Modelování lidské ledviny in vitro –⁠ potenciál renálních organoidů a tubuloidů pro urologii

Overview

Renální organoidy jsou pokročilé tkáňové kultury, které in vitro napodobují strukturu, fyziologii a onemocnění původního orgánu. Organoidy umožňují personalizovaný přístup k diagnostice a léčbě onemocnění a jejich význam v urologii stále roste. Organoidy odvozené z indukovaných pluripotentních kmenových buněk umožňují modelovat embryonální vývoj nefronů, zatímco tubuloidy vzniklé z dospělých buněk lépe napodobují funkce zralé ledvinné tkáně. Díky schopnosti odrážet genetické a funkční vlastnosti konkrétního pacienta nacházejí organoidy uplatnění při testování účinnosti a toxicity léčiv, studiu molekulárních mechanizmů onemocnění ledvin a mohou být využity v regenerativní medicíně. Nádorové organoidy mají potenciál ve výzkumu onkogeneze, modelování nádorového mikroprostředí nebo predikci odpovědi na terapii. Navzdory současným výzvám v oblasti kultivace a funkční integrace se možnosti klinické aplikace renálních organoidů rychle rozšiřují.

Hlavní stanovisko práce: Tento přehledový článek shrnuje problematiku renálních organoidů vč. jejich charakterizace, aplikací, limitací a budoucího směřování se zaměřením na oblast urologie.

Klíčová slova:

nádorové organoidy – personalizovaná medicína – renální karcinom – renální organoidy – tubuloidy

Organoidy, pokročilé tkáňové modely

Ledviny jsou jedním z nejsložitějších a nejlépe organizovaných orgánů v lidském těle a svou funkcí se podílejí na vylučování odpadních látek, regulaci homeostázy vnitřního prostředí a svými metabolickými působky ovlivňují i další orgánové systémy. Pokročilé in vitro modely jsou nezbytné pro detailní studium vývoje, fyziologie a patofyziologie ledvin, jelikož tradiční přístupy, vč. zvířecích modelů a dvourozměrných (2D) buněčných kultur, nedokáží plně rekapitulovat komplexní architekturu a funkční interakce in vivo [1]. Vytváření pokročilých trojrozměrných (3D) in vitro modelů využívajících tkáň pacienta představuje budoucnost personalizované medicíny. Organoidy jsou 3D mnohobuněčné tkáňové kultury, které přesněji napodobují komplexní strukturu, fyziologii a onemocnění zdrojového orgánu než 2D buněčné linie. Díky komplexnosti organoidů lze studovat interakce různých buněčných typů, vliv extracelulární matrix, vývoj a funkci prostorových kompartmentů [2].

Organoidy se vytvářejí buď z indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC –⁠ induced pluripotent stem cells), nebo z dospělých kmenových buněk (ASC –⁠ adult stem cells) pacienta, což jsou dvě komplementární techniky se schopností napodobit různé aspekty cílových orgánů [3]. Organoidy v urologickém výzkumu lze rozdělit na modely odvozené z primární a nádorové tkáně, jejichž příkladem jsou organoidy vytvořené z karcinomu ledvin nebo adenokarcinomu prostaty [4,5] (obr. 1).

Biobanky organoidů

Možnost kultivace a expanze organoidů umožňuje vznik biobank založených na systematickém sběru, zpracování a uchovávání vzorků spolu s detailními informacemi o pacientech. V současnosti existuje řada rozsáhlých biobank nejen v akademické sféře, ale i v komerčním sektoru, kde společnosti jako Cellesce a Repliorg nabízejí předpřipravené renální organoidy určené k vědeckému výzkumu. Komercializace organoidů má potenciál výrazně přispět k pokroku v translačním výzkumu, testování léčiv a personalizované i regenerativní medicíně. Rozvoj však brzdí vysoké náklady, absence jednotných regulačních rámců a etické výzvy. Z etického pohledu zůstává předmětem diskuzí vlastnictví organoidů biobankou, zejména v kontextu komercializace. Řádně informovaný pacient je dárcem původního biologického materiálu, ale právní vlastnictví organoidů v biobankách náleží instituci, která je zpracovává a uchovává [6,7].

