Molekulární diagnostika v patologii uzlů štítné žlázy: přehled současných poznatků a klinických aplikací

Souhrn

Molekulární diagnostika se v posledních dvou dekádách stala nedílnou součástí moderní patologie štítné žlázy. Její hlavní přínos spočívá v upřesnění diagnostiky neurčitých cytologických nálezů, ve stratifikaci rizika u diferencovaných karcinomů štítné žlázy a v identifikaci prediktivních markerů cílené léčby. Tento přehledový článek shrnuje současné poznatky o molekulárních změnách v nádorech štítné žlázy, dostupných diagnostických platformách a jejich klinickém využití. Na základě recentních publikací je diskutována role molekulárního testování v kontextu současných klasifikací WHO a doporučení odborných společností, stejně jako jeho limity a budoucí perspektivy. Přehled je doplněn vlastními výsledky a zkušenostmi.

Klíčová slova:

štítná žláza – nádory štítné žlázy – molekulární diagnostika – tenkojehlová aspirační biopsie štítné žlázy (FNAB)

Úvod

Nodulární onemocnění štítné žlázy patří k nejčastějším endokrinním diagnózám. Prevalence uzlů detekovaných ultrazvukem dosahuje až 50 % u dospělé populace, přičemž malignita je přítomna přibližně u 5–15 % případů [1]. Nezbytným diagnostickým nástrojem u sonograficky suspektních uzlů ve štítné žláze je aspirační biopsie tenkou jehlou (FNAB) s následným cytologickým zhodnocením podle systému Bethesda. Přibližně 20–30 % vzorků však spadá do neurčitých (indeterminovaných) kategorií (Bethesda III a IV, případně V), u nichž samotná cytologie nedokáže spolehlivě rozlišit benigní a maligní léze [2]. Klasifikace, diagnostika a léčba nádorů štítné žlázy jsou neustále aktualizovány a přehodnocovány. Poslední aktualizace patologické klasifikace nádorů odvozených od folikulárních buněk zohledňuje již molekulární pozadí nádorů [3]. Vyvíjí se i kategorizace TNM stadií. K nejvýraznějším změnám došlo mezi 7. a 8. verzí, kdy v důsledku zvýšení cut-off věku na 55 let, nezahrnutí mikroskopické extratyroidální invaze mezi prognostické faktory způsobující výrazné změny v kategorizaci T a změnám v kategorizaci lymfatických metastáz došlo ke snížení stagingu u výrazné části pacientů (AJCC/UICC TNM staging, the 8^th edition) [4]. V nejnovější 9. verzi k výrazným změnám již nedošlo [5]. Celkově jsme v posledních letech svědky snahy o výraznou deeskalaci léčby a celkového managementu diferencovaných karcinomů štítné žlázy (DTC), kdy je poukazováno na přílišné vyšetřování a nadměrnou léčbu u nízce rizikových diferencovaných karcinomů. Tento trend se promítá do amerických a v poslední době i evropských doporučení týkajících se diagnostiky a léčby uzlů štítné žlázy [1, 6–8]. V rámci této deeskalace se prosazuje možnost aktivního sledování pacienta s nízce rizikovým DTC, u chirurgických zákroků je snaha preferovat lobektomii před totální tyroidektomií, omezit indikace adjuvantní terapie radiojodem (RAI), využívat alternativní minimálně invazivní techniky, jako je radiofrekvenční a laserová ablace [9]. Samozřejmě že by tato deeskalace neměla být na úkor onkologické bezpečnosti pacientů [10]. Zhodnocení tohoto významného zásahu do diagnostiky a léčby pacientů s nádory štítné žlázy bude možné až v dlouhodobém horizontu, neboť latence onemocnění může být velmi dlouhá [11].

Molekulární pozadí nádorů štítné žlázy

Ke vzniku a rozvoji nádoru dochází v důsledku somatických, vzácněji zárodečných patogenních variant, které jsou příčinou nekontrolovaného růstu a maligní transformace. Nejčastěji nalézané mutace u nádorů štítné žlázy a jejich klinické důsledky jsou uvedeny v tab. 1 [12]. Nejlépe charakterizovanou skupinou nádorů jsou diferencované karcinomy štítné žlázy, zejména papilární karcinom (PTC). Genomické studie, včetně projektu The Cancer Genome Atlas (TCGA), prokázaly, že většina DTC je řízena aktivací signální dráhy MAPK, případně dráhy PI3K/AKT [13]. Na tomto základě byly nádory rozděleny na BRAF-like a RAS-like.

