (31,3 %). Endometroidní karcinom nebyl v této skupině zastoupen (tab. 3).

Tab. 3. Zastoupení alelických ztrát (v informativních nádorech) u jednotlivých histotypů
Zastoupení alelických ztrát (v informativních nádorech) u jednotlivých histotypů

Ztráta heterozygozity (LOH) v některé z analyzovaných oblastí byla zachycena u 18 nádorů (60,0 %). U pěti z těchto nádorů byl LOH identifikován pouze v úseku jednoho z genů (27,8 %). Třikrát v oblasti genu p53 (16,7 %) a dvakrát v oblasti genu BRCA2 (11,1 %). V oblasti genu BRCA2 byl pozorován LOH i ve spojení se ztrátou heterozygozity v oblasti genu p53 (2 případy – 11,1 %). Ztráta heterozygozity v oblasti genu BRCA1 nebyla nikdy pozorována izolovaně, vždy pouze ve spojení s LOH v oblasti p53 (5 případů – 27,8 %) nebo p53BRCA2 (6 případů – 33,3 %), ne však ve spojení s LOH pouze v oblasti BRCA2. Uvedené podíly se vždy vztahují ke skupině nádorů s LOH (tab. 4).

Tab. 4. Jednotlivé vzorce kumulace alelických ztrát a jejich zastoupení ve vyšetřované skupin
Jednotlivé vzorce kumulace alelických ztrát a jejich zastoupení ve vyšetřované skupin

Ve všech analyzovaných nádorech byla vyšetřována exprese genů BRCA1 a BRCA2 metodou RT-PCR (reverse transcription PCR). Exprese genu BRCA1 nebyla přítomna u dvou nádorů z vyšetřovaného souboru (6,7 %), exprese genu BRCA2 chyběla u jednoho vzorku (3,3 %). Nádor, v němž se nepodařilo zachytit expresi genu BRCA2, byl heterozygotní pro všechny sledované mikrosatelitní markery a nebyla v něm detekována ztráta heterozygozity. Jeden z nádorů s chybějící expresí genu BRCA1 také nevykazoval ztrátu heterozygozity, ve druhém byla naopak potvrzen výpadek alely na základě analýzy všech tří mikrosatelitových markerů.

U nádorů se ztrátou heterozygozity v oblastech genů BRCA1BRCA2 byla provedena mutační analýza s cílem odhalit případné somatické mutace. Analýza proběhla standardními metodami používanými naší laboratoří k detekci hereditárních mutací. Nebyla však nalezena žádná somatická mutace těchto genů.

DISKUSE

Karcinom vaječníků je jednou z nejagresivnějších gynekologických malignit. Je to nádor chemosenzitivní, avšak ne chemokurabilní. Chemoterapie má ale v jeho managementu nezastupitelnou roli.

Tři čtvrtiny epiteliálních ovariálních karcinomů zachytíme v pokročilém stadiu s peritoneálním rozsevem. Typická je pro ně častá rekurence a vývoj chemorezistence. Tu můžeme rozdělit do dvou skupin: de novo rezistence a získaná rezistence. Přibližně 20 % pokročilých ovariálních karcinomů primárně neodpovídá na podanou chemoterapii – hovoříme pak o de novo rezistenci narozdíl od skupiny nádorů, u nichž dochází k postupné selekci rezistentních klonů, a tedy získané chemorezistenci.

Výzkumná pozornost je zaměřena na identifikaci pacientek, u nichž lze očekávat rozvoj rezistence, a na identifikaci nových terapeutických přístupů, které budou založeny na biologických charakteristikách daného primárního nebo rekurentního nádoru a budou do značné míry personalizované.

Jednotlivé histologické typy epiteliálního ovariálního karcinomu vznikají za účasti odlišných genetických změn. Největší pozornost je soustředěna na predikci rezistence vůči platinovým derivátům a taxanům jako základním látkám užívaným v adjuvantní a neadjuvantní chemoterapii u karcinomu ovarií. Mnoho prací se věnuje prediktivnímu významu inaktivace genu p53, jehož produkt je klíčový pro kontrolu buněčného cyklu a spuštění apoptózy, a dochází k různým závěrům. V současné době se zdá, že inaktivace p53 může sloužit jako prediktivní faktor pouze ve spojení s dalšími genetickými defekty, kdy až následně výpadek funkce proteinu p53 znamená sníženou senzitivitu k platinovým derivátům (např. mutace genu PTEN). Důležitějším samostatným prediktorem se v současné době jeví být výpadek proapoptotického genu Bax nebo nadměrná exprese protiapoptotického genu (v současné době probíhají klinické studie fáze II a III s antisense oligonukleotidem k Bcl-2 – oblimersenem).

Molekulárním argumentem pro kombinaci taxanů s platinovými deriváty je zprostředkování apoptózy kaskádou spouštěnou proteinem Bax nezávisle na p53. Rezistence k platinovým derivátům se však může i časně kombinovat s rezistencí k taxanům. Ze studií u žen s hereditární mutací genu BRCA1 máme informaci, že karcinomy prsu u těchto žen vykazují nižší míru odpovědi na terapii taxany ve srovnání se skupinou pacientek bez mutace. Jak dokládá naše studie, podobně vzniká rezistence i u karcinomu ovariálního.

Zdá se, že v blízké budoucnosti bude molekulární analýza primárního nádoru nebo recidivujících tumorů užitečným nástrojem pro predikci (a případní nastavení) terapeutické odpovědi. Zároveň přinese i využití biologicky orientované léčby se zaměřením na kaskády ovlivňující proces chemorezistence (antisense oligonukleotidy, inhibitory proteinkináz).

