Význam stanovení proteinu p16 v managementu prekanceróz děložního hrdla


Evaluation of p16 protein in the managementof cervical dysplasia

Objective:
Protein p16 as an important cell-cycle inhibitor is a promising diagnostic and prognostic factor of cervical dysplasia. In our study we evaluate the impact of p16 protein evaluation on management of cervical dysplasia.

Design:
Retrospective study.

Setting:
Department of Obstetrics and Gynecology, Medical Faculty Pilsen, Charles University Prague.

Methods:
A retrospective study was performed on 122 consecutive patients with colposcopically-directed cervical biopsy (CDB) with following excisional procedure (LEEP or cold-knife conisation). P16 expression in the specimen from CDB was independently evaluated using immunohistochemistry in all patients. Relation among CDB histology, p16 expression, and final histology from excisional procedure was analysed.

Results:
In our series, we identified 44 CIN 1 and 61 CIN 2/3 in CDB specimens. In the CIN 1 group, 15 cases (34.1%) were p16 negative and 29 (65.9%) cases were p16 positive. In CIN 1 p16 negative group, only 2 of 15 patients (13.3%) had CIN 2/3 in the final histology comparing to 19 of 29 patients (65.5%) in CIN 1 p16 positive group (statistically signifiant,p < 0,05; Wilcoxon test). In CIN 2/3 group, 60 (98.4%) specimen were p16 positive and 57 patients (93.4%) had also CIN 2/3 in the final histology.

Conclusion:
In our study of 122 patients with CDB we found that in group of CIN 1 patients, p16 evaluation had significant predictive value for final histology. In the group of patients with CIN 2/3, 98% specimens were p16 positive and therefore p16 evaluation had no prognostic impact on final histology. Prospective study is needed to confirm this data.

Keywords:
protein p16 – colposcopically-directed cervical biopsy – CDB – immunohistochemistry


Autoři: M. Pešek 1;  I. Kinkorová 2;  R. Ferko 3;  A. Ürgeová 1;  J. Bouda 1
Působiště autorů: Gynekologicko-porodnická klinika LF UK a FN, Plzeň, přednosta doc. MUDr. Z. Novotný, CSc. 1;  Bioptická laboratoř Plzeň, s. r. o. 2;  Šiklův patologicko-anatomický ústav FN, Plzeň, přednosta prof. MUDr. M. Michal 3
Vyšlo v časopise: Čes. Gynek.2013, 78, č. 2 s. 195-199

Souhrn

Cíl studie:
Protein p16 je důležitým inhibitorem buněčného cyklu a slibným diagnostickým a prognostickým faktorem u prekanceróz děložního hrdla. Cílem studie je zhodnocení významu imunohistochemického stanovení proteinu p16 v managementu prekanceróz děložního hrdla.

Typ studie:
Retrospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Lékařská fakulta Plzeň, Univerzita Karlova Praha, Gynekologicko-porodnická klinika FN Plzeň.

Metodika:
Do studie bylo zařazeno 122 pacientek s kolposkopicky cílenou biopsií (CDB) a následným excizním výkonem na děložním hrdle (LEEP, konizace). U všech pacientek byla nezávisle stanovena exprese p16 pomocí imunohistochemie (IHC). Byla provedena analýza mezi výsledkem histologie z CDB, expresí p16 v CDB a finální histologií z excizního výkonu.

Výsledky:
Ve vzorcích z CDB byla u 44 pacientek diagnostikována CIN 1, u 61 pacientek pak CIN 2/3. Ve skupině s CIN 1 bylo 15 vzorků (34,1 %) p16 negativní, 29 vzorků (65,9 %) p16 pozitivní. Ve skupině CIN 1/p16 negativní byla pouze ve dvou vzorcích (13,3 %) stanovena CIN 2/3 v definitivní histologii, zatímco u CIN 1/p16 pozitivních vzorků byla CIN 2/3 v definitivní histologii stanovena v 19 případech (tj. 65,5 %) (statisticky významné, p < 0,05; Wilcoxonův test). V 60 případech CIN 2/3 z CDB bylo (98,4 %) p16 pozitivních a v 57 případech (93,4 %) byla potvrzena diagnóza CIN 2/3 v definitivní histologii.