Je třeba si uvědomit, že každý nádor se vyvíjí v místě a čase. Vyvíjí se jak jeho mutační profil, tak okolí nádoru, tzv. nádorové mikroprostředí, které je charakterizováno epigenetickými, imunitními a jinými markery. K časným (tzv. driver) mutacím a molekulárním změnám se mohou postupně přidružovat další genetické alterace, což vede k dediferenciaci a progresi nádoru, k horší prognóze (tab. 2) [6]. Jak PTC, včetně jeho folikulární varianty FVPTC (follicular variant of papillary thyroid carcinoma), tak FTA (follicular thyroid adenoma), folikulární neoplazie typu NIFTP (non-invasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like nuclear features), FTC (follicular thyroid carcinoma), IEFVPTC (invasive encapsulated follicular variant papillary carcinoma) mohou postupně dediferencovat až k anaplastickému karcinomu [12]. Vývoj nádoru tak prochází jak molekulárními, tak morfologickými změnami. S progresí dochází k postupnému překryvu genotypu i fenotypu mezi indolentnějším RAS-like a agresivnějším typem BRAF-like.

Molekulární testování u neurčitých cytologických kategorií

Indikace molekulárního testování

Molekulární diagnostika byla do klinické praxe zavedena s cílem snížit počet zbytečných chirurgických výkonů a zároveň identifikovat pacienty s vyšším rizikem agresivního průběhu onemocnění [14–16]. V posledních letech navíc význam molekulárních metod přesahuje rámec diagnostiky a zasahuje do prognostiky i terapeutického rozhodování [12].

Hlavní indikací molekulárních testů zůstávají FNAB vzorky klasifikované jako Bethesda III (atypie nejasného významu) a Bethesda IV (folikulární neoplazie) (tab. 3).

Cílem je dle aktuálních doporučení [12, 17]:

• snížit počet diagnostických lobektomií;
• lépe odhadnout riziko malignity;
• individualizovat chirurgický přístup.

Komerční diagnostické platformy

V diagnostice pomocí molekulárních markerů je možné využít dvou hlavních přístupů. První jsou tzv. rule-out testy, které vylučují diagnózu maligního onemocnění tím, že pomocí stanovení exprese genů identifikují benigní uzly, a mohou tak zabránit zbytečné operaci (vysoká negativní prediktivní hodnota –⁠ NPV). Druhým přístupem jsou tzv. rule-in testy, které identifikují genetické změny typické pro maligní uzly, a mohou tak přispět k optimalizaci chirurgického zákroku (vysoká pozitivní prediktivní hodnota –⁠ PPV). V posledním desetiletí došlo k obrovskému vývoji těchto testů, a tak je k dispozici krom molekulárního testování v různých centrech i mnoho komerčních kitů nebo komerčně poskytovaných analýz, které oba přístupy a různé metody (především expresní analýzy a sekvenování nové generace –⁠ NGS) často kombinují a snaží se dosáhnout vysoké specificity i senzitivity vyšetření [18, 19]. Mezi nejznámější komerční platformy patří:

• Afirma Gene Sequencing Classifier (GSC) je primárně „rule-out“ test založený na analýze genové exprese a RNA sekvenování. Deklarovaná vysoká negativní prediktivní hodnota umožňuje konzervativní postup u pacientů s nízkým rizikem malignity [20, 21].
• ThyroSeq v3 je NGS panel, který léta vyvíjí skupina prof. Nikiforova, analyzující více než 100 genů, mutací, fúzí a změn počtu kopií. Je považován za test kombinující „rule-out“ i „rule-in“ strategii a poskytuje detailní molekulární profil léze [22].
• Testy (ThyGeNEXT/ThyraMIR) kombinují detekci bodových mutací s analýzou mikroRNA, čímž zvyšují diagnostickou přesnost u hraničních lézí [23].

