Geny hlavního histokompatibilního komplexu nejsou pouze transplantačními antigeny

Oblast lidského hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) je lokalizována na chromozomu 6 (6p21.3) a zahrnuje úsek DNA velký přibližně 3,6 x 10⁶ nukleotidů. Tato genová oblast je nejpolymorfnější oblastí lidského genomu, zásadním způsobem zasahuje do regulace imunitní odpovědi, a zároveň výrazně přispívá k ohromné variabilitě imunitní odpovědi. Geny MHC I. a II. třídy leží v relativně malé vzdálenosti od sebe a proto na příkladě genů MHC komplexu můžeme sledovat fenomén vazebné nerovnováhy a vytváření ustálených haplotypů genů. Kromě hlavních histokompatibilních genů jsou zde lokalizovány i minoritní histokompatibilní geny, které také významným způsobem ovlivňují činnost imunitní odpovědi člověka. Poznatky z genetických studií MHC oblasti se v současnosti uplatňují v oboru transplantologie, v některých případech klinické diagnostiky autoimunitních chorob a v imunologii obecně. Cílem tohoto článku je popsat problematiku MHC komplexu a jeho souvislost s imunitní odpovědí v obecné rovině, dále přiblížit jeho význam pro transplantologii, jako i asociaci jeho genů s autoimunitním procesem.

Skupina genů MHC je významným zdrojem variability

Hlavní histokompatibilitní komplex (MHC) je soubor genů (lokusů) kódujících převážně povrchové antigeny buněk obratlovců. Tyto molekuly zprostředkovávají vzájemné interakce všech lymfocytů, antigen-prezentujících buněk a dalších imunokompetentních buněk ale také buněk imunitního systému s buňkami tkání. Z vědeckých studií jsou geny MHC známy především tím, že určují kompatibilitu mezi dárcem a příjemcem při transplantacích; dále pak jako genetické markery způsobující susceptibilitu k autoimunitním onemocněním. MHC komplex u lidí je známý jako komplex leukocytárních antigenů (HLA komplex) a ve své rozšířené formě zahrnuje více než 400 genů.

Geny MHC jsou funkčně i strukturně rozděleny do tří menších podskupin: antigeny třídy I, třídy II a třídy III (označovaná také jako „non class I/II MHC geny“). Rozmanitost antigenů MHC zabezpečuje vysoký stupeň různorodosti v reakci po transplantaci ale i reaktivitě imunitní odpovědi obecně. Jeho variabilitou je stanoven také genetický základ susceptibility pro rozvoj autoimunitní reakce. Variabilita zprostředkována antigeny MHC pochází hlavně z jejich kodominantního efektu při expresi, jejich vysokého stupně genetické polymorfnosti, a z toho, že celá oblast má výrazně polygenní způsob dědičnosti (1, 2).

Hlavní úlohou „klasických“ antigenů HLA je prezentace peptidů imunokompetentním buňkám

Molekuly HLA I. třídy vážou endogenní peptidy dlouhé 8–11 aminokyselin a prezentují je CD8+ T-lymfocytům. Naproti tomu molekuly HLA II. třídy vážou peptidy exogenního původu složené z 10–34 aminokyselin a prezentují je CD4+ T-lymfocytům.

Peptidy vázané HLA molekulami I. třídy vznikají proteolýzou proteinů v proteozómech cytoplazmy, odkud jsou transportovány do endoplazmatického retikula buňky pomocí přenašečů tvořených molekulami transporter 1 a transporter 2 (TAP1, TAP2). Prodloužené N-konce prekurzorů peptidů jsou zde štěpeny aminopeptidázou ERAAP (aminopeptidáza spojená s vývojem antigenů v ER) a takto upravené peptidy se váží na HLA molekuly I. třídy přítomné v endoplazmatickém retikulu. Komplexy molekul MHC a peptidů jsou společně transportovány na buněčný povrch přes Golgiho aparát (obr. 1a) (3-5).

HLA molekuly II. třídy prezentují peptidy exogenního původu, které ve formě proteinů vstupují do buňky za pomoci membránových vezikul nejčastěji fagocytózou. Tyto vezikuly se slučují s lyzozomem a vzniklý útvar se nazývá fagolyzozom. Fagolyzozom obsahuje proteázy, které štěpí přítomné proteiny. Vznikající peptidy jsou následně vázány na molekuly HLA II. třídy a transportovány na buněčný povrch, kde jsou prezentovány (obr. 1b) (3-5).