Organogeneze ledvin

Pro vytvoření ledvinných struktur in vitro je nutné detailně porozumět fyziologickému vývoji ledvin, vč. buněčných interakcí a signálních drah. Ledvina se skládá z 30–40 typů buněk uspořádaných do složité architektury, což komplikuje tvorbu přesných modelů pro výzkum [8]. In vitro modely lze vytvořit podle vývojového procesu, který napodobuje embryogenezi, při níž se ledvina vyvíjí z mezodermu [9]. Klíčovou roli v nefrogenezi hrají interakce mezi ureterovým pupenem a mezenchymem metanefrogenního blastému. Organogeneze ledvin také závisí na migraci stromálních a endoteliálních buněk z jiných embryonálních oblastí. Stromální a endoteliální buňky zajišťují správný vývoj ledvin tím, že tvoří podpůrné stroma, poskytují signální molekuly a podílejí se na tvorbě imunitního mikroprostředí [8]. Selhání podpůrných buněk vede k dysfunkci ledviny [10]. Nefrogeneze probíhá výhradně prenatálně a po 36. týdnu těhotenství mizí progenitorové buňky, což omezuje regenerační schopnosti ledvin [11]. Regenerace v postnatálním období je omezena pouze na opravu poškozených buněk již existujících struktur, zejména v proximálních tubulech, kde dochází k proliferaci diferencovaných epitelových buněk [12]. Tato omezená regenerace má významné důsledky pro výzkum onemocnění ledvin a podporuje vývoj nových terapeutických strategií, jako jsou organoidy.

Organoidy odvozené z indukovaných pluripotentních buněk (iPSC)

Charakteristika a zdroje

Pro tvorbu renálních iPSC organoidů se využívají diferencované buňky pacienta, jako jsou kožní fibroblasty, adipocyty a krevní buňky, které jsou přeprogramovány do dediferencovaného pluripotentního stavu. Tvorba renálních iPSC organoidů je časově náročný proces, který trvá několik měsíců a zahrnuje přeprogramování primárních buněk a jejich následnou diferenciaci. Zdrojové buňky jsou pomocí kombinace růstových faktorů a malých molekul diferencovány směrem k intermediálnímu mezodermu, z něhož vznikají trojrozměrné organoidy napodobující vývoj nefronů (tab. 1). Celý proces napodobuje klíčové kroky embryonální organogeneze a umožňuje vznik struktur, které se vytvářejí pouze v průběhu vývoje [13,14]. Tyto organoidy obsahují jak epiteliální, tak mezenchymové buňky, ale zůstávají méně diferencované a vykazují buněčnou heterogenitu [15–17]. Sekvenování RNA jednotlivých buněk odhalilo, že iPSC organoidy jsou tvořeny podocyty, buňkami proximálního a distálního tubulu, Henleovy kličky, sběrných kanálků, stromálními a endoteliálními buňkami. Přestože iPSC organoidy zahrnují různé typy ledvinných buněk, chybí jim některé klíčové složky, jako jsou mezangiální buňky nebo glomerulární endotel [16].

Dva nejpoužívanější protokoly pro generování renálních iPSC organoidů byly publikovány v roce 2015 nezávisle skupinami Takasato et al. a Morizane et al. [13,14]. Oba protokoly napodobují vývojovou cestu k intermediálnímu mezodermu a metanefrickému mezenchymu, ale liší se v několika klíčových aspektech, které ovlivňují složení, strukturu a funkci výsledných organoidů.

