Úskalí cytologie extrahepatálních žlučových cest

Cytologické vyšetření žlučových cest je i pro zkušeného diagnostika mnohdy velmi těžkým úkolem. Ač v dostupné literatuře nacházíme detailní popisy buněčných morfologií u jednotlivých patologických lézí, v reálné praxi se velmi často potýkáme již s otázkou, zda se díváme na buňky benigní či maligní a seč nám síly stačí, snažíme se bojovat se samotnou definicí maligního tumoru, tedy invazí nádorových buněk přes bazální membránu, která nám cytologům však zůstává mnohdy skrytá. Jedním z hlavních problémů, se kterými se cytolog při vyšetření žlučových cest celkem pravidelně potýká je nízká validita málo buněčných vzorků, mnohdy s odběrovými artefakty. Nelze opomenout ani význam klinického kontextu: bez dostatečných informací o pacientovi ztrácí i sebelepší cytologický nález svou výpovědní hodnotu.

CYTOLOGICKÁ KLASIFIKACE BILIÁRNÍCH LÉZÍ

Jak je obvyklé i v jiných oblastech patologie, také pro pankreatobiliární cytologii existují doporučené postupy (guidelines), které popisují jednotlivé typy lézí a jejich charakteristické buněčné změny. Na původní klasifikaci Papanicolaouovy společnosti cytopatologů z roku 2015 navázala klasifikace WHO publikovaná v roce 2021. Tato novější verze upravuje předchozí systém a zároveň precizněji definuje diagnostické jednotky v souladu s histologickou WHO klasifikací, stanovuje riziko malignity pro jednotlivé diagnostické kategorie a poskytuje i doporučení pro následný klinický management (tab. 1) (1-4). Přestože se klasifikace zaměřuje na celou pankreatobiliární oblast, cílem této práce je představit diagnostické kategorie se zvláštním důrazem na cytologii extrahepatálních žlučových cest.

Tab. 1. Diagnostická klasifikace kartáčkové cytologie žlučovodu, převzato a upraveno dle The WHO Reporting System for Pancreatobiliary Cytopathology 2022.

Nediagnostický

Tato kategorie je určena všem vzorkům, ze kterých, nejsme schopni stanovit diagnózu vzhledem k jejich buněčnosti či kvalitě. Patří sem preparáty acelulární, obsahující pouze krev, zánětlivé elementy, makrofágy, dále pak vzorky s obsahem nehodnotitelných arteficielně poškozených buněk, a to jak nátěrem samotným, tak špatným zpracováním vzorku v laboratoři, dále artefakty v podobě nečistot na skle (obr 1). Velmi obezřetní musíme být v hodnocení vzorků, kde jsou přítomny pouze benigní buňky, ačkoliv klinik popisuje jasně viditelné ložisko na zobrazovacích metodách. I v takovýchto případech WHO klasifikace doporučuje tuto kategorii, neboť je předpokládána chyba při odběru vzorku. Navíc, tyto benigní elementy mohou mít svůj původ v žaludku, duodenu či játrech, což je nutno odlišit. V těchto případech je vhodné v reportu klinika upozornit na vhodnost opakování odběru a nutnost korelace nálezu s klinickým obrazem (2,3).

Nález, byť jediné atypické buňky, vylučuje zařazení vzorku do této kategorie.

Obr. 1. Materiál nediagnostický –⁠ cytologický preparát z oblasti žlučových cest, barvený technikou Papanicolaou. V zorném poli je patrná nepravidelná amorfní hmota s příměsí hlenu, buněčné detritus a izolovanými erytrocyty. Buněčnost je extrémně chudá, bez jednoznačně identifikovatelných epiteliálních elementů, které by umožnily spolehlivé cytologické hodnocení. (Papanicolaou, 100x.)