Třetím, ne úplně objasněným způsobem prezentace antigenů, je tzv. cross-prezentace (5). Je to mechanismus, který zabezpečuje možnost aktivace CD8+ T-lymfocytů peptidy pocházejícími z exogenního prostředí buňky. Intracelulární proces cross-prezentace není zatím plně objasněný, předpokládá se však, že peptidy určené pro prezentaci jsou transportovány do endoplazmatického retikula molekulami transportérů TAP1 a TAP2 a tam se spojují s HLA molekulami I. třídy. Po vazbě s HLA molekulami I. třídy a expozici na povrchu buněčné membrány, je komplex HLA antigenu I. třídy a imunogenního peptidu rozpoznáván CD8+ T-lymfocyty a dochází k jejich aktivaci (obr. 1c) (6, 7).

MHC geny v transplantační imunologii

V procesu orgánové transplantace nebo transplantace kmenových buněk mají molekuly MHC schopnost chovat se jako hlavní transplantační antigeny a mohou tak u příjemce vyvolat imunitní odpověď vedoucí k rejekci transplantátu, či k reakci GvHD (graft-versus host disease). První poznatky z této oblasti sahají do roku 1916, kdy vědecký tým Little a Tyzzer experimentoval s transplantací tumorů mezi různými liniemi laboratorních myší. Další vědecké studie ve 40. letech dopomohly k identifikaci genového komplexu odpovědného za histokompatibilitu a na základě těchto experimentů byly identifikovány a pojmenovány myší molekuly MHC (syn. H2) (8-10). V následujících letech byly postupně identifikovány antigeny MHC u dalších obratlovců včetně lidí. Dalších přibližně 25 let trvalo objasnění mechanismu, jakým se tyto antigeny podílí na imunitní odpovědi a popisu jejich hlavní funkce při prezentaci antigenů (11). Nejvýznamnější geny z hlediska transplantologie jsou tři lokusy HLA molekul I. třídy (HLA-A, -B a –C) a dva lokusy HLA antigenů II. třídy (HLA-DR, -DQ). Zásadní úloha dalších genů HLA komplexu I. a II. třídy se ve studiích nepotvrdila (12, 13).

Většina lidských buněk exprimuje na svém povrchu šest MHC molekul I. třídy (antigeny HLA-A,-B a-C; kde od každého z rodičů pochází jedna alela), a v případě imunokompetentních buněk tuto sadu doplňuje minimálně šest MHC molekul II. třídy (antigeny HLA-DP, -DQ, a jeden nebo víc antigenů HLA-DR). Variabilita a počet alel genů MHC dle současného poznání dosahuje obrovských rozměrů. Dle aktuálních informací z databáze IGMT (červenec 2012) identifikujeme u lidí 6 292 alel MHC I. třídy a 1.724 alel MHC II. třídy. Po sečtení je tedy variabilita soustředěná v genech HLA I. a II. třídy, celkem 8.016 alel. Nejpolymorfnějším je lokus HLA-B s počtem alel 2.605 (databáze IMGT; http://www.ebi. ac.uk/imgt/hla/stats.html). Každé dvě osoby, které nejsou identická dvojčata, exprimují MHC molekuly, které se navzájem odlišují v původní sekvenci DNA a častokrát i v antigenní specificitě. Všechny MHC molekuly mají schopnost zprostředkovat imunitní odpověď vedoucí k rejekci, resp. GvHD. Antigeny HLA-C a HLA-DP jsou z tohoto hlediska nejméně imunogenní (12, 14).

Při zrání T-lymfocytů v brzlíku dochází k jejich selekci na základě neschopnosti TCR (T-cell receptor) rozpoznat vlastní antigeny. Schopnost rozpoznat a reagovat na cizí antigeny však zůstává zachována. Při orgánových transplantacích T-lymfocyty pacienta svým TCR rozpoznávají peptid vázající oblast dárcovské molekuly MHC s navázaným aloantigenem a párují se s ním. T lymfocyt po této vazbě identifikuje buňku jako cizí a spouští se jedna z forem rejekce. U transplantace hematopoetických kmenových buněk se histo-ne-kompatibilita mezi dárcem a pacientem klinicky projeví jako GvHD. V případě, že hematopoetické buňky dárce po transplantaci rozpoznávají alogenní MHC molekuly pacienta, dochází ke spuštění reakce transplantovaného štěpu proti hostiteli (GvHR) a k manifestaci GvHD.

