#PAGE_PARAMS# #ADS_HEAD_SCRIPTS# #MICRODATA#

Molekulární určení genotypu izolátů Streptococcus agalactiae s netypovatelným sérotypem, Česká republika, 2008–2020


Molecular genotyping of Streptococcus agalactiae isolates with non-typeable serotype, Czech Republic, 2008–2020

The NRL for Streptococcal Infections performed serotyping of 1038 isolates of Streptococcus agalactiae from 972 patients by the latex agglutination method in 2008–2020.

Forty-three isolates (4.4%) whose serotyping failed were classified as non-typeable. The aim of the present study was to determine the genotype of these non-typeable isolates using multiplex polymerase chain reaction (mPCR). Genotyping was successful in the entire set of 43 non-typeable isolates. The most common genotype was V (41.9%), followed by Ia (20.9%). The isolates serotyped by latex agglutination were predominantly assigned to serotype III (29.2%) and V (26.2%). Complete data were obtained on the prevalence of S. agalactiae serotypes/genotypes in the Czech Republic in 2008–2020. Monitoring the serotype and genotype distribution of the pathogen is a prerequisite for the introduction of a potential vaccine against S. agalactiae into clinical practice.

Keywords:

Streptococcus agalactiae – genotype – serotype


Autoři: S. Vohrnová 1,2 ;  J. Kozáková 1
Působiště autorů: Národní referenční laboratoř pro streptokokové nákazy, Oddělení bakteriálních vzdušných nákaz, Centrum epidemiologie, a mikrobiologie, Státní zdravotní ústav, Praha 1;  3. lékařská fakulta Univerzity Karlovy, Praha 2
Vyšlo v časopise: Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 71, 2022, č. 4, s. 203-207
Kategorie: Krátké sdělení

Souhrn

V NRL pro streptokokové nákazy byl v letech 2008–2020 metodou latexové aglutinace určován sérotyp u 1 038 vzorků Streptococcus agalactiae od 972 pacientů. U 43 izolátů (4,4 %) se určení sérotypu nepodařilo a byly označeny jako netypovatelné. Cílem této práce bylo u těchto netypovatelných izolátů určit genotyp metodou multiplexové polymerázové řetězové reakce (mPCR). Genotyp se podařilo určit u celého souboru 43 netypovatelných izolátů. Nejčastěji byl zjištěn genotyp V (41,9 %), následován genotypem Ia (20,9 %). U izolátů s latexaglutinací určeným sérotypem převažoval sérotyp III (29,2 %) a sérotyp V byl z hlediska výskytu na 2. místě (26,2 %). Byla získána kompletní data o výskytu sérotypů/genotypů S. agalactiae v České republice v letech 2008–2020. Monitorování výskytu sérotypů a genotypů je důležitou součástí zavádění případné vakcíny proti S. agalactiae do klinické praxe.

Klíčová slova:

Streptococcus agalactiae – genotyp – sérotyp

ÚVOD

Streptococcus agalactiae (streptokok skupiny B, Group B Strep, GBS) je grampozitivní, kataláza negativní, fakultativně anaerobní opouzdřený kok řadící se do řetízků, vytvářející na krevním agaru beta-hemolýzu, která je obvykle méně výrazná než u Streptococcus pyogenes.

Na povrchu bakterie se nachází skupinově specifický sacharidový antigen, řadící S. agalactiae do skupiny B v systému séroskupin streptokoků podle Lancefieldové [1]. Pouzdro obklopující S. agalactiae je tvořeno polysacharidy, které jsou typově specifické, na základě jejich složení se určuje 10 sérotypů –⁠ Ia, Ib, II až IX [2]. S. agalactiae, u kterých nelze určit sérotyp, se nazývají netypovatelné (nontypeable, NT). Polysacharidové pouzdro S. agalactiae zprostředkovává bakterii ochranu před navázáním komplementu, brání opsonizaci a fagocytóze. Kapsulární polysacharidy tak představují nejvýznamnější faktor virulence S. agalactiae a jsou využívány při navrhování vakcín proti tomuto agens [3]. Polysacharidy pouzdra jsou tvořeny opakujícími se strukturami monosacharidů glukózy, galaktózy, kyseliny N-acetylneuraminové a N-acetylglukosaminu, jejichž pořadím je určen sérotyp [4]. U všech sérotypů je polysacharidový řetězec ukončen kyselinou N-acetylneuraminovou (Neu5Ac, kyselina sialová), která zprostředkovává maskování S. agalactiae za humánní buňky, které mají na svém povrchu též vázanou kyselinu N-acetylneuraminovou. Terminální kyselina N-acetylneuraminová dále umožňuje vazbu bakterie na Sia receptory (tzv. Siglecs –⁠ Sialic acid-binding immunoglobulin -⁠ type lectins) buněk imunitního systému, a tím tlumí imunitní reakci organismu [5]. Genetický podklad tvorby pouzdra S. agalactiae je dán capsule polysaccharide synthesis (cps) operonem. V cps operonu se nachází geny kódující proteiny účastnící se regulačních procesů bakterie, syntézy bakteriálního pouzdra a syntézy kyseliny sialové [6].