Výrobci těchto testů deklarují vynikající diskriminační ukazatele [16, 19]:

• vysoká negativní prediktivní hodnota (NPV) –⁠ pravděpodobnost, že negativní výsledek testu skutečně indikuje benigní uzel;
• vysoká pozitivní prediktivní hodnota (PPV) –⁠ pravděpodobnost, že pozitivní výsledek testu skutečně indikuje maligní uzel;
• specificita –⁠ procento maligních uzlů, které byly správně identifikovány (true positive rate);
• senzitivita –⁠ procento benigních uzlů, které byly správně identifikovány (true negative rate).

V reálné laboratorní praxi však zejména NPV nedosahuje tak uspokojivých hodnot a může docházet k falešně negativním výsledkům [7, 24]. Je to dáno i biologickou povahou nádorového procesu, protože rule-out testy jsou založeny především na expresi genů, která může být variabilní a měnit se v čase. Samozřejmě že výsledky molekulárně genetických testů výrazně závisí na kvalitě bioptického materiálu, přítomnosti nádorových buněk ve vzorku a buněčné heterogenitě analyzovaného materiálu, především u expresních profilů, včetně miRNA.

Molekulárně genetická analýza FNAB v Endokrinologickém ústavu

Na Oddělení molekulární endokrinologie Endokrinologického ústavu se problematice genetiky karcinomů štítné žlázy výzkumně věnujeme již přes 30 let a provádíme zde i rutinní genetickou analýzu ze vzorků zamražených tkání, parafinových bločků a FNAB. U preoperačnídiagnostiky byl primárně zvolen rule-in přístup, kdy se analyzují níže popsané mutace a jejich detekce může svědčit pro malignitu uzlu. Vyšetření se provádí především z FNAB vzorků s Bethesda klasifikací III–V, případně na vyžádání lékaře i ze sonograficky suspektních uzlů s klasifikací Bethesda II. V minulém roce jsme upravili a podstatně rozšířili předoperační vyšetření vzorků FNAB. Nejprve je po izolaci genetického materiálu vzorek testován na dostatečné zastoupení tyreoidálních buněk. Pokud je vzorek neadekvátní (< 5 % tyreocytů), je vyřazen z dalšího testování pro vysoké riziko falešně negativního výsledku. V případě, že je zastoupení buněk dostatečné nebo hraniční, vzorek je vyšetřen nejprve na nejčastější patogenní variantu papilárního karcinomu BRAF V600E pomocí metody Real Time PCR. Vzorek je poté vyšetřován pomocí rozsáhlého NGS panelu a bioinformaticky vyhodnocen pomocí virtuálního panelu rizikových genů. V krokové analýze je vzorek FNAB dále vyšetřen na přítomnost fúzních genů pomocí rozsáhlého RNA panelu. V případě, že je nalezena patogenní varianta suspektní ze zárodečné formy (např. u genů RET, PTEN, TP53, DICER1 s vyšší alelickou frekvencí varianty), je po konzultaci s klinickým genetikem vyšetřena periferní krev. V případě, že se potvrdí zárodečná forma varianty, je pacientovi nabídnuto genetické poradenství a případné vyšetření příbuzných pacienta pro vyloučení, nebo potvrzení hereditárních nádorových syndromů. V rámci výzkumu se snažíme validovat i epigenetické markery (změny exprese miRNA a metylaci DNA), které by přispěly nejen k lepšímu rozlišení benigních a maligních uzlů, ale i indolentních forem onemocnění od agresivních nádorů. Molekulární diagnostika nádorů štítné žlázy má v Endokrinologickém ústavu dlouholetou tradici, laboratoř je akreditovaná, disponuje nejnovějšími technologiemi a vysoce erudovaným personálem.

Prognostický a terapeutický význam molekulárních markerů

Stratifikace rizika

Molekulární profil nádoru doplňuje tradiční histopatologické faktory (velikost, extratyreoidální šíření, metastázy aj.). Jak bylo řečeno, molekulární markery nepochybně hrají významnou roli při celkovém hodnocení rizika nádoru, na což poukazují i recentní guidelines [6, 8], nicméně pohledy na stratifikaci molekulárního rizika se mění s přibývajícími studiemi a s trendem deeskalace léčby.