Aplikace iPSC organoidů

Organoidy iPSC rekapitulují vývoj ledvin, proto umožňují detailní studium nefrogeneze a modelování vývojových poruch. Pro urology je zajímavou aplikací renálních organoidů jejich využití ve farmaceutickém výzkumu, kde slouží k testování nových léčiv, screeningu nefrotoxicity a studiu farmakodynamiky [18]. V porovnání s běžnými tkáňovými kulturami mají organoidy potenciál hodnověrně modelovat různé patofy-
ziologické děje, což má potenciál pro hledání nových biomarkerů a terapeutických cílů. Vzhledem k absenci systémového kontextu v rámci kultur organoidů je dalším krokem použití mikrotekutinových systémů k přesnějšímu napodobení prostředí in vivo [19].

Funkce iPSC organoidů jako experimentálního modelu byla hodnocena zkoumáním účinku nefrotoxických léčiv, které v nich indukují buněčné poškození [20–22]. Aktuální výzvu představuje definování role organoidů v hodnocení léčiv z hlediska bezpečnosti pro potřeby regulačních autorit, jako je Úřad pro kontrolu potravin a léčiv [23].

Potenciálním přínosem organoidů v urologii může být modelování transplantovatelných tkání pomocí orgánového bioinženýřství. Organoidy upravené technologií CRISPR/Cas9 umožňují vytvářet imunotolerantní tkáně s manipulovanými molekulami HLA (human leukocyte antigen), které zvyšují kompatibilitu mezi dárci a příjemci, a tím mohou snížit riziko akutní a/nebo chronické rejekční reakce [24,25].

Limitace iPSC

Renální organoidy mají slibné využití, avšak čelí řadě problémů, vč. časově náročné tvorby a krátké doby kultivace, což omezuje jejich využití při studiu chronických onemocnění a dlouhodobých účinků léčiv. Omezená životnost způsobuje problémy s dlouhodobým skladováním a kryoprezervací, což vyžaduje analýzu dopadu biobankování na buněčné vlastnosti [6]. Problematická je také standardizace mezi laboratořemi používajícími stejný kultivační protokol kvůli batch-to-batch variabilitě, která je způsobena rozdíly v rychlosti zrání a buněčné heterogenitě [26]. Navíc současné kultivační metody produkují organoidy s přítomností diferencovaných buněk jiných tkání, tzv. off-target buněk, a absencí klíčových buněčných typů, jako jsou mezangiální buňky. Navíc buňky reprogramované do pluripotentního stavu mohou vykazovat genomovou nestabilitu, což zvyšuje riziko vzniku teratomů. Proto je z pohledu rozvíjející se regenerativní medicíny nezbytné důkladně vyřešit otázky bezpečnosti a standardizace iPSC organoidů před zahájením klinických studií [27].

Budoucí směrování

Renální iPSC organoidy mají potenciál být v budoucnu využity v bioinženýrství k náhradě nebo regeneraci poškozené ledvinné tkáně díky možnosti vytvoření autologní tkáně. Pro jejich klinické uplatnění je však nezbytné zajistit správné buněčné složení, úspěšné začlenění do hostitelského organizmu, dostatečnou vaskularizaci a prokázanou funkčnost [28]. Navzdory uspořádání připomínajícímu nefronální architekturu zůstává vytvoření vyšší úrovně organizace s ohledem na společný sběrný systém moči a cévní systém náročné. Problémem je nedostatečná tvorba cévního řečiště, většina glomerulů zůstává in vitro avaskulární, ačkoliv v organoidech existují endoteliální buňky. Dalším z chybějících prvků je výstupní močový trakt, kterým by proudila moč produkovaná glomeruly, stejně jako chybí vyšší úroveň funkční organizace, jež byla podrobně popsána u dospělé ledviny vč. zonace imunitních buněk [8,27]. Pro dosažení větší strukturální a funkční zralosti renálních iPSC organoidů je klíčové napodobit fyziologické prostředí in vivo, zejména proudění tekutin, které standardním statickým kulturám chybí. Technologie organ-on-a-chip nabízí dynamické mikroprostředí, jež podporuje vaskulogenezi, diferenciaci a buněčnou organizaci, čímž zvyšuje využitelnost organoidů pro výzkum i testování léčiv [29,30].

