Metylační test versus duální barvení v triáži HR-HPV pozitivních žen – pilotní data ze screeningu karcinomu děložního hrdla

Souhrn

Úvod: Zavedení HR-HPV testu do screeningu karcinomu děložního hrdla zvyšuje záchyt těžkých lézí, ale současně vede k detekci žen s přechodnými HR-HPV infekcemi s nízkým rizikem progrese. Pro přesnější určení míry rizika lze využít biomarkery ze shodného vzorku jako pro HPV testaci, zejména duální barvení p16/Ki-67 a metylační analýzu buněčné DNA. Duální barvení označí buňky transformované HPV virem, ale nedokáže plně zohlednit biologickou variabilitu organizmu a HPV viru. Metylační test odráží epigenetické změny spojené s perzistující HR-HPV infekcí a tzv. biologicky pokročilými cervikálními lézemi a předpokládá se, že lépe reflektuje riziko krátkodobé progrese léze. Cíl: Porovnat účinnost třídění HR-HPV pozitivních žen pomocí duálního barvení p16/Ki-67 a metylační analýzy. Metodika: Do studie bylo zařazeno 44 HR-HPV pozitivních žen (medián věku 35 let) z českého screeningového programu, u nichž byla provedena cervikální biopsie nebo konizace. HSIL/AIS byly diagnostikovány u 52 % vzorků. Výsledky obou metod byly hodnoceny ve vztahu k věku ženy, HPV genotypu a histologickému nálezu. Výsledky: Obě metody se shodovaly přibližně v 60 % případů, s nejvyšší shodou u žen nad 35 let. U žen mladších 35 let byla častá diskrepance v podobě pozitivního duálního barvení při negativním metylačním testu. Vysoká shoda byla pozorována u lézí asociovaných s HPV16, zatímco u méně rizikových HR-HPV typů bylo časté pozitivní duální barvení při negativním metylačním vyšetření. Závěr: Výsledky naznačují, že metylační test může být přínosný zejména u mladších HR-HPV pozitivních žen, u nichž by mohl přispět k omezení nadměrné diagnostiky a invazivních výkonů při zachování bezpečnosti pacientek. Závěry pilotní studie se ověřují v rozsáhlé prospektivní studii, jež probíhá ve spolupráci s klinikou expertní kolposkopie.

Klíčová slova:

screening karcinomu děložního hrdla – HPV testování – metylační test – stanovení duální protilátky p16/Ki-67 – třídění HR-HPV pozitivních žen

Úvod

Karcinom děložního hrdla patří celosvětově mezi nejčastější zhoubné nádory reprodukčního systému žen. Ve vyspělých zemích zaujímá čtvrté místo z hlediska mortality, zatímco v rozvojových oblastech zůstává na prvním místě [1–3]. V ČR bylo v roce 2023 diagnostikováno 774 případů karcinomu děložního hrdla (C53), 221 žen v témže roce na toto onemocnění zemřelo. Incidence onemocnění stoupá po 30. roce života a vrcholí kolem 45 let [4].

Etiologickým faktorem karcinomu děložního hrdla je dlouhodobá perzistující infekce vysoce rizikovými genotypy lidského papilomaviru (HR-HPV). Přibližně 10–15 % žen v běžné populaci je nositelkami HR-HPV. Riziko progrese cervikální neoplazie do invazivního karcinomu je ovlivněno jak faktory hostitele, zejména věkem a imunitním stavem ženy, tak virovými faktory, především genotypem HPV [5–7]. Nejvyšší onkogenní potenciál mají genotypy HPV16 a 18, které jsou prokazovány u 60–70 % těžkých cervikálních lézí (HSIL) [8–10].

Začlenění HR-HPV testování do screeningových programů představovalo zásadní pokrok v prevenci karcinomu děložního hrdla díky vyšší senzitivitě pro detekci lézí CIN2+ [5,6,11]. Na základě poznatků světových odborných studií doporučila zdravotnická organizace WHO implementaci primárního HPV testování do screeningových programů [11,12]. Vyšší senzitivita HPV testů je však spojena s nižší specificitou, neboť test zachytí i přechodné HR-HPV infekce s nízkým rizikem progrese. To může vést k nárůstu počtu žen označených jako rizikové a ke zvýšenému počtu indikací k expertní kolposkopii či invazivním výkonům.