BRAF V600E

Nejvíce je to patrné u mutace BRAF V600E, u níž probíhají téměř vášnivé diskuze o využitelnosti tohoto markeru ke stratifikaci rizika PTC. Roli BRAF V600E u karcinomů štítné žlázy s důrazem na její diskutovanou prognostickou hodnotu, významnou molekulární heterogenitu a terapeutické možnosti, které cílí právě na tuto variantu, hodnotí zcela recentní přehledový článek [25]. BRAF mutace V600E, nejčastější genetická změna u PTC (40–45 %) [26], vzniká bodovou mutací, která vede k záměně aminokyselin valinu za glutamát v kodonu 600. Mutace způsobí aktivaci serin threoninové kinázy BRAF a následnou stimulaci MAPK signální dráhy. Tato mutace je specifická pro PTC, případně pro agresivní karcinomy –⁠ nízce diferencovaný a anaplastický karcinom, které mohou vzniknout dediferenciací PTC. U benigních nádorů se tato změna nevyskytuje, proto je její nález ve FNAB spojen s téměř 100% rizikem malignity. Mutovaný protein ovlivňuje expresi dalších genů, mimo jiné snižuje expresi genu NIS, který kóduje transportér jodu do buňky. Mutace tak může způsobit horší odpověď na léčbu radiojodem. Tato mutace je v mnoha studiích spojena s agresivnějším chováním nádoru [25], např. častějšími metastázami do lymfatických uzlin a extratyrodiální invazí, a horší prognózou onemocnění, především středně zvýšenou recidivou a mortalitou. Horší prognóza je patrná dokonce i u BRAF pozitivních PTC < 1 cm a solitárních neinvazivních PTC, nízce rizikových karcinomů, u kterých je dle nejnovějších ATA guidelines doporučována pouze lobektomie [6, 27].

Ačkoli je tato mutace spojována s agresivnějším chováním nádoru, její využití jako nezávislého prognostického markeru zůstává kontroverzní. Je to s podivem, protože BRAF mutační status je kritickým biomarkerem, který informuje o prognóze a je určující pro léčebné strategie u různých jiných typů nádorů –⁠ zejména melanomu, kolorektálního karcinomu, rakoviny plic (NSCL –⁠ non-small cell lung cancer).

Největší a nejrobustnější mezinárodní multicentrické studie klinických projevů a prognostického významu mutace BRAF V600E u nádorů štítné žlázy (potvrzující vliv na recidivy, agresivitu low-risk papilárního mikrokarcinomu) publikovala skupina prof. Xinga z Johns Hopkins Hospital, na mnohých jsme participovali [28–33]. Tyto výsledky oponují někteří autoři, kteří jim vytýkají nedostatečnou průkaznost. Kritici tvrdí, že nízká absolutní míra recidivy neopravňuje ke změnám v léčbě [27, 34–36], a vyjadřují obavy, že rutinní testování BRAF by mohlo vést k nadměrné diagnostice, zbytečným tyreoidektomiím a zvýšeným nákladům na zdravotní péči bez jasných přínosů pro přežití. Opírají se o výsledky mnohdy daleko méně rozsáhlých studií a doporučují agresivitu mutace coby samostatného prediktivního faktoru dále ověřovat pomocí dalších, nejlépe prospektivních studií.

Mutace BRAF V600E také přispívá k refrakteritě na radioaktivní jod (RAI), ale ne všechny nádory s mutací BRAF se chovají stejně. Transkriptomická a genomická heterogenita –⁠ včetně rozdílů v hodnocení diferenciace štítné žlázy, genetických koalterací a miRNA profilech –⁠ moduluje chování nádorů nesoucích BRAF V600E a odpověď na léčbu [13, 37–39]. To může být také příčinou nekonzistentních výsledků studií. O tom, jak je situace složitá, svědčí práce českých autorů [40], kteří v roce 2024 publikovali první integrovanou studii hodnotící přítomnost mutace BRAF, úroveň exprese mRNA vybraných genů a vybraných miRNA, a to jak v primárním PTC, tak v párových metastázách do lymfatických uzlin (LNM). Autoři odhalili komplexní síť molekulárních interakcí mezi studovanými markery zapojenými do biogeneze a recidivy PTC, navíc byly zjištěny rozdílné profily mezi primárním PTC a párovými LNM.

