Retrospektivní analýza výsledků externího hodnocení kvality stanovení bilirubinu v séru novorozenců použitím jednotného kalibrátoru

Souhrn

Cíl: Retrospektivní analýza vlivu jednotného kalibrátoru na mezilaboratorní variabilitu výsledků stanovení celkového bilirubinu v sérech novorozenců.
Typ studie: retrospektivní průřezová
Materiál a Metody: Retrospektivní přehodnocení výsledků analýz účastníků externího hodnocení kvality (EHK) v období let 2023 až 2025 aplikací jednotného kalibrátoru a grafické a statistické vyhodnocení výsledků.

Výsledky: Přehodnocení tříletých výsledků systému EHK poskytovaných společností SEKK s.r.o. a jejich statistická analýza prokázala významný pozitivní vliv implementace jednotného kalibrátoru na snížení mezilaboratorní variability a míru harmonizace analytických platforem. Analýza dat se zaměřila na čtyři dominantní platformy společností Abbott, Beckmann, Roche a Siemens, na kterých se realizuje asi 95 % všech stanovení novorozeneckého bilirubinu v klinických laboratořích. Původní tříleté souhrnné soubory dat vykazovaly signifikantní variabilitu výsledků s rozsahem hodnot relativního vychýlení (bias) až ±22 %. Nejvýraznější odchylky ve správnosti jsme identifikovali mezi platformami Roche (Cobas) a Siemens (ADVIA a Atellica) s mediánem relativního vychýlení -5,45 % (mezikvartilové rozpětí IQR 5,4), resp. +12,6 % (IQR 10,35). Aplikace jednotného kalibrátoru však vedla k výrazné statistické korekci a redukci rozptylu u všech čtyř platforem. Průměrné mezikvartilové rozpětí (IQR) kleslo v průměru na hodnotu 4,1, což značí zvýšení shodnosti, a medián relativních vychýlení se ustálil v úzkém intervalu kolem nuly, čímž se stabilizovala jak správnost, tak celková přesnost analýz. Retrospektivní analýza relativních vychýlení demonstrovala dlouhodobé systematické rozdíly mezi diagnostikami dominantních výrobců. Hlavním zdrojem nežádoucí variability při stanovení bilirubinu v séru novorozenců není samotný chemický princip metody, ale nekonzistentní kalibrace IVD produktů.

Závěr: Z výsledků našeho příspěvku vyplývá, že implementace unifikovaného kalibračního systému má klíčový význam pro standardizaci měření celkového bilirubinu v séru novorozenců. Nadále však přetrvává potřeba definovat jednotný analytický postup, metrologickou návaznost, redefinici adekvátních dovolených limitů D_max, speciální kalibrátory a kontrolní materiály vhodné pro účely měření.

Klíčová slova:

bilirubin – standardizace – hyperbilirubinemie – referenční metoda

Úvod

Problémy s analytickou kvalitou laboratorních stanovení celkového bilirubinu (TsB) v sérech novorozenců jsou dlouhodobě známy. Celkový bilirubin v séru novorozenců se považuje za jeden z nejvýznamnějších parametrů při sledování novorozenecké hyperbilirubinemie. Razantní nástup koncentrací bilirubinu v prvních pěti dnech života může v důsledku jeho neurotoxicity ohrozit mentální vývoj novorozence s možnými trvalými následky. Přesné a správné stanovení celkového bilirubinu (TsB) je základní podmínkou pro adekvátní terapeu -⁠ tická rozhodnutí kliniků.

V posledním desetiletí, ale zejména za posledních 5 let se začaly objevovat v odborné literatuře informace o neúnosně vysoké mezilaboratorní variabilitě výsledků stanovení TsB [1]. Mezilaboratorní variace výsledků dosahovaly takové míry, že při výměně technologií (automatizované systémy) v klinických laboratořích docházelo k významnému zvýšení fototerapií a výměnných krevních transfuzí u novorozenců v důsledku nekonzistentních výsledků analýz [2]. Situace v této oblasti je považována za tak vážnou, že v roce 2022 vznikla pracovní skupina IFCC pro novorozenecký bilirubin (WG-NB), sestávající z členů vědecké rady IFFC, odborníků z laboratorní praxe, ze zástupců výrobců diagnostik a regulátorů (různých státních institucí). Skupina vydala v roce 2024 oficiální stanovisko k problému, které podrobně analyzuje současný stav [3]. V našem ostatním příspěvku jsme se také zabývali tímto fenoménem –⁠ přehodnocením výsledků mezilaboratorní kontroly spolehlivosti v systému SEKK, jak se v něm odrážel ve výsledcích v letech 2019 až 2023 [4]. V tomto příspěvku se věnujeme vlivu implementace jednotného identického kalibrátoru na řešení tohoto problému.