Organoidy odvozené z dospělých kmenových buněk (ASC)

Charakteristika a zdroje

Organoidy ASC, nazývané renální tubuloidy, jsou vytvořeny z primárních epiteliálních buněk dospělých ledvin. Zdrojová tkáň je získána invazivně z ledvinné tkáně provedením biop-
sie nebo nefrektomií z jiných důvodů. Vzácným ale neinvazivním způsobem je možnost odběru z moči, ve které se vyskytují odloučené epitelie (tab. 2) [31]. Tvorba tubuloidů zahrnuje disociaci tkáně na primární buňky, jejich kultivaci v médiu obohaceném o růstové faktory a indukci kmenového stavu pomocí signálních molekul, což vede k jejich proliferaci a formování trojrozměrných struktur v gelovém prostředí (obr. 2). Ve srovnání s iPSC organoidy je tento proces jednodušší a rychlejší, přičemž tubuloidy vznikají během prvního týdne a jsou dlouhodobě expandovatelné po více než 6 měsíců [31,32]. Tubuloidy tvoří cystické struktury sféroidního tvaru sestávající z jednoduchého kubického epitelu (obr. 3). Tubuloidy rekapitulují plastický proces regenerace renálních tubulárních buněk, který umožňuje fyziologickým způsobem exponenciální expanzi primárního epitelu ledvin po dobu několika měsíců bez nutnosti genetického přeprogramování nebo imortalizace buněk [12]. Karyotypizace a sekvenování genomu tubuloidů ukázaly, že po dobu kultivace zůstávají geneticky stabilní. Ačkoliv se skládají výhradně z epiteliálních buněk a postrádají glomerulární, endoteliální a stromální složky, obsahují buňky proximálního tubulu, Henleovy kličky, distálního tubulu a sběrných kanálků [14,22]. Jejich funkčnost byla potvrzena expresí klíčových transportních proteinů [31,32].

Aplikace ASC organoidů

V současnosti jsou tubuloidy využívány k modelování různých onemocnění ledvin, vč. infekčních, dědičných, metabolických a nádorových [11]. Tubuloidy umožňují studium molekulárních mechanizmů opravy renální tkáně, což může přispět k identifikaci nových biomarkerů a terapeutických cílů při renálním selhání. Díky své struktuře s polarizovaným, nepropustným epitelem jsou vhodné i pro zkoumání tubulárního transportu a testování účinnosti a toxicity léčiv [31,32]. Tubuloidy lze aplikovat ve výzkumu v modelaci genetických onemocnění, jako je např. cystická fibróza. Tyto tubuloidy rekapitulují charakteristické abnormality v transportu elektrolytů a lze je použít k testování účinku nových léčiv [32]. V současnosti byly ASC organoidy vytvořeny také z nádorové tkáně ledvin za účelem studia maligních onemocnění [32,33]. Potenciální aplikací tubuloidů je použití v regenerativní medicíně díky jejich imunologickému profilu vhodnému pro buněčnou terapii a náhradu funkce orgánů [34].

Limitace ASC organoidů

Limitací tubuloidů je jejich jednoduchá struktura skládající se pouze z epiteliálních buněk. Vytvoření komplexního tkáňového modelu vyžaduje kokultivaci s endoteliálními a stromálními buňkami, které povedou ke vzniku glomerulárních struktur, intersticia a vaskularizace vzniklé tkáně. Podobně jako u iPSC organoidů je problémem buněčná heterogenita s přítomností off-target buněk [33]. Další limitací tubuloidů a iPSC renálních organoidů je jejich omezená metabolická kapacita, která představuje omezení pro jejich využití v predikci metabolizmu léčiv a nefrotoxicity. Ve srovnání s nativní ledvinou vykazují oba typy organoidů omezenou expresi a aktivitu enzymů cytochromu P450 (CYP), zejména izoenzymů zodpovědných za metabolizmus léčiv, jako jsou CYP3A4, CYP2B6 a CYP2E. To omezuje jejich schopnost přesně modelovat metabolizmus léčiv v ledvinách [35].