Metodický postup, který pomáhá předcházet rejekci a GvHD je série předtransplantačních vyšetření, které mají za úkol odhalit stupeň histokompatibility mezi pacientem a dárcem. Tato vyšetření zahrnují detekci polymorfismu HLA molekul a detekce protilátek proti HLA u pacienta pomocí křížové zkoušky – tzv. cross match – mezi buňkami dárce a sérem pacienta (15-19).

Non class I/II MHC – minoritní histokompatibilní geny v transplantologii

Shoda alel MHC genů I. a II. třídy má zásadní význam pro úspěch transplantace. MHC komplex však obsahuje další geny, které přispívají k riziku vzniku akutní GvHD, nebo rejekci štěpu. Identifikovat tyto geny v genetických asociačních studiích je velice obtížné, vzhledem k silné vazebné nerovnováze v tomto úseku lidského genomu.

Shoda alel v HLA systému slouží k výběru vhodných nepříbuzenských dárců kostní dřeně. Úroveň požadované shody se v průběhu historie měnila a nyní obvykle zahrnuje shodu v genech HLA-A, -B, -C a -DRB1 (shoda 8/8). V některých laboratořích je rozšířena ještě na lokus HLA-DQB1 a je požadována shoda 10/10. Srovnávací studie, ve které byly sledovány sourozenecké transplantace a nepříbuzenské transplantace pacientů s chronickou myeloidní leukemií se shodou 8/8 ukazují, že pacienti, kterým byl transplantován štěp nepříbuzného HLA shodného (8/8) dárce, mají až 2,44 krát vyšší riziko akutní GvHD II. až IV. stupně ve srovnání s pacienty, kteří podstoupili sourozeneckou HLA shodnou (8/8) transplantaci (20). Další studie ukazuje, že i v případě HLA shody (10/10) byl výskyt akutní GvHD II. až IV. třídy ve skupině nepříbuzenských transplantací ve srovnání se sourozeneckými transplantacemi vyšší (21). Vyšší riziko GvHD po nepříbuzenské transplantaci ve srovnání se sourozeneckou transplantací by mohlo být proto způsobeno vyšším stupněm podobnosti v non class I/II HLA genech u sourozenců. V případě sourozenecké transplantace je totiž sdíleno 50% genomu mezi dárcem a příjemcem. Také samotná oblast HLA může přispívat k rozdílnému výsledku při vzniku GvHD. Kromě klasických genů HLA I. a II. třídy totiž skrývá více než 200 dalších genů (1), mnohdy s důležitou funkcí při regulaci imunitní odpovědi. V souladu s touto hypotézou byla v dalších studiích neshoda v mikrosatelitních markrech v oblastech HLA I., II. a III. třídy asociována se zvýšeným rizikem úmrtí při nepříbuzenských transplantacích se shodou 10/10 alel (22).

HLA komplex, stejně jako celý lidský genom, je složen ze segmentů genů a jejich variant úzce spjatých genetickou vazbou. Společně tak na stejném řetězci DNA vytvářejí haplotypy (23). Haplotypy MHC jsou definovány dle obsažených alel genů HLA I. a II. třídy. Tyto jsou zároveň v silné vazebné nerovnováze s alelami genů ležících v oblastech non-class I a non-class II MHC komplexu a vytvářejí společně haplotypové bloky (24, 25). Neméně důležitý poznatek také je, že při nepříbuzenských transplantacích se shodou v HLA 10/10, se vyskytuje zvýšené riziko závažné akutní GvHD ve srovnání se sourozeneckými transplantacemi se shodou 10/10 (26). Toto zjištění dokazuje, že lidský MHC komplex kromě HLA-A, B, C, DRB1 a DQB1 kóduje ještě další ne zcela identifikované geny, které významně přispívají k riziku rozvoje akutní GvHD.

V případě rozdílů mezi dárcem a příjemcem můžou alely těchto genů sehrávat roli minoritních histokompatibilních antigenů. Obdobně může jít také o efekt dalších alelických variant genů se schopností zvýšit riziko GvHD. Jako příklad může posloužit gen TNFA, který leží v oblasti HLA III. třídy a kóduje prozánětlivý cytokin TNF alfa (TNF-α). Několik polymorfismů TNFA je v literatuře spojováno se zvýšeným rizikem GvHD a některé z nich jsou dávány do souvislosti se zvýšenou hladiny TNF-α (27). Silná vazebná nerovnováha v komplexu HLA však téměř znemožňuje určit v genetických asociačních studiích další geny MHC nepatřící do oblastí I. a II. třídy, které se podílejí na patofyziologii GvHD.