Závěr:
Zjistili jsme, že v souboru 122 pacientek s CDB mělo ve skupině s CIN 1 stanovení p16 lepší prediktivní hodnotu pro definitivní histologii než vlastní histologický výsledek z CDB. Ve skupině CIN 2/3 bylo 98,4% p16 pozitivních, stanovení p16 v této skupině tak nemá prognostický vliv na finální histologii. K potvrzení těchto dat je nutná prospektivní studie.

Klíčová slova:
protein p16 – kolposkopicky cílená biopsie – CDB – imunohistochemie

ÚVOD

Kontrola buněčného cyklu

Buněčné dělení je ovlivňováno a řízeno kontrolními systémy, které koordinují jednotlivé fáze buněčného cyklu.

V buněčném cyklu je proliferační aktivita kontrolována inhibitory, které mohou zastavit cyklus v kontrolních bodech. První kontrolní bod buněčného cyklu je v G1 fázi před vstupem buňky do S fáze. Druhý kontrolní bod je v G2 fázi před zahájením mitózy (M).

Regulace buněčného cyklu je realizována specifickými proteiny. Jde o tzv. cyklin-dependentní kinázy (cdk) a cykliny. Cykliny mohou vytvářet s cdk funkční komplexy. Tyto komplexy jsou schopné fosforylovat příslušné proteiny, což je nezbytné pro progresi buněčného cyklu. V průběhu G1 fáze buněčného cyklu se naváže inaktivní cdk s cyklinem D a vytvoří aktivní komplex cyklin D/cdk, který fosforyluje protein pRb (protein Rb je produktem retinoblastomového genu a je klasickým antionkogenem).

Inaktivace (fosforylace) pRb umožní přechod buněk z G1 fáze do S fáze buněčného cyklu. A naopak – protein pRb v nefosforylované (aktivní) formě ve vazbě s dalším proteinem E2F působí jako supresor buněčného dělení (brání transkripci genů, jejichž produkty jsou potřebné pro průběh S fáze buněčného cyklu).

Účinkem komplexů cyklinu D/cdk4, 6 a cyklinu E/cdk2 dochází k fosforylaci proteinu pRb a transkripční faktor E2F je tímto uvolněn z komplexu s pRb. Volný transkripční faktor E2F aktivuje transkripci genů S fáze buněčného cyklu.

Inhibitory cdk inaktivují komplexy cyklin/cdk a fosforylace pRb je blokována. Mezi nejdůležitější patří p16 gen kódující inhibitor cyklin dependentních kináz 4 a 6 a nachází se na chromozomu 9p21. Tento antionkogen je inaktivován delecemi nebo mutacemi u mnoha lidských malignit [11].

Za fyziologických okolností protein p16 (produkt p16 genu) odbourává komplexy cyklin D/cdk 4, které inaktivují protein pRb fosforylací. Naopak aktivní forma proteinu pRb (tj. nefosforylovaná) inhibuje transkripci proteinu p16. To znamená, že systém pRb/p16 reguluje buněčný cyklus na přechodu z G1 do S fáze [2].

Změny v buněčném cyklu při infekci HPV

Po integraci papillomavirové DNA do genomu hostitelské buňky dochází k interakci virových onkoproteinů E6 a E7 vysoce rizikových HPV typů s produkty (proteiny) onkosupresorových genů – p53 a p105Rb, což následně vede k jejich funkční inaktivaci.

E7 uvolňuje transkripční faktor E2F z vazby na protein pRb a urychluje degradaci proteinu pRb a jemu příbuzných proteinů [9].

Již v roce 1994 byla zaznamenána tehdy nevysvětlitelně nízká hladina komplexů cyklin D/cdk4 v buňkách s mutovaným nebo viry inaktivovaným proteinem pRb [2]. Za důvod snížení hladiny komplexu cyklinu D/cdk4 byla později označena vysoká exprese inhibitoru cyklin dependentních kináz, proteinu p16 v buňkách s inaktivovaným proteinem pRb [10].