V rámci EU se lze již poměrně často setkat s tzv. primárním HPV cervikálním screeningem (využití HR-HPV testu namísto cytologického vyšetření). V případě primárního cytologického screeningu jsou využívány tzv. triážové HPV testy, např. v případě nejasného výsledku cytologického vyšetření (ASC-US) nebo při opakovaných cytologických nálezech nízkého rizika (ASC-US, LSIL) [13]. HPV test oproti cytologickému vyšetření vykazuje vyšší míru senzitivity pro léze CIN2+, avšak prokazatelně nižší specifitu [14–16]. Nižší specifita HPV testu může být zvýšena triážovými testy, jako je stanovení duální protilátky p16/Ki-67 nebo vyšetření metylace hostitelské buňky nebo viru. Pro třídění HR-HPV pozitivních žen by před užitím invazivních metod měly být přednostně využívány metody neinvazivní, tedy již zmíněné triážové testy, popř. expertní kolposkopie [2,3,17].

Duální barvení p16/Ki-67 je v současnosti nejčastěji používaným triážovým testem. Současná exprese obou markerů v jedné buňce svědčí pro probíhající onkogenní transformaci [17,18]. Tato metoda však hodnotí změny především z cytologického pohledu a nemusí plně zohledňovat biologickou variabilitu viru a schopnost organizmu infekci eliminovat, zejména u mladších žen.

Metylační testy založené na stanovení hypermetylace tumorsupresorových genů (TSG) hostitelské buňky představují alternativní přístup, který odráží pokročilé epigenetické změny spojené s perzistující transformující HR-HPV infekcí. Hypermetylace oblastí FAM19A4/miR124-2 je konzistentně zastoupena u většiny cervikálních karcinomů a těžkých biologicky pokročilých cervikálních lézí napříč kontinenty a byla popsána i u některých HPV-independentních karcinomů [19–21]. Metylační analýza tak může sloužit jako nástroj pro predikci rizika progrese onemocnění a přispět ke snížení nadměrné diagnostiky a léčby, zejména u mladších žen s neukončenými reprodukčními plány.

Materiál a metody

Studijní skupina

Do studie byly zařazeny tekuté cytologie 44 žen ze screeningu KDH v ČR (odebrané v 2023–2024), které měly do 6 měsíců provedenou diagnostickou cervikální biopsii nebo byly konizovány. Z tekuté cytologie byl proveden cytologický preparát, HR-HPV DNA screeningový test, imunocytochemické vyšetření exprese p16/Ki-67 a metylační test. Imunocytochemická exprese p16/Ki-67 a metylační analýza byly zhodnoceny jako možné třídicí testy pro případný management HR-HPV pozitivní ženy. Výsledky testů byly vzájemně porovnány a vyhodnoceny vzhledem k věku pacientky, HR-HPV genotypu a stadiu cervikální léze určeného z histologického nálezu následné biopsie.

Metodika

Tekutá cytologie byla odebrána do mé-dia PreservCyt (Hologic, Marlborough, Massachusetts, USA) a zpracována technologií ThinPrep. Cytologické preparáty byly hodnoceny cytotechnologem nebo patologem s využitím zobrazovacího Imaging systému. Veškeré následné testy byly provedeny z média PreservCyt.

Detekce HR-HPV byla provedena metodou real-time PCR na systému Alinity m (Abbott Molecular, Des Plaines, IL, USA) s rozšířenou genotypizací (HPV16, 18, 45, skupina A: 31, 33, 52, 58; skupina B: 35, 39, 51, 56, 59, 66, 68).

Duální barvení p16/Ki-67 bylo provedeno pomocí soupravy CINtec PLUS Cytology Kit (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany) dle doporučení výrobce a hodnoceno patologem.