Současným standardem v určování sérotypu S. agalactiae je latexaglutinační test. Izolát s netypovatelným sérotypem neaglutinuje s žádným testovacím sérem, případně reaguje pozitivně s více séry. Příčinou netypovatelnosti izolátu je nízká či žádná exprese kapsulárního polysacharidu, která je způsobena alterací či inaktivací tvorby pouzdra různými typy mutací převážně v genech cps [7]. Nejčastější změnou způsobující ztrátu pouzdra je jednobodová mutace, vytvářející v sekvenci nukleotidů cps genu předčasný stop kodon. Dalším důvodem netypovatelnosti izolátu může být výskyt kapsulární strukturální varianty, která nereaguje s žádným nyní dostupným typově specifickým sérem [7, 8].

Pomocí molekulárně genetických metod lze identifikovat části sekvencí genů cps tvořících pouzdro a na základě toho poté určit genotyp. Stejně jako u sérotypů je rozlišováno 10 genotypů –⁠ Ia, Ib, II až IX.

Do Národní referenční laboratoře pro streptokokové nákazy (NRL/STR) jsou doručovány izoláty S. agalactiae získané od pacientů se symptomatickým infekčním onemocněním včetně infikovaných kožních defektů, abscesů, sepsí a novorozeneckých sepsí a meningitid a též izoláty od novorozenců s prokázaným nosičstvím S. agalactiae. V NRL/STR je provedeno potvrzení identifikace S. agalactiae a určení sérotypu latexaglutinační reakcí s kapsulárním antigenem. Pokud se takto nepodaří určit sérotyp, jedná se o izolát s pravděpodobně netypovatelným sérotypem a v rámci dalšího dourčení se provádí molekulárně genetické vyšetření genotypu.

MATERIÁL A METODIKA

V této studii jsme se zaměřili na izoláty S. agalactiae, které byly do NRL/STR doručeny v letech 2008–2020. Jednalo se o 1 038 izolátů od 972 pacientů. V několika případech bylo od jednoho pacienta vyšetřeno současně několik vzorků. Tyto duplicitní či triplicitní vzorky byly testovány se shodným výsledným sérotypem, pouze v jednom případě se sérotypy určené u jednoho pacienta lišily. V dalším zpracování dat se vycházelo z dat bez duplicitních vzorků se stejným sérotypem. Izoláty byly získány z infekčních onemocnění i z nosičství.

Z 972 izolátů se u 43 (4,4 %) nepodařilo určit sérotyp latexaglutinačním testem a byly označeny jako netypovatelné. Většina netypovatelných kmenů nereagovala s žádným latexaglutinačním sérem, ve dvou případech kmen reagoval s více séry.

Ze 43 izolátů s netypovatelným sérotypem bylo 29 získáno od žen a 14 od mužů.

V souboru 43 izolátů bylo 12 prokázáno u případů symptomatického infekčního onemocnění. Jednalo se o 6 pacientek ženského pohlaví a 6 pacientů mužského pohlaví, věkové rozložení pacientů bylo 56–85 let, pouze v jednom případě se jednalo o 34letou pacientku po porodu. Z 12 případů symptomatického infekčního onemocnění se v 7 případech jednalo o invazivní onemocnění (invazivita infekce byla stanovena na základě zaslaného materiálu –⁠ jednalo se o bakteriální kulturu z žilní krve) a v 5 případech byl izolát získán ze stěru z kožního defektu, z abscesu a z moče, tedy z neinvazivních infekčních onemocnění.

Ze 43 netypovatelných izolátů se v 31 případech jednalo o nosičství, kdy 4 izoláty byly získány od gravidních žen ze stěrů z oblasti pochvy a 27 izolátů bylo získáno převážně z kožních stěrů od 26 novorozenců a od 1 kojence (8 mužského pohlaví a 19 ženského pohlaví).

U 43 izolátů s netypovatelným sérotypem bylo provedeno vyšetření genotypu pomocí metody multiplexové polymerázové řetězové reakce (mPCR).