Materiál a metody

K vyhodnocení vlivu jednotného kalibrátoru na výsledky externí kontroly kvality jsme využili anonymizované původní výsledky účastníků EHK společnosti SEKK s.r.o. z kontrolních cyklů pro novorozenecký bilirubin za roky 2023 až 2025. Statistickými metodami jsme hodnotili bezmála 1450 výsledků v šesti za sebou následujících cyklech.

Pro simulaci jednotného identického kalibrátoru jsme pro všechny laboratoře vybrali vzorek A. Ve všech šesti cyklech se původní výsledky vzorku B, poskytnutých účastníky EKK, přepočítaly –⁠ přehodnotily ve vztahu k vzorku A jako k fiktivnímu standardu.

Za referenční hodnotu fiktivního standardu A jsme považovali hodnotu robustního průměru [RoM]A uváděného v každé souhrnné statistice výsledků příslušného kontrolního cyklu.

Přepočítané hodnoty vzorku Brecal jsme získali vynásobením poměru původního výsledku vzorku B_orig a původního výsledku vzorku A_orig udaného účastníky kontroly, referenční hodnotou [RoM]A vzorku A ze souhrnné statistiky příslušného kontrolního

B_recal = (B_orig / A_orig) * [RoM]A

Získané přehodnocené výsledky vzorku B jsme považovali za výsledky, které byly získány v laboratořích účastníků EKK s použitím identického kalibrátoru nejen z hlediska koncentrace stanovované součásti, tedy celkového bilirubinu, ale také z hlediska jeho šaržové homogenity a matrixové identity.

V šesti kontrolních cyklech z let 2023 až 2025 se nacházely výsledky získané diagnostikami 14 různých výrobců, mezi nimiž jsou dominantní čtyři globální výrobci IVD diagnostiky, společnosti Abbott, Beckmann, Roche a Siemens. Diagnostikami těchto čtyř společností bylo provedeno 95 % všech kontrolních analýz na pracovištích participantů. Soubory těchto výsledků jsme analyzovali jednak:

• z hlediska jejich celkové mezilaboratorní variability jako celku –⁠ přibližně 120 pravidelných účastníků EHK.
• z hlediska mezilaboratorní variability výsledků dosahované diagnostikami výše zmíněných čtyř společností, resp. úrovně vzájemné shody jejich výsledků.
• z hlediska vlivu identického kalibrátoru na variabilitu a přesnost výsledků.

Výsledky

Pro statistické hodnocení souborů jsme použili explorativní analýzy dat podle Tukeyho. Při porovnávání získaných souborů jsme jako základní kritéria použili mezikvartilové rozmezí (IQR) a medián. Data v grafických znázorněních jsme vizualizovali krabicovým diagramem (box-plot), který graficky znázorňuje statistické veličiny (průměr, medián, IQR, „vousy“-whiskers). Vyhodnocovali jsme statistické vlastnosti souborů původních výsledků zaslaných účastníky EHK a porovnávali jsme je se soubory, jejichž výsledky jsme získali přepočtením s použitím „fiktivního standardu“ podle vzorce, který je uveden v části Materiál a metody.

Celková mezilaboratorní variabilita -⁠ přibližně 120 pravidelných účastníků EHK. Původní výsledky a po implementaci jednotného kalibrátoru.

Obr.1 dokumentuje distribuci výsledků měření vzorku B u všech participantů v šesti cyklech během tříletého období. Pro vizualizaci byly použity krabicové grafy (box-plots), které zahrnují kompletní datové soubory včetně pracovišť s minoritním zastoupením metodik (\< 5), které standardně nepodléhají statistickému hodnocení v rámci peer-skupin v systému EHK. Modré box-ploty reprezentují originální soubory výsledků, ve kterých interkvartilové rozpětí (IQR) ohraničuje 50 % hodnot a „vousy“ (whiskers) pokrývají zbývající rozsah souboru s identifikací odlehlých hodnot (outliers). Tyto grafy indikují aktuální míru mezilaboratorní variability v jednotlivých cyklech.