Metylační analýza DNA byla provedena komerční soupravou QIAsure (Qiagen, Hilden, Germany), po standardní izolaci a bisulfitické konverzi DNA pomocí mikro kitu EZ DNA methylationTM Kit (ZYMO Research, Irvine, Californie, USA), s následnou analýzou metodou real-time PCR pomocí přístroje Rotor Gene Q MDx 5plex HRM (Qiagen).

Histologické vyšetření bioptických vzorků bylo provedeno standardním postupem s barvením hematoxylin-eozinem, dle potřeby doplněno o imunohis-tochemické barvení proteinu p16 a hodnoceno dle Světové zdravotnické organizace (WHO) –⁠ klasifikace nádorů ženského reprodukčního systému [22].

Výsledky

Medián věku žen činil 35 let. Ve studii bylo 23 vzorků žen ve věku do 35 let (včetně) a 21 vzorků žen nad 35 let. Cervikální léze těžkého stupně (HSIL –⁠ 21, AIS –⁠ 2) byly nalezeny v případě 52 % (23/44) biopsií, zbývajících 48 % (21/44) vykazovalo pouze léze nízkého stupně (LSIL –⁠ 15) nebo nebyla nalezena žádná dysplazie (negativní –⁠ 6).

Korelace p16/Ki-67 a metylační analýzy dle věku ženy

Celková pozitivita duálního barvení byla prokázaná u 67 % (28/42) vzorků (dva vzorky byly neanalyzovatelné). Metylační test byl pozitivní u 48 % (19/40) vzorků (čtyři vzorky byly neanalyzovatelné). Pro porovnání třídicích metod byly hodnoceny pouze vzorky s validním výsledkem obou metod, tedy 38. U vzorků s následně histologicky prokázanou cervikální lézí těžkého stupně (HSIL, AIS) bylo duální barvení p16/Ki-67 pozitivní u 90 % vzorků (19/21) a metylační test u 67 % vzorků (14/21). Porovnání pozitivních výsledků obou metod u všech vzorků studie a u biopticky ověřených případů s potvrzenou těžkou cervikální lézí (HSIL, AIS) je zobrazeno v grafu 1.

Diskrepance v závěru obou markerů se vyskytla u 37 % vzorků v celém souboru (14/38), v případě pacientek s následnou biopsií těžkého stupně (HSIL, AIS) u 33 % vzorků (7/21).

V případě žen mladších 35 let se markery shodovaly u 58 % vzorků, v případě těžkých lézí u 44 %. Metylační test vyšel pozitivní u 26 % (5/19) vzorků a duální barvení bylo pozitivní u 68 % (13/19) vzorků. U vzorků žen s následně prokázanou cervikální lézí těžkého stupně (HSIL, AIS) bylo duální barvení p16/Ki-67 pozitivní u 100 % vzorků (9/9) a metylační test u 44 % vzorků (4/10). Porovnání pozitivních výsledků obou metod u žen do 35 let pro všechny bioptické nálezy a u případů s potvrzenou těžkou cervikální lézí (HSIL, AIS) je zobrazeno v grafu 2.

V případě žen starších 35 let se třídící metody shodovaly u 68 % vzorků, v případě těžkých lézí u 83 %. Metylační vyšetření i duální barvení vyšlo pozitivní u 68 % (13/19) vzorků. U žen s následně prokázanou cervikální lézí těžkého stupně (HSIL, AIS) bylo duální barvení p16/Ki-67 i metylační test pozitivní u 83 % vzorků (10/12). Porovnání pozitivních výsledků obou metod u všech vzorků žen nad 35 let a u biopticky ověřených případů s potvrzenou těžkou cervikální lézí (HSIL, AIS) u žen nad 35 let je zobrazeno v grafu 3.

Korelace p16/Ki-67 a metylační analýzy dle HR-HPV genotypu

Nejrizikovější HPV typ 16 byl prokázán u 26 % (10/38) vzorků, z nichž 90 % (9/10) bylo zároveň metylačně pozitivní a 80 % (8/10) mělo pozitivní test na duální barvení.