Izoláty S. agalactiae byly kultivovány na krevním agaru (Oxoid) přes noc při 35–37 °C v normální atmosféře. Dlouhodobě jsou kmeny skladovány v kryozkumavkách (ITEST KRYOBANKA B, ITEST plus s.r.o.) při -70 °C ve sbírce NRL/STR.

Potvrzení správné identifikace S. agalactiae bylo prováděno určením skupinově specifického antigenu pomocí komerční soupravy (Streptococcal grouping kit, Oxoid Diagnostic Reagents).

Sérotyp byl určován komerčním latexaglutinačním testem (ImmuLex Strep-B Kit, Statens Serum Institut, Dánsko).

Izolace DNA izolátů s netypovatelným sérotypem byla provedena pomocí komerční soupravy (QIAamp DNA mini kit, Qiagen).

Určení genotypu u netypovatelných S. agalactiae bylo prováděno metodou multiplexové PCR se zobrazením výsledných amplikonů pomocí gelové elektroforézy. Principem mPCR metody podle Imperi [9] je identifikace sekvencí typických pro jednotlivé genotypy Ia, Ib, II až IX v genech cpsG, cpsI, cpsJ a cpsN, dále se určuje přítomnost genu cpsL, který slouží jako vnitřní pozitivní kontrola správné identifikace S. agalactiae.

VÝSLEDKY A DISKUSE

U celého souboru 43 izolátů S. agalactiae s netypovatelným sérotypem se podařilo určit genotyp. Ve studovaném souboru byl molekulárně geneticky nejčastěji určen genotyp V (18 izolátů), následován genotypem Ia (9) a III (8), 3x byly určeny genotypy Ib a II a 1x genotypy IV a VI.

Ze 7 invazivních izolátů byl určen ve 4 případech genotyp V, 1x byly určeny genotypy Ia, Ib, a II. U izolátů z neinvazivních onemocnění byl 3x určen genotyp V a 1x genotypy Ia a III. Celkem byl genotyp V zjištěn u 7 z 12 izolátů z invazivních i neinvazivních infekčních onemocnění –⁠ tabulka 1.

Tab. 1. Izoláty S. agalactiae s netypovatelným sérotypem, Česká republika, 2008–2020
Table 1. S. agalactiae isolates with non-typeable serotype, Czech Republic, 2008–2020
Izoláty S. agalactiae s netypovatelným sérotypem, Česká republika, 2008–2020 <br> 
Table 1. S. agalactiae isolates with non-typeable serotype, Czech Republic, 2008–2020

NT – netypovatelný
m. – měsíce
r. – roky
NT – non-typeable
m. – months
r. – years

V souboru 31 netypovatelných izolátů S. agalactiae prokázaných z nosičství byl nejčastěji určen genotyp V (11 případů), genotyp Ia a III (po 7 případech), po 2 případech genotypy Ib a II a 1x byly určeny genotypy IV a VI.

U 929 izolátů s latexaglutinací určeným sérotypem doručených v letech 2008–2020 byl nejčastěji určen sérotyp III (284 izolátů), následován sérotypem V (255), Ia (125) a II (109), další sérotypy jsou již méně časté –⁠ graf 1.

Graf 1. Absolutní počty sérotypů S. agalactiae, absolutní počty genotypů S. agalactiae s netypovatelným sérotypem, ČR, 2008–2020
Figure 1. Absolute numbers of serotypes of S. agalactiae, absolute numbers of genotypes of S. agalactiae with non-typeable serotype, Czech Republic, 2008–2020
Absolutní počty sérotypů S. agalactiae, absolutní počty genotypů S. agalactiae s netypovatelným
sérotypem, ČR, 2008–2020 <br> 
Figure 1. Absolute numbers of serotypes of S. agalactiae, absolute numbers of genotypes of S. agalactiae
with non-typeable serotype, Czech Republic, 2008–2020
NT – netypovatelný izolát
NT – non-typeable serotype

Byly získány kompletní výsledky sérotypu/genotypu u všech izolátů S. agalactiae zaslaných do NRL/STR v letech 2008–2020.

Četnost jednotlivých sérotypů vs. genotypů se liší mezi izoláty určenými latexaglutinací a molekulárně geneticky, kdy latexaglutinací nejčastěji určeným sérotypem byl sérotyp III a molekulárně geneticky byl nejčastěji určen genotyp V, následován genotypem Ia. Izoláty s netypovatelným sérotypem a s genotypem V byly poměrově nejčetněji určeny i v dalších studiích [10], důvod tohoto zjištění není zcela jasný, možným vysvětlením je sklon některých linií izolátů S. agalactiae genotypu V ke genetické a antigenní diverzitě [8].