Benigní / negativní pro malignitu

Definice dle WHO na toto místo zařazuje dostatečně buněčné vzorky, kde buňky vykazují znaky benigní, tedy bez cytologických atypií (2). Nutno podotknout, že dostatečná buněčnost není WHO blíže specifikována a je tedy hodnocena čistě subjektivně. Do této kategorie by neměly být zahrnuty žádné cytologické atypie kromě změn odpovídajících procesům reaktivním či reparativním. Kategorie v případě pankreatické tkáně zahrnuje celou řadu jednotek od zánětů přes cystadenom až po lymfoepiteliální cystu. V případě cytologie biliárních cest je spektrum užší, a kromě benigního duktálního epitelu, který bývá přítomný v podobě plochých trsů pravidelných buněk se zachovanou polaritou tzv. „honey comb“, s uniformními jádry, jemnou strukturou chromatinu a hladkou karyomembránou (obr. 2), jde často o buněčné změny zánětlivé povahy, a to zejména ty, které vedou k fokálnímu zúžení choledochu jak neznámé etiologie či infekční, ischemickou, folikulární, IgG4 asociovanou nebo primární sklerozující cholangitidu. V takovýchto případech vykazují epitelie známky odpovídající výraznějším reaktivním změnám, nutné je také posoudit charakter zánětlivého pozadí (2,5,6).

Hlavní cytologické znaky cholangitidy je na tomto místě nutné zmínit, neboť mohou cytologa zmást a vést k overdiagnóze. V takovýchto nátěrech jsou většinou přítomny různě velké trsy kohezivních buněk s anizonukleózou maximálně středního stupně. Disperzně bývají přítomny jednotlivé epitelové buňky normálního tvaru a velikosti. Cylindrické buňky mívají hůře přehledné buněčné hranice s nebo bez denzní cytoplazmy, svědčící pro změny metaplastické. Jejich jádra bývají mírně zvětšená, mírně hyperchromní, s pravidelnou jemnou karyomembránou bez zářezů, s malým, většinou centrálně uloženým jadérkem. Na pozadí jsou často přítomné zánětlivé elementy (neutrofily, lymfocyty) (2,7,8).

Problematické může být odlišit tyto změny od buněčných změn u biliární intraepiteliální neoplazie (BilIN) (2-4).

Obr. 2. Žlučový epitel, kde jsou buňky uspořádány v kompaktním, pravidelném trsu bez známek zjevné atypie. Jádra jsou uniformní, bez patrných nepravidelností chromatinové struktury, bez nukleolů. (Giemsa, 200x.)

Obr. 3. Buněčný trs se znaky mírné cytologické atypie.
Trs buněk se částečně ztracenou polaritou a mírně zvětšenými jádry. Jádra jsou hyperchromní, s jemně hrubším chromatinem, bez zřetelných jadérek. Cytoplazma je lehce bazofilní, ohraničení buněk ne zcela zřetelné. Některé buňky vykazují ztluštění nukleární membrány. (HE, 100x.)

Buněčná atypie

Tato diagnostická kategorie je charakterizována cytologickými změnami, které nelze hodnotit jako benigní, jejich stupeň však nedovoluje jejich zařazení do některých následující kategorií, tj. neoplazie, suspektní z malignity či maligní. Riziko malignity je u této kategorie vysoké a pohybuje se mezi 25-77 % (tab. 1) (2,9,10). Klinickým postupem by mělo být opakovaní ERCP a cholangioskopie. Tato kategorie by v našem reportu měla být používána obezřetně a neměla by soužit jako „odpadní koš“. Vhodné je také odůvodnit, proč do této kategorie nález řadíme (obr. 3)(2,3,11)

Neoplazie low risk / grade

Největší změny v nové WHO klasifikaci nastaly v kategoriích týkajících se intraduktálních a cystických neoplazií a neoplazií neuroendokrinního původu. V případě žlučových cest jsou do této kategorie zařazeny jednotky prekurzororvé, které mohou vést ke vzniku cholangiocelulárního adenokarcinomu, a to low grade biliární intraepitelová neoplazie a low grade intraduktální papilární neoplazie žlučovodu (2-4).