Vztah genů MHC komplexu k etiopatogenezi autoimunitních chorob

Oblast standardního MHC komplexu zahrnuje přibližně 3,6 x 10⁶ bazí (Mb) lokalizovaných na chromozomu 6 (6p21.3) lidského genomu. Rozšířená oblast MHC komplexu čítá asi 7,6 Mb lidského genomu. Označení rozšířené oblasti MHC vzniklo na základě zjištění, že vazebná nerovnováha známá v MHC zasahuje i mimo standardně definované oblasti (1). Z celkového počtu 421 genů lokalizovaných v rozšířené oblasti MHC, je 60 % exprimováno a u přibližně 22 % se předpokládá funkce při regulaci imunitní odpovědi (1).

První studie zabývající se asociací nemocí s geny MHC komplexu pocházejí z roku 1967. HLA-B antigeny byly v této studii nalézány ve vyšších frekvencích u pacientů s Hodgkinovým lymfomem (28). V současnosti vědecké studie ukazují, že geny MHC komplexu jsou spjaty s téměř každým autoimunitním onemocněním, obdobně jako s několika infekčními a zánětlivými onemocněními (29–37). Vzhledem k již popisované rozsáhlé vazebné nerovnováze v MHC, která se vztahuje na všechny alely napříč celým MHC, kauzální význam genů MHC v etiopatogenezi asociovaných nemocí zůstává ve většině případů neznámý. Přehled známých asociací alel a genů MHC komplexu s některými autoimunitními chorobami ilustruje tabulka 1. Pro lepší přehled jsou v tabulce odděleny HLA geny I. a II. třídy a geny nepatřící do I./II. třídy HLA komplexu (non-class I./II. geny).

Celiakie – příklad objasněného mechanismu asociace HLA a etiopatogeneze nemoci

Celiakie je zánětlivé onemocnění tenkého střeva se známkami autoimunitní reakce a silně ovlivněné dědičností. Klinicky se projevuje průjmem, nadýmáním, špatným přibýváním na váze a malým vzrůstem. Celiakie je celoživotní nemoc a jedinou účinnou léčbou je úplné vyloučení lepku ze stravy. Tento postup léčby je účinný ve více než 95% případů pacientů (38, 39).

Při etiopatogenezi celiakie sehrává klíčovou roli již zmiňována genetická predispozice. (31, 38). Nejvýznamnější genetické riziko vzniku celiakie představuje haplotyp MHC komplexu, který nese alely DQB1*02:01 nebo DQB1*02:02. Pozitivitu na antigeny DQ2 nacházíme u přibližně 95% pacientů, ostatní pacienti jsou pozitivní hlavně na alelu DQB1*03:02 (antigen DQ8) (31). HLA antigeny DQ2 a DQ8 jsou tedy hlavní rizikové faktory predisponující jedince k riziku vzniku celiakie a tvoří více než 35% genetického rizika. V případě posuzování rizika vzniku celiakie se také projevuje efekt „dávky genu“, kde jedinci homozygotní pro DQ2 nebo DQ8 genů nebo ti, kteří jsou heterozygotní pro DQ2 a DQ8 genů mají vyšší riziko onemocnění ve srovnání s jedinci s jednou kopií rizikového antigenu.

Do patogeneze celiakie jsou zapojeny mechanismy vrozené i adaptivní imunitní odpovědi. Z vrozené imunitní odpovědi zastává důležitou roli signalizační kaskáda spouštěná Toll-like receptory (TLR), které jsou důležité pro udržení homeostázy v zažívacím traktu. Požití lepku (bílkoviny nacházející se v pšenici, ječmeni a rýži), se zahájí signalizační kaskáda TLR signalizace přes faktor MyD88 (klíčová molekula kaskády TLR/IL-1R). Stimulací MyD88 se spouští proces vedoucí k vyšší propustnosti střev. Ta umožňuje translokaci gliadinu jeho následnou interakci s antigen prezentujícími buňkami (APC). V dalším kroku sehrává důležitou roli také tkáňová transglutamináza (tTG). Ta se účastní modifikace (deamidace) gliadinových glutaminových reziduí do formy kyseliny glutámové a gliadinové peptidy tak získávají negativní náboj. Negativní náboj je důležitý pro preferenční vazbu gliadinových peptidů s molekulami HLA-DQ2 / DQ8 u geneticky predisponovaných jedinců (40). Antigen-prezentující buňka s gliadinovým peptidem na svých molekulách HLA stimuluje T-lymfocyty a stimulační signál se přenáší na další eferentní buňky imunitního systému (NK buňky, CD8+ T lymfocyty, B lymfocyty). Dochází k produkci cytokinů (např. interferon-gama, interleukin-4, tumor nekrotizující faktor alfa), protilátek (anti-gliadinové, anti-endomysiální, anti-transglutaminázové), k cytotoxické reakci a k destrukci klků a nakonec k enteritidě (obr. 2) (41).