TERT mutace

Mutace C228T a C250T v genu TERT se nacházejí v promotoru. TERT kóduje podjednotku telomerázové reverzní transkriptázy, která udržuje délku telomer na chromozomech. Zkracování telomer je přirozený proces stárnutí buňky, a pokud je TERT protein v buňce abnormálně aktivní, telomery se prodlužují a to poskytuje buňce určitou „nesmrtelnost“. Mutace v promotoru způsobí vznik vazebných míst pro transkripční faktory, které expresi genu TERT spouštějí. Mutace TERT jsou spojeny s horší prognózou onemocnění, především vyšším rizikem recidiv, vzdálených metastáz a mortalitou [41, 42]. Vyskytují se až na vzácné výjimky pouze u maligních nádorů štítné žlázy, a tak jejich detekce ve FNAB znamená téměř 100% riziko malignity. V několika málo případech byly tyto mutace popsány u pacientů s původně benigním onemocněním (folikulárním adenomem), případně folikulárních tumorech nejistého maligního potenciálu, u kterých se ale po několika letech vyvinuly vzdálené metastázy FTC.

Bylo zjištěno, že se mohou mutace TERT a BRAF (případně méně často TERT a RAS) vyskytovat současně, což je spojeno s vyšším rizikem agresivního chování nádoru a horší prognózou onemocnění, především vyšší recidivou a mortalitou než samostatný výskyt těchto mutací [43]. Je to způsobeno pravděpodobně synergickým efektem těchto genů, kdy MAPK kinázová signální dráha aktivovaná některým z mutovaných genů (BRAF, RAS, RET/PTC) přímo způsobuje zvýšení exprese transkripčních faktorů, které se vážou na nově vzniklé mutované místo v promotoru TERT genu.

RAS mutace

Mutace genů RAS jsou druhou nejčastější genetickou změnou u nádorů štítné žlázy a zahrnují rodinu tří vysoce homologních izoforem –⁠ HRAS, KRAS a NRAS gen. Mutace se vyskytují ve 12., 13. nebo 61. kodonu 2. a 3. exonu a způsobují stabilizaci aktivní formy proteinu, a tím i stimulaci signálních drah. Tyto mutace se nacházejí u třetiny lidských nádorů a u štítné žlázy jsou detekovány ve všech typech nádorů, u 30–45 % FTC a 30–45 % folikulární varianty PTC, 20–40 % nízce diferencovaných a 10–20 % anaplastických karcinomů, ale také u 20–25 % benigních folikulárních adenomů či sporadických RET-negativních medulárních karcinomů [44]. Poměrně častou změnou jsou RAS mutace i u nově zavedené diagnostické jednotky NIFTP (cca 40 %) [45], která se považuje za neinvazivní nádor s extrémně nízkým rizikem malignity, ovšem předpokládá se, že se z nich mohou vyvinout invazivní folikulární varianty PTC. Nález RAS mutace u benigního nádoru je považován za predisponující faktor, který může vést k maligní transformaci adenomu na folikulární karcinom. Tomu může nasvědčovat i fakt, že mikrokarcinomy FTC nejsou příliš běžné, na rozdíl od mikrokarcinomů PTC, a FTC se tak mohou vyvíjet růstem a transformací z původních FTA, které rostou a transformují [46]. Na druhou stranu se předpokládá, že samotné RAS mutace nejsou schopné transformovat buňky z benigních do maligních a je zapotřebí dalších, zatím neznámých faktorů. Proto klinický význam RAS mutací u FNAB zůstává nejasný. Z toho důvodu jsou RAS mutace spojeny s velmi variabilním PPV v různých studiích, 0–100 % v Bethesda III, 28–100 % v Bethesda IV a 0–100 % v Bethesda V, ne všechny ovšem testovaly všechny mutace ve všech RAS genech a používaly různé metodiky stanovení [46]. Některé publikace uvádí PPV pro jednotlivé RAS geny s nejvyšším rizikem malignity pro HRAS mutace: 92 %, 74 % pro NRAS mutace a 64 % pro KRAS mutace [47]. Ovšem je třeba počítat s tím, že studie provedené před rokem 2017 pravděpodobně zahrnovaly nově zavedenou diagnostickou jednotku NIFTP mezi maligní FV PTC. Riziko malignity se v jednotlivých Bethesda kategoriích sníží, pokud NIFTP nejsou počítány mezi malignity, proto i PPV bez NIFTP bude ve skutečnosti nižší. Námi nedávno vyhodnocené PPV pro jednotlivé RAS geny byly následující: NRAS 35 % pro maligní nádory (51 % včetně nízkorizikových neoplazií), HRAS 42 % (53 %), KRAS 70 % (75 %).