Snížení hladin komplexu cyklin D/cdk4 se týkalo zejména HPV transformovaného epitelu, včetně cervikálních dysplazií [8]. Nefunkční protein pRb v těchto lézích umožňuje nekontrolovatelnou proliferaci a není schopen inaktivovat transkripci proteinu p16. V cervikálních prekancerózách a nádorech vyvolaných HPV lze tedy prokázat zvýšenou expresi proteinu p16 [4]. Protein p16 je zodpovědný za snížení hladiny komplexů cyklin D/cdk4, ale funkčně se díky HPV inaktivaci proteinu pRb neuplatní.

Cílem studie je zhodnocení významu imunohistochemického stanovení proteinu p16 v managementu prekanceróz děložního hrdla. V pracích dosud publikovaných v literatuře [5, 6, 7] bylo popsáno, že stanovení p16 zpřesňuje diagnózu stanovovanou běžně ze vzorků barvených hematoxylinem-eozinem a pozitivita p16 může označovat léze s potenciálem progrese do prekancerózy vyššího stupně či invazivního karcinomu.

METODIKA

Do retrospektivní studie bylo zařazeno 122 pacientek s kolposkopicky cílenou biopsií (CDB) a následným excizním výkonem na děložním hrdle (LEEP, konizace). U všech pacientek byla nezávisle stanovena exprese p16 pomocí imunohistochemie (IHC). Byla provedena analýza mezi výsledkem histologie z CDB, expresí p16 v CDB a finální histologií z excizního výkonu.

Materiál z CDB byl fixován v 10% formolu; pro základní barvení hematoxylinem eozinem byly krájeny řezy silné 4 µm, pro imunohistochemické vyšetření s onkoproteinem p16 silné 2 µm.

Imunohistochemické vyšetření bylo prováděno elektronicky nastaveným protokolem v automatu BenchMark Ultra, Ventana/Roche. K vizualizaci reakce byl použit diaminobenzidin tetrahydrochlorid, k dobarvení jader metylenová modř. Použit byl CINtec Histology V-Kit od mtm laboratories AG. Všechna vyšetření měla provedenu vnitřní kontrolu.

Pro pozitivní reakci s p16 byla určující jaderná či jaderná/cytoplazmatická pozitivita; samotná cytoplazmatická pozitivita byla hodnocena jako p16 negativní.

Hodnocení výsledku reakce

Negativní – žádná pozitivita.

Ojediněle pozitivní – slabá pozitivita izolovaných buněk.

Fokálně pozitivní – pozitivita malých skupin buněk, typicky mimo bazální vrstvy epitelu.

Difuzně pozitivní – silná souvislá lineární pozitivita buněk, dále posuzovaná v rozsahu jednotlivých vrstev (třetin) výšky epitelu.

V rámci studie byla hodnocena jako pozitivní pouze difuzní pozitivita (kontinuální barvení bazálních nebo suprabazálních buněk) (obr. 1–6).

Normální cervikální epitel (HE – hematoxylin eozin)
Obr. 1. Normální cervikální epitel (HE – hematoxylin eozin)

Normální cervikální epitel p16 negativní
Obr. 2. Normální cervikální epitel p16 negativní

CIN 1 (HE)
Obr. 3. CIN 1 (HE)

PCIN1 – difuzní pozitivita spodní 1/3 cervikálního epitelu
Obr. 4. PCIN1 – difuzní pozitivita spodní 1/3 cervikálního epitelu

CIN 3 (HE)
Obr. 5. CIN 3 (HE)

CIN3 – difuzní pozitivita p16 v celé tloušťce cervikálního epitelu
Obr. 6. CIN3 – difuzní pozitivita p16 v celé tloušťce cervikálního epitelu