Molekulárně genetické testování izolátů s netypovatelným sérotypem nám zajišťuje stanovení genotypu. Pokud se nepodaří určit genotyp, nelze vyloučit, že by se mohlo jednat o izolát s novým kapsulárním typem.

Zjišťování četnosti jednotlivých sérotypů a monitorování počtu netypovatelných izolátů hraje roli při případném zavádění vakcíny proti S. agalactiae do klinické praxe. Ve vývoji jsou v současnosti polyvalentní vakcíny polysacharidové, které obsahují typově specifické polysacharidy konjugované na proteinový nosič. Dále je ve vývoji proteinová vakcína založená na tvorbě protilátek proti N-terminálním doménám membránových proteinů Rib, AlphaC a Alp 1-3. Proteiny Rib, AlphaC a Alp 1-3 jsou vázány na povrchu téměř všech izolátů S. agalactiae a jejich struktura je převážně homologní napříč izoláty.

Jak je známo ze zkušeností s multivalentními konjugovanými vakcínami proti Streptococcus pneumoniae, typově specifické vakcíny mohou vytvářet selekční tlak na populaci bakterií, což může vést ke zvýhodnění bakterií se sérotypy ve vakcíně neobsaženými a dále bakterií bez pouzderného antigenu. Při případném zavedení polyvalentní polysacharidové vakcíny proti S. agalactiae do klinické praxe tedy nelze vyloučit podobnou situaci tzv. sérotypového replacementu, který vidíme u Streptococcus pneumoniae. Též by mohlo dojít k četnějšímu výskytu S. agalactiae s netypovatelným sérotypem, jehož pouzdro je méně výrazně vytvořeno, či netvoří pouzdro vůbec, a tím by bakterie unikala pozornosti postvakcinačních protilátek.

V rámci prevence invazivních onemocnění vyvolaných S. agalactiae u novorozenců je v České republice doporučeno testovat všechny gravidní ženy na přítomnost S. agalactiae ve stěru z vaginální sliznice a z rekta v 35. až 37. týdnu těhotenství. V případě pozitivního záchytu se rodičce podává antibiotická profylaxe (intrapartum antibiotic prophylaxis, IAP). Profylaxe se zahajuje se začátkem porodní činnosti a pokračuje dále v pravidelných intervalech po dobu trvání porodu. Antibiotikem první volby je penicilin G či ampicilin intravenózní infuzí. Při alergii na penicilin jsou podávány cefalosporiny 1. generace, při anamnéze anafylaktické reakce po penicilinu je indikován klindamycin či vankomycin. IAP se podává i v případě nálezu S. agalactiae v moči gravidní ženy či v případě invazivního onemocnění vyvolaného S. agalactiae u dítěte z předchozí gravidity.

V České republice není zaveden program surveillance invazivních onemocnění vyvolaných S. agalactiae. Do NRL/STR jsou izoláty S. agalactiae z nosičství a invazivních i neinvazivních onemocnění zasílány na bázi dobrovolnosti. Zasílání izolátů do NRL/STR a jejich typizace je významná pro sledování výskytu sérotypů/genotypů v České republice. NRL/STR děkuje všem laboratořím, které izoláty S. agalactiae k typizaci zasílají, a zároveň apeluje na ostatní laboratoře, aby izoláty S. agalactiae především z invazivních onemocnění do NRL/STR zasílaly.

ZÁVĚR

V období 2008–2020 se vyskytlo 43 izolátů S. agalactiae s netypovatelným sérotypem, což představuje 4,4 % ze všech izolátů doručených do NRL/STR. U všech 43 netypovatelných izolátů byl molekulárně geneticky určen genotyp. Nejčastěji byl určen genotyp V (u 41,8 % netypovatelných izolátů), následován genotypem Ia (20,9 %). U izolátů s latexaglutinací určeným sérotypem převažuje sérotyp III (29,2 %) a sérotyp V je z hlediska výskytu na 2. místě (26,2 %).

Netypovatelné izoláty byly získány ze vzorků případů infekčního onemocnění u dospělých a z nosičství u gravidních žen a novorozenců, žádný netypovatelný izolát nebyl původcem infekčního onemocnění novorozence.

V případě zavádění polyvalentní polysacharidové vakcíny proti S. agalactiae do klinické praxe bude třeba zjistit, zda zaváděná vakcína nabízí pokrytí vyskytujících se sérotypů.

Podpořeno MZ ČR –⁠ RVO („Státní zdravotní ústav –⁠ SZU, 75010330“).

Do redakce došlo dne 13. 1. 2022.