HR-HPV genotypy 18 a 45 byly prokázány u 11 % (4/38) vzorků, z nichž 50 % (2/4) bylo zároveň metylačně pozitivní a 50 % (2/4) mělo pozitivní test na duální barvení.

HPV skupina A sjednocující středně rizikové genotypy 31, 33, 52 a 58 byla přítomna u 55 % žen (21/38). U této skupiny bylo metylační vyšetření pozitivní u 43 % vzorků (9/21) a duální barvení vyšlo pozitivní u 57 % vzorků (12/21).

HPV skupina B sjednocující genotypy s nejnižším rizikem 35, 39, 51, 56, 59, 66 a 68 byla přítomna u 24 % žen (9/38). U této skupiny vyšlo metylační vyšetření pozitivní u 33 % vzorků (3/9) a duální barvení p16/Ki-67 u 77 % vzorků (8/9).

Porovnání pozitivních výsledků obou metod, vyšetření CINtec PLUS a metylačního testu v závislosti na genotypu HR-HPV přítomném ve vzorku je vizualizováno v grafu 4.

Diskuze

Do naší studie bylo zahrnuto 44 HR-HPV pozitivních žen, věkový medián činil 35 let. V případě žen starších 35 let byla prokázána vysoká míra konkordance obou metod, metylační test i duální barvení p16/Ki-67 bylo pozitivní u 68 % případů. U žen 35 let a mladších se závěry obou vyšetření poměrně lišily, metylační test byl pozitivní u 26 % vzorků a duální barvení bylo pozitivní u 68 % vzorků.

U 21 biopticky verifikovaných high-grade lézí hrdla (HSIL, AIS) s validním výsledkem obou metod bez ohledu na věk pacientky se metody rozcházely ve výsledku u 33 % vzorků. Duální barvení bylo pozitivní u 90 % žen a metylační test u 67 %. Ještě významnější rozdíl pak byl prokázán u skupiny žen mladších 35 let, mezi nimiž bylo pozitivních 100 % vzorků duálního barvení a pouze 44 % vzorků metylačního testu. Díky schopnosti metylačního testu predikovat aktuální riziko progrese léze by právě u této skupiny použitím metylačního testu jako třídicího nástroje mohlo dojít k omezení využití expertních kolposkopií a invazivních výkonů, a to u poměrně vyššího procenta žen než v případě třídění pomocí duálního barvení.

Výsledky několika studií naznačují, že velká část cervikálních neoplazií CIN2+ spontánně ustupuje a pouze menší část jich přetrvává nebo progreduje do vyššího stupně [7,23,24]. Prodloužení časové prodlevy mezi biopsií a konizací významně zvyšovalo pravděpodobnost regrese cervikální léze. Největší míra pozorované regrese HPV infekce byla dosažena u žen do 25 let [25]. Je tedy pravděpodobné, že věk ženy velmi významně ovlivňuje schopnost organizmu vypořádat se i s perzistující transformující HR-HPV infekcí. Naše výsledky, s přihlédnutím k věkovému spektru výskytu karcinomu děložního hrdla v ČR [4] i k závěrům studií regrese cervikálních lézí, by mohly naznačovat vyšší efektivitu metylačního vyšetření pro dlouhodobější předpověď rizika progrese do karcinomu děložního hrdla.

Velmi důležitým faktorem přechodu cervikální dysplazie do karcinomu děložního hrdla je přítomný genotyp (popř. genotypy) HR-HPV. Prevalence a genotypová distribuce HPV byla tématem mnoha studií, které se snažily u histologicky potvrzených cervikálních lézí určit korelaci mezi genotypy HPV, věkovou distribucí a stupněm intraepiteliální léze. Genotypová distribuce HR-HPV v případě těžkých cervikálních lézí i karcinomu se v různých zemích mírně odlišuje. Nejrizikovějším, a tedy v karcinomech nejčastěji zastoupeným genotypem HPV je typ 16 [10,26]. Tento typ byl v rámci evropských studií prokázán u lézí CIN2 až CIN3 v 56–61 % případů, u dlaždicobuněčných karcinomů (SCC) u 66–74 % případů a u adenokarcinomů (ADC) v 51–64 % případů [8,27–30].