Přestože se NIFTP cytologicky liší od PTC, nelze jej cytologicky zcela rozlišit od FV PTC, pro definitivní diagnózu je potřeba histologické ověření. Vzhledem k tomu, že NIFTP nejčastěji spadá do nejistých cytologických kategorií, ale neřadí se již mezi malignity, dochází v těchto kategoriích i k největšímu poklesu ROM [48, 49]. Bohužel ani analýza genetických změn zatím nedokáže NIFTP kvůli přítomnosti nespecifických mutací přesně diagnostikovat, pomoci by mohla analýza exprese miRNA.

Mnohočetné mutace

Společný výskyt mutací TERT a BRAF, případně RAS a mutací v genech TP53, PIK3CA nebo AKT1 společně s BRAF nebo RAS mutacemi identifikuje skupinu pacientů s nejméně příznivou prognózou [12, 43].

Fúzní geny

S rozvojem molekulárně genetických technik je možné mnohem snadněji vyšetřovat fúzní geny, kdy je třeba vyizolovanou RNA převést na cDNA a tu podrobit další analýze. Ukázalo se, že fúzní geny jsou příčinou DTC daleko častěji, než se původně předpokládalo. Zejména u dětských pacientů a mladistvých představují hlavní somatické driver mutace, v naší kohortě u 56 % [50, 51]. U dospělých pacientů jsme je detekovali u 11 % odoperovaných tkání PTC.

Fúzní geny zahrnující gen RET patří u karcinomů štítné žlázy k nejčastějším fúzním genům. Kromě nejčastějších forem CCDC6:: RET (zvané též RET/PTC1) a NCOA4:: RET (zvané též RET/PTC3) se vyskytují i vzácnější typy. V našem souboru jsme detekovali celkem 20 různých typů RET fúzních genů, z nichž tři typy (FBXO41:: RET, SSBP2:: RET a ZMYM2:: RET) nebyly v té době v literatuře ještě popsány. RET fúzní geny byly analyzovány u rozsáhlého souboru různých typů benigních i maligních nádorů štítné žlázy a byly detekovány pouze u pacientů s PTC, a to u 113 jedinců, což představovalo největší soubor pacientů s RET fúzními geny na světě. U takto jedinečného souboru jsme provedli klinicko-genetickou korelaci dat, zhodnotili dlouhodobé sledování pacientů (medián 75 měsíců) s PTC pozitivním na tuto patogenní variantu a porovnali soubory pozitivní na RET a NTRK fúzní gen [52]. Zjistili jsme, že RET fúzní geny jsou asociované s agresivním chováním nádoru, včetně vysoké četnosti metastáz do lymfatických uzlin (75 %) i metastáz distálních (19 %). Tato četnost byla signifikantně vyšší u pacientů s RET fúzním genem než u pacientů s NTRK fúzním genem, a to včetně PTC < 1 cm, u kterých byly lokální metastázy přítomny u 9 % pacientů s NTRK a 25 % pacientů s RET fúzními geny. Recidiva onemocnění byla zjištěna vzácně a jen u dospělých pacientů, refrakterní karcinom byl zjištěn u 8,7 % pacientů. Mortalita pacientů s RET fúzním genem byla navzdory invazivnímu onemocnění nízká (2,7 %). Určení RET fúzního genu má velký klinický význam, neboť pro progredující radiojod refrakterní karcinomy pozitivní na RET fúzní gen je dostupná léčba pomocí tyrosinkinázového inhibitoru selpercatinibu.

NTRK fúzní geny jsme detekovali celkem u 33 pacientů s PTC. Celkově jsme detekovali šest různých typů NTRK fúzí, nejčastějším typem bylo ETV6:: NTRK3. Agresivita karcinomů s NTRK fúzními geny je závislá na velikosti nádoru, zatímco u nádorů > 2 cm byly lymfatické metastázy nalezeny u 85,7 %, u menších nádorů jen u 36,8 %. U PTC < 1 cm byly NTRK fúzní geny spojeny s velmi dobrou prognózou. U většiny pacientů s NTRK fúzními geny byla popsána dobrá odpověď na léčbu radiojodem, ovšem v případě progredujících radiojod refrakterních karcinomů je možná léčba pomocí tyrosinkinázového inhibitoru larotrectinibu. V porovnání s častějšími NTRK3 fúzními geny byly karcinomy s NTRK1 fúzními geny agresivnější (častější multifokalita, angioinvaze, extratyroidální extenze, distální metastázy a méně příznivá prognóza) [53].

