Chromotripse – rozsáhlé chromozomové přestavby a jejich význam u onkologických onemocnění

Východiska:

Chromozomové přestavby hrají významnou roli v patofyziologii nádorů. Mezi mechanizmy vedoucí k jejich vzniku byla v nedávné době zařazena chromotripse. Ta způsobuje rozpad chromozomů a jejich opětovné seskupení s desítkami až stovkami přestaveb. Na rozdíl od klasického schématu nádorové transformace se při chromotripsi aberace nehromadí postupně, ale vznikají během jediné události. Vzniklé přestavby bývají rozsáhlé a často zapříčiňují aktivaci onkogenů či inaktivaci nádorových supresorů. Chromotripse je spojována s mnoha typy nádorů, především s nádory mozku a kostí. Byla však popsána nejen u nádorových onemocnění, ale i u vrozených poruch. Přesný mechanizmus vzniku nebyl dosud objasněn, existuje však několik modelů, z nichž nejpravděpodobnější se jeví vznik přestaveb následkem poškození DNA v tzv. mikrojádře. Stejně tak důsledky chromotripse pro průběh buněčných pochodů nejsou zatím plně pochopeny. U onkologických pacientů obecně je pozorována souvislost mezi chromotripsí a nepříznivou prognózou.

Cíl:

Záměrem tohoto článku je shrnout dosavadní poznatky o chromotripsi a předložit je čtenáři v přehledné podobě. Zaměřili jsme se na popsání základních rysů chromotripse, pravděpodobných mechanizmů jejího vzniku, důsledků na buněčné procesy a dále na poskytnutí přehledu onemocnění, u kterých se s ní můžeme setkat, přičemž pozornost je věnována zejména onkologickým onemocněním. Na závěr je uveden výhled pro využití dosavadních poznatků o chromotripsi při optimalizaci léčebných postupů u onkologických pacientů.

Klíčová slova:

chromotripse – chromozomy – DNA – mutace – strukturní varianta genomu – oprava poškození DNA

Úvod

Nádorová transformace je podmíněna vznikem aberací a hromaděním mutací v lidském genomu, k nimž může docházet při každém buněčném cyklu. Zajímavým objevem v oblasti nádorové biologie je nedávno popsaná chromotripse – proces zahrnující vznik komplexních genomových přestaveb velkého rozsahu. Chromotripse byla v různé míře pozorována u mnoha typů nádorů [1,2], ale také u některých vrozených poruch [3] a několik případů bylo zaznamenáno i u zdravých jedinců [4].

Pojem chromotripse je odvozen z řeckých výrazů „chromos“ pro chromozom a „thripsis“ pro rozpad na kousky. Během chromotripse totiž dochází k rozpadu chromozomů nebo jejich částí na malé fragmenty. Ty jsou následně prostřednictvím nehomologního spojování konců DNA (non-homologous end joining – NHEJ) či procesů založených na mikrohomologii [1,5] sestaveny zpět, většinou ovšem nepřesně oproti původní struktuře (schéma 1). Vznikají tak četné delece, inverze, inzerce, amplifikace a translokace. Mnohé experimenty naznačují, že ke vzniku těchto přestaveb dochází během jediného buněčného dělení [1].

Vedle chromotripse byly popsány také příbuzné mechanizmy, jako jsou chromoanasyntéza a chromoplexe (souhrnně bývají všechny tři procesy označovány jako chromoanageneze), které se od chromotripse liší strukturou chromozomových přestaveb [6].

Hlavní rysy chromotripse

Existuje několik základních charakteristik chromotripse, které lze pozorovat pomocí cytogenetických a genomických metod, k nimž patří např. mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace, čipy pro detekci jednonukleotidových polymorfizmů či čipy pro komparativní genomovou hybridizaci. Nejpřesnější charakterizaci však poskytuje celogenomové sekvenování.