Ostatní typy se pak spolupodílejí na rozvoji nádorového onemocnění s takovouto prevalencí: typ 18 (SCC 8–16 %, ADC 37–40 %), typ 45 (SCC 5–9 %, ADC 8 %), typ 31 (SCC 4–7 %), 33 (SCC 5-11 %), zbylé genotypy se pohybovaly v rozmezí od 0 do 3 % případů cervikálních karcinomů [9,29–31]. Tato data poukazují na nutnost genotypizace jednotlivých typů HPV v rámci screeningu a díky tomu i na možnost větší individualizace péče o pacientky.

V této studii nejrizikovější HPV genotyp 16 způsoboval metylaci TSG v 90 % vzorků a duální barvení vyšlo pozitivní v 80 % vzorků. Vysoce rizikové genotypy 18 a 45 byly pozitivní u 50 % vzorků v případě metylačního vyšetření i duálního barvení. V případě vzorků obsahujících středně rizikové HR-HPV genotypy (31, 33, 52, 58) bylo metylační vyšetření pozitivní u 43 % a duální barvení u 57 %. V případě vzorků obsahujících nejméně rizikové HR-HPV genotypy (35, 39, 51, 56, 59, 66, 68) vyšlo metylační vyšetření pozitivní u 33 % a duální barvení u 77 %. Pokud byly u vzorků obsahujících tyto nejméně rizikové genotypy HR-HPV vyloučeny smíšené infekce (přítomnost dalšího z HR genotypů), nebyl metylačně pozitivní žádný vzorek a duální barvení bylo pozitivní u čtyř z pěti vzorků (80 %). Lze předpokládat, s přihlédnutím k závěrům studií genotypové distribuce HPV u cervikálních karcinomů, že značná část vyšetření duální protilátkou v případě pozitivity nejméně rizikové HR-HPV skupiny zachycuje infekce, které nemají vysoký potenciál přechodu do karcinomu děložního hrdla. Výsledky naší studie by mohly naznačovat vyšší účinnost metylačního vyšetření pro dlouhodobější předpověď rizika progrese do karcinomu děložního hrdla bez ohledu na typ HR-HPV.

Výsledky této studie naznačují vysokou shodu obou metod u žen nad 35 let věku a dále v případě pozitivity HR-HPV typu 16. U žen mladších 35 let a u případů s pozitivitou HR-HPV skupiny B (ty lze označit z pohledu rizika přechodu cervikálních lézí v karcinom za nejméně rizikové) se výsledky obou metod rozcházejí.

Závěr

Metody třídění HR-HPV pozitivních žen zkoumané v naší pilotní studii se shodovaly přibližně u 63 % případů. Vysoká míra shody obou metod byla pozorována u lézí vyvolaných nejagresivnějším genotypem HPV 16, nejmenší u HPV typů ze skupiny B. Velká míra shody obou triážových metod byla pozorována u žen starších 35 let. V případě žen mladších 35 let se výsledky metod značně rozcházely, a to zejména ve smyslu pozitivního duálního barvení a negativního metylačního vyšetření. Právě u této skupiny pacientek se díky věku a distribuci genotypů HPV v ČR dle dostupných studií předpokládá nejnižší krátkodobé riziko vzniku karcinomu. Výsledky této pilotní studie naznačují slibné použití metylačního testu u této skupiny žen, mohlo by totiž vést k omezení invazivních výkonů u mladých žen s neukončenými reprodukčními plány. To je žádoucí vzhledem k možným problémům s početím či donošením dítěte následkem chirurgického zásahu. Pilotní data se ověřují na velké prospektivní studii s dvouletým sledováním pacientek.

Vzhledem k malému počtu vzorků obsažených v pilotní studii je vhodné výsledky ověřit prospektivní studií s větším množstvím HR-HPV pozitivních žen.