VÝSLEDKY

Výsledky histologie a imunohistochemického stanovení exprese p16 ve vzorcích z CDB a definitivní histologické výsledky z excizního výkonu jsou shrnuty v tabulce 1. Ve vzorcích z CDB byla u 44 pacientek diagnostikována CIN 1, u 61 pacientek pak CIN 2/3. Ve skupině s CIN 1 bylo 15 vzorků (34,1 %) p16 negativní, 29 vzorků (65,9 %) p16 pozitivní. Ve skupině CIN 1/p16 negativní byla pouze ve dvou vzorcích (13,3 %) stanovena CIN 2/3 v definitivní histologii, zatímco u CIN1/p16 pozitivních vzorků byla CIN 2/3 v definitivní histologii stanovena v 19 případech (tj. 65,5 %) (statisticky významné, p < 0,05; Wilcoxonův test). V 60 případech CIN 2/3 z CDB bylo (98,4 %) p16 pozitivních a v 57 případech (93,4 %) byla potvrzena diagnóza CIN 2/3 v definitivní histologii.

Tab. 1. Výsledky histologie a imunohistochemického stanovení exprese p16 ve vzorcích z CDB a definitivní histologické výsledky z excizního výkonu
Výsledky histologie a imunohistochemického stanovení exprese p16 ve vzorcích z CDB a definitivní histologické výsledky z excizního výkonu

DISKUSE A ZÁVĚR

Je známo, že většina karcinomů děložního hrdla vzniká z cervikální intraepiteliální neoplazie (CIN), ale jen malá část progreduje do invazivního karcinomu. CIN 1 často regreduje, ale asi v 10–15 % případů progreduje do CIN 2/3 [1]. Z těchto důvodů je důležité v managementu pacientek s onemocněním děložního hrdla rozpoznat CIN 1 se sklonem k progresi do vyšších forem CIN [3]. Prediktivní hladina klinických a histologických charakteristik v určení rizika progrese nebo regrese CIN 1 je velmi nízká [12].

Onkoprotein p16 je produktem tumor supresorového genu. Zvýšená produkce proteinu p 16 v buňce napadené HR HPV je reakcí na zvýšenou replikační aktivitu viru. P16 se ve zvýšené míře nachází ve většině high-grade (HG) lézí. Jde o slibný prognostický faktor (biomarker) pro prekancerózy a karcinom děložního hrdla. V kontrastu působí CIN 2/3 pozitivita p16 oproti CIN 1 p16 variabilitě (CIN 1 může být p16 pozitivní, či p16 negativní ). Důležitým faktem je, že pouze difuzní pozitivita (kontinuální barvení bazálních nebo suprabazálních buněk) patrně představuje rizikový faktor v přechodu do HG léze [5]. Stanovení p16 může mít jak význam diagnostický (rozlišení CIN 1 vs. CIN 2/3), tak prognostický, kdy pacientky s CIN1 p16 pozitivním výsledkem z CDB představují skupinu žen se zvýšeným rizikem vývoje CIN2+ [13]. P16 pozitivní CIN 1 jsou pravděpodobně léze v přechodu do CIN 2.

V našem retrospektivním souboru 122 pacientek s CDB a následným excizním výkonem na děložním hrdle jsme zjistili, že ve skupině s CIN 1 v CDB má stanovení p16 lepší prediktivní hodnotu pro definitivní histologii než vlastní histologický výsledek z CDB. Ve skupině CIN 2/3 bylo 98,4 % p16 pozitivních a stanovení p16 v této skupině tak nemá prognostický vliv na finální histologii. K přesné specifikaci zařazení stanovení p16 do diagnostických a léčebných guidelines u prekanceróz děložního hrdla je zapotřebí provedení prospektivních studií na větších souborech pacientek.

MUDr. Martin Pešek

Gynekologicko-porodnická klinika

Fakultní nemocnice

Alej Svobody 80

304 60 Plzeň


Zdroje

1. American College of Obstetricians and Gynecologists. ACOG practice bulletin no. 66. Management of abnormal cervical cytology and histology. Obstet Gynecol, 2005, 106, p. 645–664.