Fúzní gen BRAF je sice vzácný, ale důležitý genetický marker u PTC. Zachytili jsme celkem 27 typů BRAF fúzních genů, z nichž pouze pět bylo identifikováno ve více než jednom případě.

Fúze ALK jsou vzácnou genetickou alterací, byly popsány u různých typů karcinomů, zejména u PTC (většinou folikulární subtyp), nízce diferencovaného i anaplastického karcinomu. Opět jsou tyto fúze častější u pediatrické kohorty (5,3 %) než u dospělých (0,5 %). Na tuto alteraci existují cílená léčiva [54].

Fúzní gen PAX8:: PPARG je velice častou genetickou změnou u folikulárního karcinomu štítné žlázy, výjimečně byl také zachycen u folikulárního adenomu se silným pouzdrem a imunohistochemickým profilem charakteristickým pro karcinom, u něhož lze předpokládat preinvazivní stav folikulárního karcinomu [55].

PAX8:: GLIS3, vzácněji PAX8:: GLIS1, jsou specifickými markery hyalinizujícího trabekulárního tumoru (HTT) [56]. HTT je vzácný tumor s extrémně nízkou malignitou, který se dle WHO klasifikace z roku 2022 řadí k nízkorizikovým neoplaziím. Jeho cytologická diagnostika ve vzorcích FNAB může být problematická, protože sdílí některé morfologické rysy s jinými malignitami. Většina těchto případů je tak zařazena do cytologických kategorií Bethesda V a VI a pacienti zbytečně podstupují TTE. Jedná se přitom o tumor s velmi dobrou prognózou, u kterého při správné diagnóze stačí pouze lobektomie. Z toho důvodu je zavedení fúzního genu PAX8:: GLIS do analýzy FNAB i přes jeho vzácnost velmi důležité.

RET mutace

Mutace RET genu zodpovídá za vznik medulárního karcinomu štítné žlázy (MTC), zde se ale na rozdíl od fúzních forem RET/PTC vyskytují především bodové mutace způsobující záměnu aminokyselin. Mutace v RET protoonkogenu zodpovídají za polovinu sporadických a naprostou většinu familiárních forem MTC. Nejčastější mutací u sporadického MTC je mutace v kodonu 918, záměna methininu za threonin (M918T), která je zároveň nejagresivnější mutací, v zárodečné formě odpovídá za vznik syndromu MEN2B. PPV je pro záchyt mutace RET 100 %. Mutace genu RET jsou cílem pro nádorovou léčbu [57].

Kromě uvedených genů nabývají na významu i další geny, jako např. gen DICER1, jehož zárodečné mutace jsou příčinou DICER1 syndromu. DICER1 syndrom je dědičná predispozice k různým benigním i maligním nádorům včetně štítné žlázy. Somatické mutace jsou spojeny spíše s indolentním průběhem [58]. Význam vzácnějších variant ve stratifikaci rizika uzlů štítné žlázy je třeba ještě ověřit.

Stratifikace patogenních variant u FNAB na základě našich současných výsledků

Naše předkládané výsledky se opírají o vyšetření 2 175 FNAB, z nichž u 696 pacientů máme informaci o operaci a výsledku histologického vyšetření. Zatím jsme schopni s téměř 100% pravděpodobností určit malignitu u některých mutací, jako je BRAF V600E, TERT a většina fúzních genů (např. s RET, NTRK, ALK) [59–63]. Tyto mutace tak lze nazývat maligními a u nich je třeba zvážit TTE. I když je podle současných trendů samostatná mutace BRAF V600E nedostatečná pro stratifikaci rizika a doporučuje se po zhodnocení všech klinicko-patologických ukazatelů spíše lobektomie, případně využití miniinvazivních technik, u malých nádorů pouze sledování [6, 8], naše výsledky jasně prokazují její malignitu a doporučujeme obezřetnost při indikaci rozsahu operace, aby se minimalizovala nutnost totalizace chirurgického výkonu. Některé maligní mutace jsou spojeny s agresivnějším chováním nádoru a horší prognózou a je možná i cílená terapie [54].