Budoucnost směřování

Tubuloidy představují snadnou možnost rozšíření výzkumu různých onemocnění, vytvoření tkáňových biobank a usnadnění personalizované medicíny. Umožňují farmaceutický screening a validaci léků na velké skupině pacientů s určitým onemocněním. V neposlední řadě je lze využít ve výzkumu na molekulární úrovni k hledání nových možností cílené terapie. Dalším úkolem je validovat in vitro screening léčiv v korelaci se skutečnými klinickými výsledky [33].

Organoidy odvozené z nádorové tkáně

Nádory ledvin

Renální karcinom (RCC –⁠ renal cell carcinoma) je nádor vycházející z epitelu ledvin a tvoří přibližně 2 % všech nádorů dospělých. Nejčastějším histologickým typem je světlobuněčný RCC, který reprezentuje 70 % RCC. Papilární RCC tvoří 13–20 % nádorů, chromofobní karcinom se vyskytuje v 5 % a zbylé případy zahrnují vzácnější histologické typy. Léčba se řídí klinickým stadiem a stavem pacienta podle aktuálních doporučení vydaných odbornými společnosti. U pacientů s lokalizovaným nádorem je chirurgický výkon kurativní léčbou. Pacienti v dobrém klinickém stavu s neoperabilním nebo metastazovaným nádorem jsou léčeni systémovou terapií [36]. Nicméně klinické výsledky cílené terapie jsou často neuspokojivé a dramaticky se liší v důsledku rozsáhlé intratumorální a intertumorální heterogenity nádoru [37]. V případech pokročilého RCC se po počáteční odpovědi na léčbu první linie mohou objevit odolnější nádorové klony, na které je obtížnější zacílit. Pacienti se stejným typem RCC nesou různé mutační profily nádorů, proto nejsou odpovědi pacientů na systémovou léčbu stejné [38].

Charakteristika a zdroje nádorových organoidů

Organoidy odvozené z nádorové tkáně pacienta jsou 3D struktury, které spontánně samoorganizují in vitro, zachovávají své genetické aberace a reprodukují molekulární a histologický fenotyp původního nádoru. Nádorové organoidy jsou vhodné ke zkoumání molekulárního mechanizmu onkogeneze, k identifikaci nových diagnosticko-prognostických biomarkerů a k personalizované léčbě [33,38]. Zdrojovou tkání je přímo nádor pacienta, z něhož je proveden odběr tkáně ke zpracování. Na rozdíl od normálních renálních kultur mají nádorové organoidy odlišné požadavky na složení kultivačního média. Úspěšnost založení nádorové kultury je nižší než u normálních organoidů. Může to být důsledek nekrotického prostředí nádorových tkání nebo snížení adheze mezi buňkami, což snižuje tvorbu 3D struktur, ale nádorové buňky tak mohou získat invazivní vlastnosti (obr. 4). V porovnání s normálními kulturami vykazují nádorové organoidy sníženou schopnost růstu a dlouhodobé kultivace [33]. Nádorové organoidy vykazují odlišnou morfologii oproti tubuloidům ze zdravé tkáně, přičemž tvoří volně organizované 3D struktury s hustými buněčnými agregáty a aberantními jádry.