Typickým znakem chromotripse je vznik desítek až stovek chromozomových přestaveb mezi několika málo chromozomy, ale i v rámci jednoho chromozomu, jeho ramene či pouze konkrétního regionu. Obvykle se přestavby vyskytují ve shlucích, tzv. klastrech. Dlouhé úseky neporušené DNA mohou střídat úseky cca 50 kb zahrnující 5–10 zlomů [1].

Vznik nebalancovaných aberací lze pozorovat pomocí čipových technologií jako změnu počtu kopií DNA. Počet kopií je alternativním označením pro počet alel, standardně je charakterizován počtem dva. Dojde-li ovšem k nebalancované aberaci, hodnota se změní. V případě delece dochází ke ztrátě heterozygotnosti (ztrátě jedné alely), a je tedy přítomna pouze jedna kopie DNA. Při duplikaci se naopak počet kopií zvýší na tři. V genomu zasaženém chromotripsí počet kopií DNA obvykle kolísá mezi jednou až třemi [1]. Tento znak nejvíce podporuje myšlenku, že k přestavbám provázejícím chromotripsi dochází naráz během jednoho buněčného dělení. Pokud by k přestavbám docházelo postupně, změny by byly různorodější.

Opětovné spojování fragmentů DNA probíhá při chromotripsi náhodně, a proto je náhodná i jejich posloupnost a orientace [1]. Každý volný fragment má dva konce, které se označují jako „head“ (5‘ konec) a „tail“ (3‘ konec). Jejich náhodným spojením dochází ke vzniku čtyř typů spojů – head-to-tail (vznik duplikace), tail-to-head (vznik delece), head-to-head a tail-to-tail (vznik inverze), a to v téměř stejném poměru (schéma 2).

V některých případech při chromotripsi dochází k formování malých kruhovitých útvarů, tzv. double-minute chromozomů [1,5]. Vznikají duplikací části chromozomu a často nesou onkogeny. Replikují se nezávisle na buněčném cyklu a v buňce jsou udržovány, jelikož představují selekční výhodu pro růst a přežití.

Modelové mechanizmy vzniku chromotripse

Dosud nepanuje jednotný názor na to, jakým způsobem k chromotripsi dochází. Bylo popsáno několik modelových mechanizmů.

V současnosti nejvíce přijímaný je založen na pozorování mimojaderných struktur, tzv. mikrojader (schéma 3A). Tyto struktury vznikají během mitózy odpojením chromozomů nebo jejich částí od hlavního jádra při přechodu buňky z metafáze do anafáze. Oddělené chromozomy v mikrojádře se replikují pomaleji než chromozomy v hlavním buněčném jádře. Dosud se předpokládalo, že v mikrojádře nedochází k aktivaci kontrolních bodů buněčného cyklu, odpojené chromozomy předčasně kondenzují a rozpadají se [7]. Jedna z nejnovějších studií však poukazuje na to, že je rozpad chromozomů zapříčiněn defektním jaderným obalem, který je tvořen pouze nejnutnějšími proteiny. Je mnohem křehčí než normální jaderný obal, není schopen tvořit póry, a tudíž neumožňuje transport důležitých proteinů zajišťujících integritu genomu [8]. Fragmenty chromozomů se poté mohou z mikrojádra vyčlenit a vytvořit tzv. double-minute chromozomy (viz předchozí kapitola), nebo se náhodně pospojují a vznikne derivovaný chromozom. Ten může v mikrojádře existovat po několik dalších buněčných cyklů a v mnoha případech se z dceřiných buněk zcela vytrácí. S vysokou frekvencí ale dochází k jeho začlenění zpět do hlavního jádra [9]. Buněčným dělením pak vznikají dceřiné buňky s různě přestavěným genomem.

Jiná hypotéza předpokládá, že existuje vztah mezi chromotripsí a zkracováním telomer, jelikož charakteristické přestavby často zasahují až do oblasti telomer [1]. V případě abraze telomer buňka spouští tzv. breakage-fusion-bridge cyklus, který se opakuje tak dlouho, dokud konce chromozomů nezískají novou telomeru, obvykle translokací z jiného chromozomu (schéma 3B) [10].