Biliární intraepitelová neoplazie low grade (BilIN –⁠ low) je definována jako neinvazivní neoplazie s plochou, mikropapilárně či pseudopapilárně utvářenou výstelkou s low grade dysplazií a často bývá nacházena u pacientů s chronickými záněty žlučovodu, a to v celém jejich širokém spektru od zánětů vznikajících v souvislosti s litiázou, přes primární sklerozující cholangitidu po projevy IgG4 asiciovaného onemocnění. Cytologicky je popisována jako přítomnost plochých či mikropapilárně utvářených trsů duktálních epitelií s mírnou ztrátou polarity jader, mírně zvýšeným N/C poměrem a mírnými iregularitami karyomembrány. Tato jednotka je v běžné praxi poměrně obtížně diagnostikovatelná a je velmi často hodnocena jako buněčná atypie, tedy kategorie III, či zaměňována se změnami reaktivními. Sama WHO uvádí, že jde o jednotku, která nemá přesně stanovená diagnostická kritéria a buněčné změny popisované jako „mírné“ vedou v reálné praxi k interpersonální diverzitě. Nápomocné nám může být vyšetření jaderné exprese S100 proteinu, která je prokázána u BilIN-low, zatímco reaktivní epitelie tuto expresi nevykazují. Dalšími metodami, které nám mohou pomoci usnadnit naše diagnostické rozpaky je imunohistochemická difúzní exprese p53 či ztráta exprese SMAD4, které favorizují spíše high grade změny a karcinom, u BIlIN-low přítomny nejsou (12,13). Stejně tak může být nápomocné vyšetření pomocí fluorescenční in situ hybridizace (FISH) s využitím kvadrusondy detekující polyzomii 3., 7. a 17. chromozomu a deleci genu CDKN2 (14,15). Tyto doplňkové metody však narážejí mnohdy na základní premisu, kterou je dostatečné množství diagnostického materiálu. V případě FISH by navíc měl být vzorek odebrán do speciálního média k tomuto určenému, jako je např. ThinPrep Cytolyt Solution (16, 17).

Intraduktální papilární neoplazie žlučovodu low grade

(IPN) je intraduktální proliferující léze charakteristická papilárním či vilózním typem růstu, lehkou dysplazií a produkcí hlenu, vykazující intestinální či gastrický typ diferenciace. Cytologicky vykazuje mírné až střední atypie s mírně zvětšenými jádry, avšak poměrně nízkým N/C poměrem, se zachovanou polaritou buněk a minimálním či žádným polymorfismem jader. Nápomocná v diagnostice je nám přítomnost hlenu, a to jak extracelulárního, tak intracelulárního. Jde o poměrně vzácnou lézi, u které WHO uvádí, že doplňkovými imunohistochemickými metodami je možné pomocí MUC5AC, MUC6 a MUC2 odlišit intestinální a gastrický typ diferenciace, což je dle našeho názoru zbytné, neboť toto vyšetření nepřináší klinikovi žádnou další informaci stran možného terapeutického postupu (18,19).

Neoplazie high-risk / grade

Základním definujícím znakem této katergorie jsou těžké cytologické atypie intraduktálního epitelu a v případě žlučových cest sem spadají jednotky: biliární intraepitelová neoplazie high grade, intraduktální papilární neoplazie žlučovodu high grade, intraduktální onkocytární papilární neoplazie a intraduktální tubulopapilární neoplazie.

Biliární intraepiteliální neoplazie high grade (BilIN-high) je definována jako intraduktální neinvazivní léze ploché či mikorpapilární morfologie, kde epitelie vykazují těžké cytologické atypie (obr. 4). V nátěrech zde nacházíme ploché nebo papilárně či mikropapilárně utvářené trsy buněk, které mohou být i trojdimenzionální. Buňky jsou charakteristické ztrátou jaderné polarity, jádra jsou hyperchromní, nepravidelná se zářezy v karyomembráně. Jednotlivé atypické či bizarní buňky nejsou pravidlem. Ojediněle můžeme zastihnout i buňky s intestinální diferenciací s přítomností buněk prstencových. Na pozadí bývají mnohdy přítomné zánětlivé buňky (2-4). Vyšetření, která nám mohou být nápomocná stejně jako u BilIN-low je exprese p53, SMAD4 a FISH (12-15).

Obr. 4. Na obrázku zastižen kompaktní trs epiteliálních buněk s cytologickými znaky biliární intraepiteliální neoplazie vysokého stupně (BilIN-HG). Buňky ztrácí své pravidelné uspořádání, vykazují se zvýšeným nukleocytoplazmatickým poměrem a přítomností hyperchromních nepravidelných jader. Struktura chromatinu je hrubší, cytoplazma je světlá, místy mucinózní, což odpovídá glandulární diferenciaci. (HE, 200x.)