Kvantitativní interpretaci obr. 1 přináší Tabulka 1, kde jsou uvedeny a podrobně vyhodnoceny základní statistické ukazatele. Klíčovým zjištěním je vliv uplatnění jednotné hodnoty kalibrátoru při výpočtu rekalkulovaných hodnot (žluté box-ploty), které v každém sledovaném cyklu vykazují významně nižší variabilitu v porovnání s primárními daty (modré box-ploty).

Kontrakce mezikvartilových rozpětí (IQR) dosahují v některých případech až 78%.

Analýza původních výsledků vzorků B naměřených diagnostikami Abbott, Beckamnn, Roche a Siemens

Původní výsledky vzorků B v jednotlivých cyklech, které získali participanti analýzami ve vlastních laboratořích, jsme přepočítali pomocí známé koncentrace příslušného vzorku A ve stejném cyklu. Za referenční hodnotu jsme považovali robustní průměr RoM uvedený pro tento vzorek A v souhrnných statistikách poskytovatele EHK.

Obr. 2 znázorňuje rozdělení relativních chyb původních výsledků vzorků B v šesti sledovaných cyklech (viz. legenda), Při výpočtu relativních chyb jsme za referenční hodnotu považovali příslušný robustní průměr RoM vzorku B, který je uveden v souhrnných statistikách příslušných cyklů poskytovatele EHK. Výsledky jsme rozdělili podle výrobců IVD. Soubory relativních chyb rozdělené podle výrobců diagnostik jsme statisticky vyhodnotili pomocí box-plotových grafů. Barevně znázorněná mezikvartilová rozpětí (IQR) naznačují vysokou míru variability v intervalu -15 % až +20 %. Současně také potvrzují dlouhodobou neshodu výsledků jednotlivých platforem.

Výsledky Abbott vykazují značnou mezisériovou variabilitu s výrazným pozitivním biasem kolem +10 %, který v dalších sériích fluktuuje k negativním, až po opětovný nárůst variability.

Systémy Roche vykazují konzistentní negativní bias se systematickou hodnotou mediánu v rozsahu -5 % až -7 %, při relativně úzkém rozptylu, který potvrzuje dlouhodobou preciznost výsledků.

Nejzávažnější analytické posuny jsme identifikovali u systémů Siemens, které vykazují masivní pozitivní bias od +7,5 % až po hodnoty přesahující +15 % a také extrémně odlehlé hodnoty.

Ze všech výrobců nejvyšší míru spolehlivosti vykazovaly systémy Beckmann s mediány kolem -2 % až +2,5 % s rovnoměrným rozložením výsledků, což indikuje optimální kalibraci vůči konsensuálnímu průměru.

Implementace identického kalibrátoru

Při analýze vlivu identického kalibrátoru jsme použili následující postup:

a/ Původní výsledky vzorků B v jednotlivých cyklech, které získali participanti analýzami ve vlastních laboratořích, jsme přepočítali pomocí známého výsledku příslušného vzorku A ve stejném cyklu. Za referenční hodnotu jsme považovali robustní průměr RoM uvedený pro tento vzorek A v souhrnných statistikách poskytovatele EHK.

b/ Vypočítali jsme relativní chyby (bias) přepočtených hodnot vzorků B, přičemž za referenční hodnotu jsme použili robustní průměr pro vzorek B ze souhrnných statistik poskytovatele EHK. Soubory relativních chyb rozdělené podle výrobců diagnostik jsme statisticky vyhodnotili pomocí box-plotových grafů a jsou znázorněny na obr. 3.

Implementací jednotného kalibrátoru jsme dosáhli téměř identických výsledků analýz. Efekt přepočítání výsledků se projevil zúžením mezikvartilového rozpětí a přesunem průměrů a mediánů téměř k 0% odchylce.

Diagnostika Abbott i Beckmann vykazují po přepočtu stabilní výsledky s mediánem relativních chyb blízkým k nule. Velmi konzistentní výsledky s těsným rozptylem kolem nuly jsme získali také u diagnostik Roche. Obecně skupina diagnostik Siemens vykazuje největší variablitu dat, i když základní charakteristiky souboru (průměr a medián) se v porovnání s původními daty významně zlepšily s rozptylem +2 % až -2,5 % kolem nuly. Právě u těchto dvou posledně jmenovaných skupin diagnostik (Roche a Siemens) se nejmarkantněji projevila implementace jednotného kalibrátoru.

Za zmínku stojí zajímavý vysoký rozptyl i přepočtených výsledků v cyklu 2/25 u všech čtyř skupin diagnostik.