Další hypotézy považují za možné příčiny chromotripse exogenní vlivy poškozující DNA, jako je ionizující záření nebo volné radikály. V jejich důsledku totiž vznikají náhodné zlomy DNA, a tím se aktivují mnohé opravné mechanizmy [11]. Uvažuje se také, že chromotripse může být způsobena replikačním stresem, který vede k zastavení replikační vidlice a vzniku dvouvláknových zlomů DNA [12].

Zajímavý pohled přináší myšlenka, že by některé buňky mohly být schopny unikat apoptóze (programované buněčné smrti) i v případech poškození DNA, např. při nedostatku kyslíku. Místo toho, aby podstoupily apoptózu, by takové buňky byly opraveny reparačními mechanizmy za vzniku chyb, což by mohlo mít za následek vznik chromozomových přestaveb [13]. Mechanizmus úniku před buněčnou smrtí však zatím nebyl dostatečně prozkoumán.

Výskyt chromotripse u nádorů

Chromotripse bývá asociována s mnoha typy nádorů. Vzhledem k pozorovaným rysům by se dala považovat za spouštěč nebo jeden z prvních zásahů při nádorové transformaci. Jsou známy případy, kdy byla chromotripse prokázána prakticky ve všech buňkách jednoho nádoru, což by odpovídalo teorii, že chromotripse vzniká v relativně brzkém stadiu onemocnění [1,5]. Zároveň ovšem existují ojedinělé případy, kdy byla chromotripse po léčbě reverzibilní, což by znamenalo, že se nepodílela na rozvoji nádoru, ani na jeho následném relapsu [14]. Výsledky jiných studií naopak ukazují, že se chromotripse vyskytuje v počátku onemocnění subklonálně a může docházet k její pozdější expanzi, např. až v relapsu [15]. V těchto případech by chromotripse byla důsledkem klonální evoluce.

Co se týče výskytu chromotripse u jednotlivých typů nádorů, rozdílné malignity vykazují odlišnou četnost [16]. Chromotripse byla popsána u melanomů, sarkomů, gliomů i hematoonkologických onemocnění. Podle dostupných analýz se její výskyt u všech typů nádorových onemocnění pohybuje mezi 2–3 % [1], skutečná incidence však bude pravděpodobně mnohem vyšší, než se původně předpokládalo, a to především u agresivnějších typů nádorů. Dostupné údaje o frekvenci výskytu chromotripse u jednotlivých onkologických diagnóz jsou uvedeny v tab. 1. Ne vždy jsou uvedené četnosti přesné, jelikož jednotlivé studie používají odlišné detekční metody. Stejně tak definice a analyzované soubory pacientů nejsou vždy reprezentativní. Velkým nedostatkem je obvykle malý vzorek testovaných pacientů.

Genetické změny asociované s chromotripsí

Mezi patologické změny, které mohou být příčinou nebo doprovodným jevem chromotripse, patří mimo jiné inaktivace nádorových supresorů. K potlačení jejich funkce obvykle dochází prostřednictvím delece. Nejčastěji mutovaným nádorovým supresorem spojovaným s chromotripsí je gen TP53, popsány však byly také mutace genů jako ATM, PTEN, BRCA1, BRCA2, APC a SMAD4 [5,17,18].

Chromotripse je také spojena s amplifikací typických onkogenů, jako je např. CCND1, CDK4, MDM2, SETDB1, ERBB3, ERBB2, MYC a MYCN [17,19,20]. K jejich amplifikaci často dochází prostřednictvím double-minute chromozomů. Zajímavé poznatky přinesla studie z roku 2018 hodnotící vliv dávky mutantního genu KRAS na biologii a fenotypové projevy duktálního adenokarcinomu pankreatu [21]. KRAS patří mezi protoonkogeny rodiny RAS, které jsou prostřednictvím mutací a genových duplikací aktivovány přibližně u 30 % nádorů. V uvedené studii byla pozorována synergie mezi zvýšenou genovou dávkou mutantního KRAS a inaktivací genů TP53, CDKN2A a TGFβ. Kombinace těchto abnormalit byla asociována se vznikem chromotripse a velmi agresivním fenotypem duktálního karcinomu.