Adresa pro korespondenci:
MUDr. Sandra Vohrnová
Oddělení bakteriálních vzdušných nákaz, CEM
Státní zdravotní ústav
Šrobárova 49/48
100 00 Praha 10
e-mail: sandra.vohrnova@szu.cz

Epidemiol Mikrobiol Imunol, 2022; 71(4): 203–207


Zdroje

1. Lancefield RC. A Serological Differentiation of Human and Other Groups of Hemolytic Streptococci. The Journal of experimental medicine, 1933;57(4):571–595. doi: 10.1084/jem.57.4.571. PMID: 19870148; PMCID: PMC2132252.

2. Slotved HC, Kong F, Lambertsen L, et al. Serotype IX, a Proposed New Streptococcus agalactiae Serotype. Journal of clinical mikrobiology, 2007;45(9):2929–2936. doi:10.1128/JCM.00117 -⁠ 07.

3. Doran KS, Nizet V. Molecular pathogenesis of neonatal group B streptococcal infection: no longer in its infancy. Molecular Microbiology, 2004;54(1):23–31. doi: 10.1111/j.1365 -⁠ 2958.2004.04266.x. PMID: 15458402.

4. Cieslewicz MJ, Chaffin D, Glusman G, et al. Structural and genetic diversity of group B streptococcus capsular polysaccharides. Infection and Immunity, 2005;73(5):3096–3103. doi:10.1128/ IAI.73.5.3096-3103.2005.

5. Marques MB, Kasper DL, Pangburn MK, et al. Prevention of C3 deposition by capsular polysaccharide is a virulence mechanism of type III group B streptococci. Infection and Immunity, 1992;60(10):3986–3993. doi: 10.1128/iai.60.10.3986-3993.1992. PMID: 1398910; PMCID: PMC257427.

6. Chaffin DO, Beres SB, Yim HH, et al. The serotype of type Ia and III group B streptococci is determined by the polymerase gene within the polycistronic capsule operon. Journal of Bacteriology, 2000;182(16):4466–4477. doi: 10.1128/JB.182.16.4466 -⁠ 4477.2000. PMID: 10913080; PMCID: PMC94618.

7. Rosini R, Campisi E, De Chiara M, et al. Genomic analysis reveals the molecular basis for capsule loss in the group B Streptococcus population. PloS one, 2015;10(5):e0125985. Published 2015 May 6. doi:10.1371/journal.pone.0125985.

8. Ramaswamy SV, Ferrieri P, Flores AE, et al. Molecular characterization of nontypeable group B streptococcus. Journal of clinical mikrobiology, 2006;44(7):2398–2403. doi:10.1128/JCM.02236 -⁠ 05.

9. Imperi M, Pataracchia M, Alfarone G, et al. A multiplex PCR assay for the direct identification of the capsular type (Ia to IX) of Streptococcus agalactiae. Journal of Microbiological Methods, 2010;80(2):212–214. doi: 10.1016/j.mimet.2009.11.010. Epub 2009 Dec 1. PMID: 19958797.

10. Slotved HC, Fuursted K, Kavalari ID, et al. Molecular Identification of Invasive Non-typeable Group B Streptococcus Isolates From Denmark (2015 to 2017). Frontiers in cellular and infection mikrobiology, 2021;11 : 571901. Published 2021 Mar 29. doi:10.3389/ fcimb.2021.571901.

Štítky
Hygiena a epidemiologie Infekční lékařství Mikrobiologie

Článek vyšel v časopise

Epidemiologie, mikrobiologie, imunologie

Číslo 4

2022 Číslo 4
Nejčtenější tento týden
Nejčtenější v tomto čísle
Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

BONE ACADEMY 2025
nový kurz
Autoři: prof. MUDr. Pavel Horák, CSc., doc. MUDr. Ludmila Brunerová, Ph.D, doc. MUDr. Václav Vyskočil, Ph.D., prim. MUDr. Richard Pikner, Ph.D., MUDr. Olga Růžičková, MUDr. Jan Rosa, prof. MUDr. Vladimír Palička, CSc., Dr.h.c.

Cesta pacienta nejen s SMA do nervosvalového centra
Autoři: MUDr. Jana Junkerová, MUDr. Lenka Juříková

Svět praktické medicíny 2/2025 (znalostní test z časopisu)

Eozinofilní zánět a remodelace
Autoři: MUDr. Lucie Heribanová

Hypertrofická kardiomyopatie: Moderní přístupy v diagnostice a léčbě
Autoři: doc. MUDr. David Zemánek, Ph.D., MUDr. Anna Chaloupka, Ph.D.

Všechny kurzy
Kurzy Podcasty Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu, se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se

#ADS_BOTTOM_SCRIPTS#