Intraduktální papilární neoplazie žlučovodu high grade (IPNB) je obdobně jako IPN také premaligní jednotkou, intraduktální papilární proliferací výstelky mnohdy dilatovaného žlučovodu, tato však vykazuje těžké cytologické atypie. Histologicky jsou rozlišovány tři typy, a to s gastrickou, pankreatobiliální a onkocytární diferenciací. Cytologicky může jít o méně buněčné nátěry s kohezivními papilárními trsy buněk, někdy i trojdimenzionálními, mnohdy s přítomností extrai intracelulárního hlenu. Populace buněk vykazuje těžké cytologické atypie se ztrátou polarity hyperchromních nahloučených jader s hrubší strukturou chromatinu a zářezy v karyomembráně. Pseudostratifikaci buněk a protažení jejich jader nacházíme zejména u intestinálního typu léze. Hlavní diferenciálně diagnostickou jednotkou je cholangiocelulární karcinom. Pro IPNB svědčí přítomnost větších kohezivních papilárně utvářených trsů buněk a přítomnost hlenotvorby, nicméně jejich odlišení může být velmi obtížné (2-4,20,21). Riziko malignity u této jednotky nebylo definováno, klinik musí ale brát v úvahu, že část takovýchto lézí může být již v době své diagnózy asociovaná s invazivním karcinomem. Metodou volby v léčbě této léze, stejně jako u invazivního nemetastazujícího cholangiocelulárního karcinomu, je chirurgická resekce, takže případná overdiagnóza v tomto případě není hrubou chybou cytologa (22,23).

Intraduktální onkocytární papilární neoplazie je vzácnou

jednotkou vyskytující se v pankreatickém a ojediněle i v biliárním vývodu. Je pro ni typická papilární proliferace epitelu, tvořeného převážně onkocytárními buňkami s bohatou eozinofilní jemně granulární, na mitochondrie bohatou cytoplazmou. Nátěry k cytologickému vyšetření bývají často hypercelulární s přítomností kohezivních papilárně uspořádaných trsů polygonálních buněk obdobného vzhledu, jaký mají onkocyty v nátěrech štítné žlázy. Buňky mají povětšinou zřetelné hranice, jádra jsou mírně nepravidelná, oválná či okrouhlá, mohou, ale nemusí být hyperchromní, mnohdy mají excentricky uložené prominující jadérko, N/C poměr je nízký. Přestože tato léze může mít někdy poměrně blandní vzhled, bývá přibližně ve 30 % asociována s invazivním karcinomem; její prognóza je však relativně dobrá (24). Intraduktální tubulopapilární neoplazie (ITPN) je také jednotkou poměrně vzácnou, vyskytující se převážně v pankreatických vývodech. Ve žlučovodu je její výskyt extrémně vzácný. Je charakterizovaná duktální diferenciací buněk bez hlenotvorby, a těžkými dysplastickými změnami. Cytologické preparáty bývají většinou hypercelulární, buňky jsou přítomné v menších trsech s výraznějším buněčným překryvem. Pro buňky je typický vysoký N/C poměr, anizonukleóza, jádra bývají kulatá či oválná s prominujícími jadérky, jejich karyomembrána vykazuje nepravidelnosti. Jejich cytoplazma je většinou tmavší, bazofilní. Diferenciální diagnóza u této jednotky zahrnuje nejen adenokarcinom, ale také karcinom z acinárních buněk a neuroendokrinní tumory pankreatu. I přesto, že se zde zaměřujeme na léze primárního biliárního origa, zejména v oblasti distálních partií žlučovodu musíme pankreatické léze brát v úvahu, neboť mohou do žlučovodu prorůstat (25,26).

Suspektní z malignity

Jde o další jednotku, která je definována vágněji, a i zde bude patrná interpersonální diverzita (27,28). Jde o materiál vykazující cytopatologické znaky podezřelé z malignity, kvalita vzorku či jeho buněčnost nedovoluje stanovit dg. jako maligní (obr. 5) (2,3).