U všech typů nádorů platí, že s vyšší četností mutací TP53 stoupá i pravděpodobnost výskytu chromotripse [22]. Gen TP53 se účastní regulace mnoha procesů a hraje významnou roli v zajištění stability genomu. Mutace genu TP53 mohou mít různé následky, mezi něž patří potlačení funkce reparačních mechanizmů reagujících na poškození DNA, deregulace kontroly průchodu buněčným cyklem či narušení údržby telomer. Všechny tyto události mohou přispívat ke vzniku chromotripse. S vysokou frekvencí je chromotripse pozorována u pacientů s vrozenými mutacemi genu TP53, jako jsou např. pacienti s Li-Fraumeniho syndromem [5]. Tito pacienti mají predispozice ke vzniku rekurentních nádorů, mimo jiné se u nich tvoří meduloblastomy. V případě meduloblastomů s aktivovanou Sonic-Hedgehog signalizací (tzv. SHH-meduloblastomů) byla chromotripse pozorována ve 100 % případů. Výskyt chromotripse byl však prokázán i u pacientů se somatickými mutacemi genu TP53, které vznikly v průběhu života, a to např. u akutní myeloidní leukemie [5,23].

Kromě inaktivace nádorových supresorů a aktivace onkogenů může v důsledku chromotripse také docházet k fúzi genů či jejich částí prostřednictvím translokací. Díky tomu vznikají fúzní transkripty, které buď nejsou přepisovány do proteinů, nebo naopak kódují proteiny s novými funkcemi.

Chromotripse a klinický průběh onemocnění

Mnohé studie potvrdily, že existuje spojitost mezi výskytem chromotripse a špatným průběhem onemocnění [1,5,24]. Přítomnost chromozomálních abnormalit, jako jsou hyperdiploidie nebo přestavby chromozomů, má význam pro stanovení prognózy. Při chromotripsi se takové abnormality nehromadí v nádorových buňkách postupně a náhodně v celém genomu, ale vznikají všechny současně za ovlivnění funkce mnoha genů, které často hrají roli v regulaci buněčného cyklu či dysfunkci telomer [23]. To vysvětluje, proč mají buňky poškozené chromotripsí obvykle agresivnější fenotyp [21]. Vzhledem k tomu, že tak rozsáhlé poškození nevede k zániku postižených buněk, lze předpokládat, že vzniklé defekty poskytují buňkám selekční výhodu a umožňují další proliferaci nádorového klonu.

S nepříznivou prognózou pacientů úzce souvisí i rezistence k protinádorové terapii, neboť některé geny ovlivněné chromotripsí mohou být spojeny s rezistencí na konkrétní druhy léčiv [25]. Byly rovněž pozorovány rozdíly mezi jednotlivými subtypy onemocnění, např. u pacientů s karcinomem prsu chromotripse zhoršuje prognózu pouze v případě subtypů s exprimovaným estrogenovým receptorem nebo triple negativních subtypů [26]. Jak již také bylo zmíněno, k chromotripsi může docházet až po léčbě. Takto byla pozorována rezistence na terapii v důsledku pozdější selekce chromotripse u pacientů s mnohočetným myelomem [27].

Význam chromotripse v klinické praxi

Ačkoli je nutné provést rozsáhlejší studie, dostupná data poukazují na skutečnost, že chromotripse je markerem nepříznivého průběhu nádorových onemocnění. Proto by mohla její detekce přispět ke stanovení prognózy, stagingu pacientů či volbě individuální cílené terapie. Například pacienti s glioblastomy s chromotripsí by mohli profitovat z léčby cílené na receptory epidermálních růstových faktorů a jiné tyrozinkinázové receptory, které bývají v důsledku chromotripse amplifikovány [28]. Dalším příkladem je léčba cílená na protoonkogen PIM1 u pacientů s akutní myeloidní leukemií, který má funkci serin/treoninové kinázy a podílí se na buněčné proliferaci a u akutní myeloidní leukemie je nejčastěji deregulovaným genem v důsledku chromotripse [23].