Aplikace nádorových organoidů

Výzkum nádorových organoidů nabízí pro urologickou praxi potenciál translace do klinického využití, zejména v modelování onkogeneze, hledání tumor markerů a testování nových léčiv [39]. Testování efektivity léčiv zahrnuje i experimenty se zdravými organoidy, které plní kontrolní funkci. Experimenty na zdravé tkáni ukazují, zda se účinnost testovaného léčiva nestřetává s toxicitou léčiva [5]. Nádorové organoidy se využívají také k modelování lékové rezistence, vývoje metastáz a genetických změn souvisejících s onkogenezí a odpovědí na léčbu, a to za pomoci CRISPR/Cas9 technologie [40]. Další aplikací nádorových organoidů je predikce odpovědi na imunoterapii a následné rozhodování o nasazení terapie. Nádorové organoidy kultivované metodou air-liquid interface si uchovávají imunitní buňky, které byly přítomny v původním nádoru [41]. Analýza genové exprese ukázala, že nádorové organoidy a původní nádor se liší pouze malým počtem exprimovaných genů. Bylo zjištěno, že repertoár T-buněčných receptorů je vysoce konzervován mezi nádorem a nádorovými organoidy. Dále bylo odhaleno, že nádorové organoidy funkčně rekapitulují imunitní kontrolní bod závislý na interakci PD-1/ PD L1. Tato zjištění umožňují zaměřit se na in vitro výzkum imunitní reakce uvnitř nádoru, vč. rezidentních imunitních buněk bez nutnosti použití periferních imunitních buněk [42]. Společná kultivace nádorových organoidů společně s tumor infiltrujícími lymfocyty, genově modifikovanými T-lymfocyty exprimujícími nové T-buněčné receptory nebo chimérické antigenní receptory může poskytnout další informace pro predikci odpovědi na imunoterapii [41,42].

Další možností využití nádorových organoidů pro studium onkogeneze a invazivního růstu nádoru je tvorba xenograftů. Ty vznikají transplantací lidských nádorových organoidů do imunosuprimovaných myší. Několik studií již prokázalo úspěšné přihojení a schopnost invazivity nádorových organoidů, což ukazuje, že nádorové organoidy si zachovávají vlastnosti nádorové populace a lze je udržovat obojí in vitro a in vivo. Nevýhodou xenograftů je nákladná a časově náročná kultivace, přičemž úspešnost tvorby se liší v závislosti na původu nádoru. Dalším omezením je rychlá ztráta lidských stromálních komponent, které jsou rychle nahrazeny myším mikroprostředím [33,43].

 

Limitace nádorových organoidů

Kultivace nádorových organoidů čelí výzvám, zejména v podobě potřeby efektivních a standardizovaných protokolů pro stabilní růst buněčných kultur. Organoidy však nezachovávají nádorové mikroprostředí, které zahrnuje nádorové buňky, stromální složky, imunitní buňky a vaskulaturu, jež mají klíčovou roli v růstu nádoru. Nedostatek těchto fyzikálně-chemických vlastností mikroprostředí omezuje prediktivní schopnost organoidů při studiích in vitro [5].

Pokročilé modely využívající imunitně kompetentní organoidy, např. podle metodiky Neal et al., částečně překonávají tuto bariéru [42]. Mechanizmus zprostředkovávající odpověď na léčbu lze pochopit zkoumáním kompletního nádorového mikroprostředí. Proto by tyto parametry měly být rekapitulovány v pokročilých tkáňových modelech určených pro screening léčiv [44]. Nejobtížnějším úkolem může být vytvoření lidské imunitní odpovědi in vitro zprostředkované autologními imunitními buňkami, které budou aktivovány testovaným léčivem. Odběr a kultivace vlastních imunitních buněk pacienta by měly probíhat souběžně s tvorbou nádorových organoidů [5].

 

Budoucnost směřování

Technologie nádorových organoidů může být zdokonalena pro studium imunoterapie a antiangiogenních léčiv, což otevírá nové hranice využití organoidů. K ověření, zda výsledky terapie získané z organoidů skutečně odrážejí odpověď pacienta in vivo, je nezbytné uskutečnit prospektivní studie. Pokud bude v preklinickém výzkumu prokázána použitelnost organoidů, mohou se v budoucnosti stát účinným nástrojem pro optimalizaci volby léčby v klinické praxi [5,33,44].

 

Závěr

Renální organoidy a tubuloidy představují nové možnosti výzkumu vývoje a funkce ledvin. Do budoucna se očekává, že renální organoidy odvozené z nádorové tkáně budou hrát klíčovou roli nejen ve výzkumu onkogeneze, ale i při hledání nových terapeutických přístupů. Jejich využití může výrazně urychlit vývoj cílené terapie.

 

Střet zájmů: Autoři prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.

 

Prohlášení o podpoře: Tvorba této publikace byla podpořena projektem AZV NU23-06-00045.