Table 2. Statistical evaluation of relative errors (bias) before and after recalculation

Porovnání výsledků sloučených souborů za celé sledované období (2023 –⁠ 2025).

Při posledním přepočtu výsledků analýz jsme postupovali analogicky jako v předchozích dvou případech, sloučením všech šesti souborů během sledovaných tří let (2023 až 2025). Obr. 4 znázorňuje statistické vyhodnocení analýz seskupených podle výrobců diagnostik.

I u těchto velkých souborů výsledků se potvrzuje, že diagnostika sledovaných výrobců nemají jednotnou kalibrační strategii. Implementace jednotného kalibrátoru tyto výsledky sjednocuje vykazováním téměř identického mediánu a udržení mezikvartilového rozpětí v intervalu ±5 %.

Diskuse

Významným podnětem ostatních studií zabývat se problematikou vysoké variability a vzájemné nekonzistence výsledků pocházejících z analytických systémů byly problémy při interpretaci jejich výsledků kliniky [1]. Rozdílná klasifikace stavu novorozence při převozu na jiné zdravotnické zařízení, nebo bezdůvodný nárůst fototerapií a výměnných transfúzí [2,3] byly důvodem k snahám o řešení situace.

Odborníci v nejnovějších článcích zdůrazňují potřebu zlepšit analytickou kvalitu a striktněji vyžadovat monitoring kontroly kvality bilirubinu s použitím takových analytických požadavků (APS), které umožní bezpečný časový management novorozenců s hypebilirubinemií [4]. I aktuální IFCC Position Paper z roku 2024 vyžaduje řešit měření bilirubinu v sérech novorozenců zapojením všech zainteresovaných (výrobci, odborné společnosti, regulátoři). Upozorňuje, že jednotné péče o novorozence lze dosáhnout pouze zlepšenou standardizací [3].

Bhutaniho nomogram k posouzení možnosti vzniku těžké hyperbilirubémie, vznikal za následujících kvalitativních podmínek: Platforma: Hitachi 747; metoda (DPD) diazo; koeficient variace byl stanoven na \< 6 % a při tříměsíčních kontrolách se pohyboval mezi 2 % až 3 % [6]. Tyto podmínky implicitně definují podmínky kontroly kvality analytických kritérií (APS) vyžadující úspěšnou klinickou interpretaci nomogramů.

Bohužel v současné době nejsou žádné široce akceptovány APS pro neonatální bilirubín [5]. Bhutaniho nomogram je široce využíván v neonatologické péči. Avšak klinici aplikují výsledky jakýchkoli bilirubinových metod bez ohledu, zda jsou jejich výsledky ekvivalentní původní Hitachi diazo metodě [7].

Primárním cílem naší retrospektivní studie bylo zhodnotit efektivitu zavedení jednotného kalibrátoru pro zvýšení srovnatelnosti výsledků v rámci externího hodnocení kvality. Přepočítaná analyzovaná tříletá data potvrzují eliminaci systémových chyb mezi různými diagnostickými platformami. Kvantifikovali jsme systematické rozdíly statistickým zhodnocením jejich mezikvartilových rozpětí. Aplikací jednotného kalibrátoru lze dosáhnout jejich až 70% zúžení, čímž výrazně dosáhneme zvýšení vzájemné shody výsledků. Největší systematické rozdíly byly zaznamenány v souladu s našimi předchozím článkem [4]. Zjištěné rozdíly mezi platformami Roche (Cobas) a Siemens (ADVIA a Atellica) jsou v extrémech od -15 % do +20 % relativní chyby (bias). Na tuto skutečnost poukazovali i čeští autoři [8]. Mnozí autoři se v posledním období zaměřili na vhodnost, zda nevhodnost oxidační vanadátové metody stanovení TsB aplikované v analyzátorech Siemens [2][5], zejména v souvislosti s tím, že právě platformy Siemens (ADVIA a Atellica) poskytují extrémně pozitivní chyby. Je však třeba upozornit, že zmiňovaní autoři spíše porovnávají výsledky koherentních analytických systémů (analyzátor-metoda-kalibrátor-kontroly) než samotné analytické principy metody. Nizozemští autoři tvrdí, že princip měření s vanadátem vykazoval v roce 2013 malou odchylku (+1,9 %), fluktuoval v letech 2014 až 2021 kolem +5 % a za poslední tři roky se zvýšil na +15 % až +19,5 % [5] To může potvrzovat spíše drift, nebo průběžnou změnu kalibrační strategie než nějaký významný bias oproti principu diazo. Systematické rozdíly se snaží „řešit“ zavedením korekčních faktorů, aby „sjednotily“ výsledky systémů Siemens (ADVIA, Atellica) [2,5]. Avšak faktory pouze umožňují víceméně akceptovatelnou klinickou interpretaci, ale neřeší jasný problém výsledků chemické analýzy. Autoři původní vanadátové metody [8] jakož i pozdější americký patent [9] ve svých dokumentech jasně konstatují shodu výsledků diazo vs vanadátové metody.