Kromě toho bylo zjištěno, že v důsledku přestaveb způsobených chromotripsí mohou vznikat potenciální neoantigeny, které vážou molekuly hlavního histokompatibilního komplexu a umožňují expanzi T buněčných klonů [29]. Na základě těchto poznatků je možné vyvíjet nové imunoterapeutické postupy a lépe vyhodnotit, kterým pacientům imunoterapii indikovat.

Některé studie také navrhují, že by exprese fúzních genů vzniklých v důsledku chromotripse mohla napomoci zvýšení citlivosti buněk na určité druhy léčiv [30]. Jako příklad lze uvést fúzní transkript ETV6-PDGFRB identifikovaný u pacienta s myelodysplastickým syndromem [31]. Podobné fúzní varianty vzniklé následkem chromotripse by mohly posloužit jako potenciální terapeutický cíl – např. konkrétně přestavby genu PDGFRB jsou dle klasifikace Světové zdravotnické organizace charakteristickým znakem subtypu myeloidních neoplazií, které jsou senzitivní vůči tyrozikinázovým inhibitorům.

Dalo by se využít i poznatku, že nádorové buňky s chromotripsí obvykle mívají poškozený mitotický aparát a narušenou funkci systému odpovědi buňky na poškození DNA (DNA damage response – DDR). Systém DDR zahrnuje signalizační a opravné procesy, které vedou k zastavení buněčného cyklu a opravě poškozené DNA. V případě, že je poškození tak rozsáhlé, že není možná oprava, buňka spouští apoptózu. DDR tedy působí jako protinádorová bariéra, zatímco mutace v genech, které se účastní DDR, se podílejí na progresi nádoru. Jelikož se může více opravných mechanizmů překrývat a navzájem zastupovat, nabízí se cílit léčbu na ty mechanizmy, na nichž je buňka s určitým poškozením DDR závislá. Jako příklad lze uvést glioblastomy, u nichž dochází k posílení funkce DDR [32]. Tyto nádory jsou rezistentní vůči konvenční terapii a je vhodné zvolit léčbu pomocí inhibitorů cílených na jednotlivé faktory DDR. Vhodnými cílovými molekulami mohou být např. serin/threoninové kinázy Chk1 a Chk2, které se významně podílejí na zajištění opravy poškozené DNA.

Ve velmi výjimečných případech může chromotripse vést také k vyléčení závažné choroby, jak tomu bylo v kazuistice zaznamenané v roce 2015 [33]. Pacient trpěl imunodeficiencí způsobenou vrozenou hyperaktivitou chemokinového receptoru CXCR4. Prostřednictvím chromotripse v hematopoetické kmenové buňce u něj došlo k deleci abnormální kopie genu kódujícího tento receptor, čímž byla obnovena normální funkce jeho imunitního systému.

Závěr

Od popsání chromotripse v roce 2011 bylo provedeno a publikováno mnoho navazujících studií tohoto zajímavého jevu. Kromě snahy objasnit mechanizmy vzniku chromotripse a její důsledky v patofyziologii buňky se do středu zájmu dostalo i potenciální uplatnění získaných poznatků v klinické oblasti. Aby to však bylo možné, bude potřeba provést prospektivní analýzu asociace mezi výskytem chromotripse a průběhem onemocnění. Pro využití v oblasti cílené nádorové terapie bude také nutné definovat diagnostická doporučení pro její vyšetřování u jednotlivých diagnóz.

Podpořeno z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. 15-31834A.

Veškerá práva podle předpisů na ochranu duševního vlastnictví jsou vyhrazena.

 Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Karla Plevová, Ph.D.

Centrum molekulární biologie a genové terapie Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno

Černopolní 9 625 00 Brno

e-mail: plevova.karla@fnbrno.cz

prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D.

Centrum molekulární biologie a genové terapie Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno

Černopolní 9 625 00 Brno

e-mail: pospisilova.sarka@fnbrno.cz

Obdrženo: 31. 12. 2018

Přijato: 19. 3. 2019