ZÁVĚR

Výzkum úlohy genů BRCA1 a 2 u sporadického karcinomu vaječníků teprve začíná. Naše studie potvrzuje, že defekt těchto genů je významnou a častou událostí v ovariálním epiteliálním karcinomu. Důležitá bude pro budoucnost především analýza vztahu těchto alterací k biologickým vlastnostem nádorů a jejich odpovědi na léčbu.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NR/9051-3.

MUDr. Michal Zikán, Ph.D.

Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN

Apolinářská 18

128 00 Praha 2

e-mail: michal.zikan@lf1.cuni.cz


Zdroje

1. Chan, K., Ozcelik, H., Cheung, A., et al. Epigenetic factors controlling the BRCA1 and BRCA2 genes in sporadic ovarian cancer. Cancer Res, 2002, 62, p. 4151-4156.

2. Eltabbakh, GH., Belinson, JL., Kennedy, AW., et al. p53 overexpression is not an independent prognostic factor for patients with primary ovarian epithelial cancer. Cancer, 1997, 80, 5, p. 892-898.

3. Esteller, M., Silva, J., Dominguez, G., et al. Promoter hypermethylation and BRCA1 inactivation in sporadic breast and ovarian tumors. J Natl Cancer Inst, 2000, 92, 7, p. 564-569.

4. Geisler, J., Rathe, J., Hattermann-Zogg, M., et al. BRCA1 dysfunction is common in ovarian cancer. J Natl Cancer Inst, 2004, 94, p. 61-67.

5. Gras, E., Cortes, J., Diez, O., et al. Loss of heterozygosity on chromosome 13q12-q14, BRCA-2 mutations and lack of BRCA-2 promoter hypermethylation in sporadic epithelial ovarian tumors. Cancer, 2001, 92, p. 787-795.

6. Herod, JJ., Eliopoulos, AG., Warwick, J. The prognostic significance of Bcl-2 and p53 expression in ovarian carcinoma. Cancer Res, 1996, 56, 9, p. 2178-2184.

7. Hilton, J., Geisler, J., Rathe, J., et al. Inactivation of BRCA1 and BRCA2 in ovarian cancer. J Natl Cancer Inst, 2002, 94, p. 1396-1406.

8. Janatova, M., Pohlreich, P., Matous, B. Detection of the most frequent mutations in BRCA1 gene on polyacrylamide gels containing Spreadex Polymer NAB. Neoplasma, 2003, 50, 4, p. 246-250.

9. Janatova, M., Zikan, M., Dundr, P., et al. Novel somatic mutations in the BRCA1 gene in sporadic breast tumors. Hum Mutat, 2005, 25, 3, p. 319.

10. Kupryjanczyk, J., Thor, AD., Beauchamp, R., et al. p53 gene mutations and protein accumulation in human ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci, 1993, 90, p. 4961-4965.

11. McCoy, M., Mueller, C., Roskelley, C. The role of the breast cancer susceptibility gene 1 (BRCA1) in sporadic epithelial ovarian cancer. Reprod Biol Endocrin, 2003, 1, p. 72.

12. Miyamoto, K., Fukutomi, T., Asada, K., et al. Promoter hypermethylation and post-transcriptional mechanisms for reduced BRCA1 immunoreactivity in sporadic human breast cancers. Jpn J Clin Oncol, 2002, 32, 3, p. 79-84.

13. Szabo, C., King, MC. Population genetics of BRCA1 and BRCA2. Am J Hum Genet, 1997, 60, p. 1013-1020.

14. Takahashi, H., Chiu, H., Bandera, C., et al. Mutations of the BRCA2 gene in ovarian carcinomas. Cancer Res, 1996, 56, p. 2738-2741.

14. Verma, M., Srivastava, S. Epigenetics in cancer: implications for early detection and prevention. Lancet Oncol, 2002, 3, p. 755-763.

15. Zikan, M., Pohlreich, P., Stribrna, J. Mutational analysis of the BRCA1 gene in 30 Czech ovarian cancer patients. J Genet, 2005, 84, 1, p. 63-67.

16. Zikan, M., Pohlreich, P., Stribrna, J. Novel complex genomic rearrangement of the BRCA1 gene. Mutat Res, 2007 (doi:10.1016/j.mrfmmm.2007.08.002).

Štítky
Dětská gynekologie Gynekologie a porodnictví Reprodukční medicína

Článek vyšel v časopise

Česká gynekologie

Číslo 5

2008 Číslo 5

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Léčba bolesti v ordinaci praktického lékaře
nový kurz
Autoři: MUDr. PhDr. Zdeňka Nováková, Ph.D.

Revmatoidní artritida: včas a k cíli
Autoři: MUDr. Heřman Mann

Jistoty a nástrahy antikoagulační léčby aneb kardiolog - neurolog - farmakolog - nefrolog - právník diskutují
Autoři: doc. MUDr. Štěpán Havránek, Ph.D., prof. MUDr. Roman Herzig, Ph.D., doc. MUDr. Karel Urbánek, Ph.D., prim. MUDr. Jan Vachek, MUDr. et Mgr. Jolana Těšínová, Ph.D.

Léčba akutní pooperační bolesti
Autoři: doc. MUDr. Jiří Málek, CSc.

Nové antipsychotikum kariprazin v léčbě schizofrenie
Autoři: prof. MUDr. Cyril Höschl, DrSc., FRCPsych.

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se