Mezi mutace se středním rizikem malignity patří mutace v RAS genech, další genetické změny v BRAF genu, jako je K601E, a některé fúzní geny, např. PAX8:: GLIS, který je specifickým markerem pro nízkorizikovou neoplazii –⁠ hyalinizující trabekulární tumor (HTT). U těchto genetických změn se doporučuje většinou lobektomie, vliv na prognózu je zatím nejistý [6–9].

Pokud nenalezneme žádnou mutaci, nemůžeme s jistotou potvrdit, že se jedná o benigní uzel, ale pravděpodobnost malignity je výrazně snížená. V rámci výzkumu se snažíme najít další vhodné prediktivní markery, včetně epigenetických změn, které by pomohly ještě lépe stratifikovat riziko malignity u uzlů štítné žlázy.

Limity a kontroverze molekulární diagnostiky

Stejně jako jiná vyšetření uzlů štítné žlázy (sonografie, cytologie) ani genetické vyšetření zatím není schopné u části uzlů s určitostí říci, zda se jedná o benigní, nebo maligní uzel.

Navzdory nespornému přínosu má molekulární diagnostika i svá omezení:

• nedokáže zcela rozlišit folikulární adenom a folikulární karcinom bez histologického posouzení invaze ani diagnostikovat nízkorizikové neoplazie (např. NIFTP), jejichž genetické změny nejsou specifické (výjimkou je HTT);
• výsledky je nutné interpretovat v klinicko-patologickém kontextu;
• dostupnost a cena testů se výrazně liší mezi regiony, proto i současná mezinárodní guidelines doporučují molekulární testování, „pokud je dostupné“ [8, 17].

Budoucí perspektivy

V posledních letech jsme svědky neuvěřitelného rozvoje molekulárně genetických technik, vyšetření se zlevňují a budou čím dál dostupnější.

Budoucnost molekulární diagnostiky v patologii štítné žlázy směřuje k:

• širší integraci multiomických přístupů (DNA, RNA, mikroRNA, epigenetika) [64];
• využití umělé inteligence pro interpretaci komplexních dat [65];
• rozvoji tekuté biopsie a cirkulujících nádorových markerů, včetně extracelulárních vezikulů obsahujících RNA pocházející z nádorů [66], může v budoucnu doplnit či částečně nahradit invazivní diagnostické metody [67];
• standardizaci testovacích algoritmů napříč zdravotnickými systémy [68].

Závěr

Molekulární diagnostika se stala klíčovým nástrojem v moderní diagnostice a terapii nádorů štítné žlázy. Představuje důležitý doplněk tradiční sonografie, cytologie a histologie. Umožňuje efektivnější stratifikaci rizika u indeterminovaných lézí (zejména Bethesda III a IV) a přispívá k personalizaci léčby na základě genetického a molekulárního profilu tumoru. Její role v klinické praxi roste, což umožňuje zejména obrovský technologický rozvoj molekulárně genetických technik a rapidně se snižující náklady na komplexní vyšetření. Molekulární diagnostika nádorů štítné žlázy by se měla stát integrální součástí multidisciplinárního rozhodování. V České republice máme k dispozici unikátní vyšetřovací schéma, které umožňuje individualizovaný přístup při rozhodování o rozsahu operace a následné terapii tak, aby pacienti nebyli zbytečně podrobeni příliš radikální léčbě (overtreatment), ale zároveň aby byli včas podchyceni a adekvátně zaléčeni pacienti s vysokým rizikem malignity.

Prohlášení o střetu zájmů

Autorka práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou ani jinou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů.

 

Poděkování

Rozsáhlý soubor aspiračních biopsií štítné žlázy by nevznikl bez dlouholeté spolupráce s mnoha endokrinology, otorinolaryngology, chirurgy a patology, jimž bychom rádi velmi poděkovali. Děkujeme i všem pacientům, kteří souhlasí s výzkumným využitím svých vzorků. Bez nich by nebylo možno dosáhnout pokroku v diagnostice a léčbě nádorů štítné žlázy.

 

Grantová podpora

Práce byla podpořena Ministerstvem zdravotnictví ČR, projektem AZV CR NU21-01-00448 a RVO (Endokrinologický ústav –⁠ EÚ, 00023761).