Ancestrální haplotyp MHC 8.1

Značné množství autoimunitních chorob je asociováno s alelami tzv. ancestrálního haplotypu MHC. Ancestrální haplotyp (označován také jako ancestrální haplotyp MHC 8.1) je multigenní haplotyp HLA A1-B8-DR3-DQ2, který obsahuje většinu genů hlavního histokompatibilitního komplexu na chromozomu 6. Slovo haplotyp je zkrácenou verzí označení haploidní genotyp. To znamená, že se jedná o sadu genetických markerů (případně polymorfismů, anebo alel genů), které jsou v silné genetické vazbě a jsou děděny společně z generace na generaci. Rekombinace je v haplotypech obecně obtížnější a v souvislosti s nimi se uplatňuje fenomén vazebné nerovnováhy. Multigenní haplotyp MHC představuje tedy soubor zděděných alel (polymorfismů) MHC genů a je výsledkem evoluce a vazebné nerovnováhy v populaci.

Navzdory tomu, že ancestrální haplotyp MHC obsahuje ve své rozšířené formě více než 400 genů (1), může být vyjádřen v následující podobě:

HLA A*01:01 : Cw*07:01 : B*08:01 : DRB1*03:01 : DQA1*05:01 : DQB1*02:01

nebo ve zkrácené formě:

A1 :: DQ2

Díky své délce 3,6 x 10⁶ Mb ve své základní podobě, je haplotyp A1 :: DQ2 je druhý nejdelší haplotyp identifikován v lidském genomu (25). Z hlediska studií evoluce vytváří tak trochu logický hlavolam v oblasti rekombinací. Při frekvenci rekombinací v lidském genomu a délce haplotypu MHC, by mělo správně v průběhu let docházet k jeho degradaci. K jeho degradaci však nedochází a naopak, ve své originální podobě se vyskytuje v několika částech světa. Z hlediska evoluční biologie má obtížně dohledatelný původ, ale předpokládá se, že pochází z oblasti Afriky (42).

Vědecké studie ukazují, že vysoká četnost haplotypu A1 :: DQ2 je způsobena pravděpodobně pozitivní selekcí v období časného neolitu a jeho izolací v částech světa, kde nebyla hlavní potravinou pšenice (přítomnost rizika celiakie v podobě DQB1*02). V oblasti DR3-DQ2 ancestrálního haplotypu se nacházejí geny, u kterých je známá silná vazba na vznik autoimunitních chorob. Předpokládá se však, že i v jiných oblastech tohoto haplotypu (např. A1-DQ2) leží další geny přispívající k autoimunitním onemocněním (42). Tyto geny patří společně do skupiny již zmiňovaných minoritních MHC genů a jejich alely budou pravděpodobně různým způsobem ovlivňovat susceptibilitu k autoimunitnímu procesu.

Závěr

Problematika genů MHC oblasti ve vztahu k regulaci imunitní odpovědi je velmi komplexní a zároveň heterogenní, podobně, jako imunitní odpověď sama. V této oblasti jsou lokalizovány známé histokompatibilní – transplantační antigeny, které mají zcela zásadní charakter v transplantologii a v regulaci imunitní odpovědi obecně. MHC komplex dále obsahuje geny, u kterých se úloha v imunitní odpovědi pouze předpokládá, zároveň je to však oblast bohatá i na geny, o kterých funkci se ví jen velmi málo, případně je jejich funkce úplně neznámá. Pro svou různorodost, vysokou variabilitu a důležitou roli v regulaci imunitní odpovědi, skýtá MHC komplex velmi vhodnou příležitost ke zkoumání souvislostí mezi genovými interakcemi, genovou signalizací a genovou regulací uvnitř imunitního systému obecně, ve vztahu k transplantační imunologii a také ve vztahu k etiopatogenezi autoimunitních chorob.

Poděkování

Tato práce byla podpořena Institucionální podporou Ministerstva zdravotnictví ČR (023728, Revmatologický ústav Praha) a Interní grantové agentury ­Ministerstva zdravotnictví ČR (MZČR NT13699).

RNDr. Peter Novota, PhD

Revmatologický ústav

Na Slupi 4

128 50 Praha 2

novota@revma.cz