2. Bates, S., Parry, D., Bonneta, L., et al. Absence of cyclin D/cdk complexes in cells lacking functional retinoblastoma protein. Oncogene, 1994, 9, p. 1633–1640.

3. Del Pino, M., Garcia, S, Fusté, V., et al. Value od p16 as a marker of progression/regression in cervical intraepithelial neoplasia grade 1. Am J Obstet Gynecol, 2009, 201, p. 488.

4. Focchi, GR., Silva, ID., Nogueira-de-Souza, NC., et al. Immunohistochemical expression of p16(INK4A) in normal uterine cervix, nonneoplastic epithelial lesions, and low-grade squamous intraepithelial lesions. J Low Genit Tract Dis, 2007, 11, p. 98–104.

5. Galgano, MT., Kastle, PE., Kristen, A., et al. Using biomarkers as objective standards in the diagnosis of cervical biopsie. Am J Surg Pathol, 2010, 34, p. 1077–1087.

6. Klaes, R., Banner, A., Friedrich, T., et al. P16 INK4a immunohistochemistry improves interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia. Am J Surg Pathol, 2002, 26, p. 1389–1399.

7. Liang, J., Mittal, KR., Wei, JJ., et al. Utility of p16INK4a, CEA, Ki 67, P53 and ER/PR in the diferential diagnosis of benign, premalignant and malignant glandular lesions of the uterine cervix. Int J Gynecol Pathol, 2007, 26, p. 71–75.

8. Murény, N., Ring, M., Killalea, AG., et al. P16INK4a as a marker for cervical dyskaryosis: CIN and CGIN in cervical biopsies and ThinPrep smears. J Clin Pathol, 2003, 56, p. 56–63.

9. O´Neill, CJ., McCluggage, WG. P16 expression in the female genital tract and its value in diagnosis. Adv Anat Pathol, 2006, 13, p. 8–15.

10. Queiroz, C., Silva, TC., Alves, VA., et al. P16(INK4a) expression as a potential prognostic marker in cervical pre-neoplastic and neoplastic lesions. Pathol Res Pract, 2006, 202, p. 77–83.

11. Rejtar, A., Vojtěšek, B. Obecná patologie nádorového růstu. 1. ed. Praha: Grada Publishing, 2002, 106–128 s.

12. Schifmann, M., Khan, MJ., Salomon, D., et al. A study of the impact of adding HPV types to cervical cancer screening and triage test. J Natl Cancer Indy, 2005, 97, p. 147–150.

13. Wang, SS., Trunk, M., Schifmann, M., et al. Validation of p16INK4a as a marker of oncogenic human papillomavirus infection in cervical biopsies from a population-based cohort in Costa Rica. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2004, 13, p. 355–1360.

Štítky
Dětská gynekologie Gynekologie a porodnictví Reprodukční medicína

Článek vyšel v časopise

Česká gynekologie

Číslo 2

2013 Číslo 2

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Kurzy

Zvyšte si kvalifikaci online z pohodlí domova

Léčba bolesti v ordinaci praktického lékaře
nový kurz
Autoři: MUDr. PhDr. Zdeňka Nováková, Ph.D.

Revmatoidní artritida: včas a k cíli
Autoři: MUDr. Heřman Mann

Jistoty a nástrahy antikoagulační léčby aneb kardiolog - neurolog - farmakolog - nefrolog - právník diskutují
Autoři: doc. MUDr. Štěpán Havránek, Ph.D., prof. MUDr. Roman Herzig, Ph.D., doc. MUDr. Karel Urbánek, Ph.D., prim. MUDr. Jan Vachek, MUDr. et Mgr. Jolana Těšínová, Ph.D.

Léčba akutní pooperační bolesti
Autoři: doc. MUDr. Jiří Málek, CSc.

Nové antipsychotikum kariprazin v léčbě schizofrenie
Autoři: prof. MUDr. Cyril Höschl, DrSc., FRCPsych.

Všechny kurzy
Kurzy Doporučená témata Časopisy
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se