Z rozhovorů s kliniky jsem se mnohokrát dozvěděla, že závěr cytologického vyšetření jako „suspektní z malignity“ je v klinické praxi často považován za pozitivní, neboť slovy kliniků jde o buňky maligní, ale patolog se bál to tak napsat. Toto jsme se jim pokoušeli, většinou neúspěšně, vymluvit. Nicméně, sáhněme si do svědomí, někdy tomu tak je. Statistické riziko malignity u této kategorie je sice poměrně vysoké, pohybuje se mezi 74–100 % viz tab. č. 1 (2), nicméně overdiagnóza může mít pro pacienta vážné následky. Proto je v případě suspekce na malignitu doporučováno vyšetření zopakovat a naše interpretace nálezu suspektní z malignity by měla být nejen zvážena, ale i dostatečně a srozumitelně interpretována. V případě kliniků by měla být hodnocena v kontextu výsledků dalších vyšetření.

Obr. 5. Suspektní z malignity –⁠ trs duktálních epitelií se ztrátou polarity jader, která se místy mírně překrývají. Jádra buněk jsou nepravidelná, okrskově angulární, hyperchormní, karyomembrána se zářezy. (HE, 200x.)

Obr. 6. Cytologický preparát z oblasti žlučových cest, kde jsou patrné nápadně atypické epiteliální buňky, uspořádané ve volných i kompaktnějších skupinách. Buňky vykazují výrazné znaky malignity –⁠ zvětšená hyperchromní překrývající se jádra s nepravidelnými jadernými konturami, a výrazná jaderná pleomorfie. (HE, 400x.)

Maligní

Tato kategorie je vyhrazena vzorkům, ve kterých buněčná populace vykazuje jednoznačné známky malignity počínaje přítomností mnohdy trojdimenzionálních trsů se ztrátou polarity výrazně atypických buněk s jadernou polymorfií, crowdingem, hyperchromázií a vysokým N/C poměrem konče (2,3). Pozadí bývá někdy zánětlivé, někdy je zde přítomný buněčný detritus. Riziko malignity je zde 96-100 % (29). V případě primárního biliárního origa zde spadá pouze cholangiocelulární adenokarcinom (obr. 6). V cytologickém vyšetření je však nutno počítat i s tumory intestinálními či pankreatickými prorůstajícími do choledochu, což může být diagnostickou výzvou.

DISKUSE

Jak již bylo zmíněno, cytodiagnostika lézí pankreatobiliární a zejména biliární primární lokalizace je obtížnou patologickou disciplínou. Její senzitivita je relativně nízká a závisí na způsobu odběru a typu použité metody (tab. 2). K cytologickému vyšetření lze vzorky odebrat aspirací tekutiny či laváží žlučových cest, zlatým standardem je kartáčková biopsie z místa stenózy choledochu, neboť materiál získaný výše zmíněnými předchozími dvěma metodami odběru je většinou málo buněčný a jejich senzitivita bývá nízká (31,32). K upřesnění diagnózy výrazně přispívá také použití cytobloku, jenž umožňuje provedení imunohistochemických vyšetření. Ke zvýšení senzitivity cytologického vyšetření z oblasti extrahepatálních žlučových cest je možné využít celou řadu molekulárních a cytogenetických metod, a to například FISH, sekvenování nové generace či detekci miRNA-196a (33-36). Tyto metody jsou ale pro běžné použití v rutinní praxi velmi nákladné a opět jsou limitované množstvím a kvalitou materiálu, většina z nich je proto využívána pouze experimentálně. V rutinní praxi je na některých pracovištích většinou používána pouze fluorescenční in situ hybridizace, se kterou máme na našem ústavu zkušenosti od roku 2019 (16,30). Kromě těchto metod hraje ale stále hlavní roli erudice cytologa a podstatnou měrou také možností daného pracoviště patologie a součinnost s kliniky. K diagnóze patolog potřebuje mít nejen materiál samotný, ale též dostatek informací, které mohou ke správné diagnóze velmi pomoci. Popis odebraného vzorku pouze jako „brush žlučovodu“, který na našem pracovišti naštěstí už nevídáme, je naprosto nedostačující a musí být doplněn o přesnou lokalizaci léze, přítomnost chronického zánětu žlučovodu či dlouhodobě zavedeného stentu, popis dalších přidružených onemocnění a popis zobrazovacích metod. Je třeba si uvědomit, že všechny výše popsané metody vyšetření je nutné je brát jako jednotlivé dílky skládačky, která postupně dotváří celý obraz diagnózy. 

Tab. 2. Senzitivita a specificita vybraných cytologických metod v diagnostice biliárních malignit.