Naše výsledky potvrzují, že hlavním zdrojem nežádoucí variability při stanovení bilirubinu není samotná metoda –⁠ princip, ale nekonzistentní kalibrace. Rozhodně nelze považovat za vyhovující stav, kdy v relativně malém regionu (ČR+SR) se využívá několik typů kalibrátorů různé provenience [10], které sice deklarují návaznost na jeden typ SRM, ale variabilita výsledků analýz v praxi je nevyhovující. Problémy mezilaboratorní variability výsledků stanovení novorozeneckého bilirubinu byly předmětem zkoumání v publikacích již koncem osmdesátých let minulého století [11, 12]. I v nich se ukázal příznivý vliv unifikovaného kalibrátoru na mezilaboratorní variabilitu výsledků. Proto se domníváme, že provádění jednotné kalibrační strategie by mohla být účinným nástrojem pro dosažení harmonizace výsledků.

Harmonizace je pro moderní medicínu s digitalizací nezbytná. Je zapotřebí průběžných, dílčích řešení. Nutnost řešení je na straně klinických laboratoří, domnívajících se, že problémy až do detailů vyřeší dodavatelé IVD, ale i u výrobců IVD, i u organizátorů programů EHK [13].

Současný stav v analytické kvalitě stanovení novorozeneckého bilirubinu je nevyhovující. V rámci milánského modelu nejsou stanovena kritéria analytického výkonu (APS) pro „novorozenecký“ bilirubin. Nizozemští autoři ve své aktuální publikaci hodnotí přesnost stanovení relativní odchylkou bias ± 5 % na základě doporučení odborného posudku nizozemské nadace kvality v lékařských laboratořích. [5]. V současnosti v klinické biochemii nedisponujeme příslušným referenčním materiálem. JCTLM nevede ve své databázi žádný referenční materiál pro bilirubin. V referenčních metodách vede dvě diazo metody fotometrické (podle Doumase a AACC).

Některé odborné společnosti doporučují hodnotit bilirubin např. hodnotami D_max = ±22 % (RfB Německo), D_max = ±18 % pro srovnatelnost, ±20 % pro návaznost (SEKK) apod. Tato kritéria nemotivují klinické laboratoře k intenzivnějším snahám o dosažení kvalitnějších výsledků. Paradoxně současný stav těmto kritériím vyhovuje.

Jakkoli je jednotná kalibrace významným faktorem k dosažení přijatelné mezilaboratorní variability je však jen jedním z faktorů, který tuto variabilitu může pozitivně ovlivnit.

Vzhledem k významu neonatálního bilirubinu v klinickém rozhodování si zjevné potíže, s nimiž se výrobci setkávají při optimalizaci výkonu (APS) svých testů, vyžadují rámec pro stanovení příslušných APS [5]. Je nutné dodat, že to nejsou jen výrobci, ale také pracovníci klinických laboratoří, kteří musí vyvíjet enormní úsilí ve snaze o poskytnutí co možná nejkvalitnějšího výsledku pro dobro pacienta.

Závěr

Implementace unifikovaného kalibračního systému je jedním z klíčových faktorů při harmonizaci měření bilirubinu v séru novorozenců. Spolu s definicí závazného analytického postupu, jednoznačné definice referenční metody, definicí a vyžadováním adekvátních dovolených limitů bias (Dmax) a existencí speciálních kalibrátorů a kontrolních materiálů lze dosáhnout shody výsledků nezávislou na použité přístrojové technice. Tato shoda je nezbytným předpokladem pro objektivitu klinického rozhodování a bezpečnost pacienta.

Poděkování

Autor děkuje řediteli společnosti SEKK s.r.o. Ing. Marku Budinovi a Ing. Luďkovi Špronglovi, za souhlas s poskytnutím anonymizovaných výsledků stanovení z kontrolních cyklů „Novorozenecký bilirubin“, bez kterých by tento příspěvek nemohl vzniknout.

Autor prohlašuje, že není ve střetu zájmů.